Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Дифференцировка стволовых клеток в островковые клетки представляет собой альтернативное решение по сравнению с традиционным лечением диабета и моделированием заболевания. Мы описываем подробный протокол культивирования стволовых клеток, который сочетает в себе коммерческий набор для дифференцировки с ранее проверенным методом, помогающим в производстве инсулинсекретирующих островков, полученных из стволовых клеток, в чашке.

Аннотация

Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) в инсулинсекретирующие бета-клетки дает материал для изучения функции бета-клеток и лечения диабета. Тем не менее, остаются проблемы с получением бета-клеток, полученных из стволовых клеток, которые адекватно имитируют нативные бета-клетки человека. Основываясь на предыдущих исследованиях, островковые клетки, полученные из чПСК, были созданы для создания протокола с улучшенными результатами дифференцировки и согласованностью. Протокол, описанный здесь, использует набор предшественников поджелудочной железы на стадиях 1-4, а затем протокол, модифицированный на основе статьи, ранее опубликованной в 2014 году (далее именуемый «R-протокол») на стадиях 5-7. Включены подробные процедуры использования набора панкреатического предшественника и микролуночных планшетов диаметром 400 мкм для создания кластеров-предшественников поджелудочной железы, R-протокол для эндокринной дифференцировки в формате статической суспензии 96 лунок, а также характеристика in vitro и функциональная оценка островков, полученных из чПСК. Полный протокол занимает 1 неделю для первоначальной экспансии hPSC, а затем ~5 недель для получения инсулин-продуцирующих островков hPSC. Персонал, владеющий базовыми методами культивирования стволовых клеток и обученный биологическим анализам, может воспроизвести этот протокол.

Введение

Бета-клетки поджелудочной железы секретируют инсулин в ответ на повышение уровня глюкозы в крови. Пациентов, у которых отсутствует достаточная выработка инсулина из-за аутоиммунного разрушения бета-клеток при диабете 1 типа (СД1)1 или из-за дисфункции бета-клеток при диабете 2 типа (СД2)2, обычно лечат введением экзогенного инсулина. Несмотря на эту жизненно важную терапию, она не может в точности сравниться с точным контролем уровня глюкозы в крови, который достигается за счет динамической секреции инсулина из настоящих бета-клеток. Таким образом, пациенты часто страдают от последствий опасных для жизни эпизодов гипогли....

протокол

Этот протокол основан на работе с линиями hPSC, включая H1, HUES4 PDXeG и Mel1 INSGFP/W, в безфидерных условиях. Пошаговая процедура подробно описана в этом разделе, а подтверждающие данные дифференциации Mel1 INSGFP/W приведены в разделе репрезентативных результатов. Мы рекомендуем провести дальнейшую оптимизацию при работе с другими линиями hPSC, которые здесь не указаны. Смотрите таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми реагентами и растворами, используемыми в этом протоколе.

1. Приготовление дифференциальных сред и растворов

Результаты

Мы разработали гибридную стратегию дифференцировки стволовых клеток в инсулин-секретирующие hPSC-островки в семь этапов, которая использует набор предшественников поджелудочной железы для первых четырех стадий планарной культуры, за которой следует модифицированный протокол, постро?.......

Обсуждение

В этой статье описывается семиступенчатый гибридный протокол, который позволяет генерировать островки hPSC, способные секретировать инсулин при глюкозном исследовании в течение 40 дней культивирования in vitro. Считается, что среди этих многочисленных этапов эффективная индукция око?.......

Раскрытие информации

Тимоти Киффер (Timothy J. Kieffer) был сотрудником ViaCyte во время подготовки этой рукописи. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы выражаем признательность за поддержку со стороны компаний STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF и Канадского института исследований в области здравоохранения. Цзя Чжао (Jia Zhao) и Шэнхуэй Лян (Shenghui Liang) являются лауреатами премии Майкла Смита Health Research BC Trainee Award. Митчелл Дж.С. Браам (Mitchell J.S. Braam) является стипендиатом Mitacs Accelerate Fellowship. Диепирие Г. Иворима является лауреатом стипендии Александра Грэма Белла для выпускников Канады и памятной премии Политехнической школы CFUW 1989 года. Мы искренне благодарим д-ра Эдуарда Г. Стэнли (Edouard G. Stanley) из MCRI и Университета Монаша за с....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3)SigmaT6397Thyroid hormone
4% PFA solutionSanta Cruz Biotechnologysc-281692Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottomCorning Costar (VWR)CLS3474Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
AccutaseSTEMCELL Technologies07920Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 platesSTEMCELL Technologies34415400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 platesSTEMCELL Technologies34815800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG)R&D SystemsIC2400G1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype ControlR&D SystemsIC108G1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)BD Sciences5660321:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype ControlR&D SystemsIC0041G1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ)BD Pharmingen5658311:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ)BD Sciences5656891:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ)BD Sciences5633381:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ)BD Sciences5625941:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype ControlBD Sciences5577141:50 in flow cytometry
ALK5i IICayman Chemicals14794TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies7010Microwell Rinsing Solution
Assay chamberCellvisD35-10-1-NFor static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA)Thermo Fisher ScientificBP1600-100For immunostaining procedure
CK19 antibodyDAKOM08881:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucoseSigmaG8769Medium supplement
DAPISigmaD9542For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555Life technologiesA214321:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647Life technologiesA214471:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555Life technologiesA315701:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647Life technologiesA315711:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555Life technologiesA315721:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647Life technologiesA315731:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647Life technologiesA214481:500 in whole mount immunofluorescence
DPBSSigmaD8537Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, humanAlpco80-INSHU-E01.1For human insulin measurement
Fatty acid-free BSAProliant68700Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution KitBD Sciences554714Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation ReagentSTEMCELL Technologies7174For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibodySigmaG26541:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibodyThermo Fisher ScientificPA1-377821:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x)Gibco35050061L-glutamine supplement
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4For tissue clearing and mounting
GSi XXSigma Millipore565789Notch inhibitor
HeparinSigmaH3149Medium supplement
ITS-X (100x)Thermo Fisher Scientific51500056Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189 STEMCELL Technologies72147BMP antagonist
MAFA antibodyAbcamab264051:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualifiedThermo Fisher Scientific08-774-552Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 mediumLife technologies10372019Base medium
mTeSR1 Complete KitSTEMCELL Technologies85850stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine)SigmaA9165Antioxidant
NaHCO3SigmaS6297Medium supplement
NEUROD1 antibodyR&D SystemsAF27461:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibodyDSHBF55A12-c1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibodyR&D SystemsAF62971:200 in whole mount immunofluorescence
PBSSigmaD8662With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibodyAbcamab472671:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ)BD Sciences5658601:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k)BD Sciences5630231:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)BD Sciences5621611:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype ControlBD Sciences5546801:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)BD Sciences5645631:200 in flow cytometry
R428 Cayman Chemicals21523AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-transSigmaR2625Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10xSigma20-188For hormone extraction
SANT-1SigmaS4572SHH inhibitor
SLC18A1 antibodySigmaHPA0637971:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibodySigmaHPA0194721:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor KitSTEMCELL Technologies05120Basal media and supplements included
Synaptophysin antibodyNovusNB120-166591:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100SigmaX100For permeabilization
Trolox Sigma Millipore648471Vitamin E analog
TrypLE Enzyme ExpressLife technologies12604-021cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibodyR&D SystemsAF35861:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632STEMCELL Technologies72304ROCK inhibitor
Zinc sulfateSigmaZ0251Medium supplement

Ссылки

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

196R96in vitroHPSC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены