JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Дифференцировка стволовых клеток в островковые клетки представляет собой альтернативное решение по сравнению с традиционным лечением диабета и моделированием заболевания. Мы описываем подробный протокол культивирования стволовых клеток, который сочетает в себе коммерческий набор для дифференцировки с ранее проверенным методом, помогающим в производстве инсулинсекретирующих островков, полученных из стволовых клеток, в чашке.

Аннотация

Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) в инсулинсекретирующие бета-клетки дает материал для изучения функции бета-клеток и лечения диабета. Тем не менее, остаются проблемы с получением бета-клеток, полученных из стволовых клеток, которые адекватно имитируют нативные бета-клетки человека. Основываясь на предыдущих исследованиях, островковые клетки, полученные из чПСК, были созданы для создания протокола с улучшенными результатами дифференцировки и согласованностью. Протокол, описанный здесь, использует набор предшественников поджелудочной железы на стадиях 1-4, а затем протокол, модифицированный на основе статьи, ранее опубликованной в 2014 году (далее именуемый «R-протокол») на стадиях 5-7. Включены подробные процедуры использования набора панкреатического предшественника и микролуночных планшетов диаметром 400 мкм для создания кластеров-предшественников поджелудочной железы, R-протокол для эндокринной дифференцировки в формате статической суспензии 96 лунок, а также характеристика in vitro и функциональная оценка островков, полученных из чПСК. Полный протокол занимает 1 неделю для первоначальной экспансии hPSC, а затем ~5 недель для получения инсулин-продуцирующих островков hPSC. Персонал, владеющий базовыми методами культивирования стволовых клеток и обученный биологическим анализам, может воспроизвести этот протокол.

Введение

Бета-клетки поджелудочной железы секретируют инсулин в ответ на повышение уровня глюкозы в крови. Пациентов, у которых отсутствует достаточная выработка инсулина из-за аутоиммунного разрушения бета-клеток при диабете 1 типа (СД1)1 или из-за дисфункции бета-клеток при диабете 2 типа (СД2)2, обычно лечат введением экзогенного инсулина. Несмотря на эту жизненно важную терапию, она не может в точности сравниться с точным контролем уровня глюкозы в крови, который достигается за счет динамической секреции инсулина из настоящих бета-клеток. Таким образом, пациенты часто страдают от последствий опасных для жизни эпизодов гипогликемии и других осложнений, возникающих в результате хронических гипергликемических экскурсий. Трансплантация трупных островков человека успешно восстанавливает жесткий гликемический контроль у пациентов с СД1, но ограничена доступностью островковых доноров и трудностями в очистке здоровых островков для трансплантации 3,4. Эта проблема, в принципе, может быть решена путем использования ПСК в качестве альтернативного исходного материала.

Современные стратегии получения инсулинсекретирующих островков из ПСК in vitro часто направлены на имитацию процесса развития эмбриональной поджелудочной железы in vivo 5,6. Это требует знания ответственных сигнальных путей и своевременного добавления соответствующих растворимых факторов для имитации критических стадий развития эмбриональной поджелудочной железы. Программа поджелудочной железы начинается с вовлечения в дефинитивную энтодерму, которая отмечена транскрипционными факторами вилочной головки A2 (FOXA2) и определяющей пол областью Y-box 17 (SOX17)7. Последовательная дифференцировка дефинитивной энтодермы включает в себя формирование примитивной кишечной трубки, переходящей в заднюю переднюю кишку, которая экспрессирует гомеобокс поджелудочной и двенадцатиперстной кишки 1 (PDX1)7,8,9, и эпителиальную экспансию в предшественники поджелудочной железы, которые совместно экспрессируют гомеобокс PDX1 и гомеобокс 1 NK6 (NKX6.1)10,11.

Дальнейшая приверженность эндокринным островковым клеткам сопровождается транзиторной экспрессией главного проэндокринного регулятора нейрогенина-3 (NGN3)12 и стабильной индукцией ключевых транскрипционных факторов дифференцировки нейронов 1 (NEUROD1) и гомеобокса 2 NK2 (NKX2.2)13. Основные гормоноэкспрессирующие клетки, такие как инсулин-продуцирующие бета-клетки, глюкагон-продуцирующие альфа-клетки, соматостатин-продуцирующие дельта-клетки и полипептид-продуцирующие ППИ поджелудочной железы, впоследствии программируются. Благодаря этим знаниям, а также открытиям, сделанным в ходе обширных высокопроизводительных скрининговых исследований лекарственных средств, недавние достижения позволили создать hPSC-островки с клетками, напоминающими бета-клетки, способные секрецию инсулина 14,15,16,17,18,19.

Сообщалось о пошаговых протоколах генерации глюкозочувствительных бета-клеток 6,14,18,19. Основанный на этих исследованиях, настоящий протокол включает в себя использование набора панкреатических предшественников для получения клеток-предшественников поджелудочной железы PDX1+/NKX6.1+ в планарной культуре с последующей агрегацией микролуночных пластин в кластеры однородного размера и дальнейшей дифференцировкой в сторону инсулинсекретирующих hPSC-островков с помощью R-протокола в статической 3D-культуре суспензии. Контрольный анализ качества, включая проточную цитометрию, иммуноокрашивание и функциональную оценку, выполняется для точной характеристики дифференцирующих клеток. В данной работе подробно описан каждый этап направленной дифференциации и описаны подходы к характеризации in vitro.

протокол

Этот протокол основан на работе с линиями hPSC, включая H1, HUES4 PDXeG и Mel1 INSGFP/W, в безфидерных условиях. Пошаговая процедура подробно описана в этом разделе, а подтверждающие данные дифференциации Mel1 INSGFP/W приведены в разделе репрезентативных результатов. Мы рекомендуем провести дальнейшую оптимизацию при работе с другими линиями hPSC, которые здесь не указаны. Смотрите таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми реагентами и растворами, используемыми в этом протоколе.

1. Приготовление дифференциальных сред и растворов

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу 1 для всех готовых растворов и Таблицу 2 для дифференциации сред.

  1. Подготовьте все среды и реагенты для клеточной культуры в стерильном шкафу биобезопасности. Перед использованием кратковременно подогрейте растворы для клеточных культур и базальные среды до 37 °C в ванне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано ниже, ежедневно готовьте свежие дифференциальные среды, добавляя добавки, и используйте их в тот же день. В качестве альтернативы набор для прагенита поджелудочной железы дает возможность заранее подготовить больший объем, который можно использовать в течение нескольких дней в соответствии с протоколом производителя. Оба метода подготовки среды хорошо себя зарекомендовали. Обратите внимание, что не рекомендуется оставлять среду на длительное время на водяной бане. При ежедневном приготовлении свежих сред рекомендуется аликвотировать добавки, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания.

2. Дифференцировка ПСК в клетки-предшественники поджелудочной железы

  1. Поддерживайте недифференцированные ПСК на сосудах, покрытых Matrigel, в полной среде mTeSR1 и выполняйте ежедневную смену среды. Во время поддерживающего культивирования каждые 3-4 дня при достижении клеток ~70% слияния проводят с использованием реагента для диссоциации клеток в соответствии с протоколом производителя. Чтобы инициировать дифференцировку, диссоциируют клетки на отдельные клетки и высаживают их на 6-луночные или 12-луночные планшеты, обработанные культурой тканей (с объемом среды 2 мл или 1 мл на лунку соответственно).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 приведены инструкции по хранению базальной среды энтодермы и ее аликвот.
  2. Обработайте лунки для культивирования Matrigel (разбавленным в ледяном DMEM/F12 в соответствии с протоколом производителя) и поместите планшет в инкубатор с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 на 30 минут.
  3. Переместите пластину с покрытием Matrigel до комнатной температуры (используйте в течение 3 часов).
  4. Отработанную среду отсасывают из культуры ПСК и один раз промывают ДПБС. Диссоциировать культуру hPSC на отдельные клетки с помощью фермента клеточной диссоциации при 37 °C в течение 3-5 мин. Промойте клетки, добавив теплую среду DMEM/F12, перелейте в коническую пробирку объемом 15 мл или 50 мл и отжим при 300 × г в течение 5 минут.
  5. Ресуспендируйте клеточную гранулу с полной средой стволовых клеток плюс 10 мкМ Y-27632 и выполните подсчет живых клеток (трипановый синий отрицательный) с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Аспирировать разбавленный Матригель и немедленно высевать живые клетки с плотностью 1,60-1,80 × 10 5/см2 в лунки, покрытые Матригелем, и инкубировать в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C,5%СО2 в течение 24 ч. Переходите к этапу 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это приведет к ~95% начальному слиянию для инициирования дифференциации. Согласно протоколу производителя, рекомендуется плотность посева 2,6 × 105/см2 . Рекомендуется тестировать различную плотность посева, чтобы определить оптимальное значение для клеточной линии и проверить жизнеспособность клеток. Если жизнеспособность ниже 80%, не приступайте к дифференциации. Низкая жизнеспособность клеток может быть результатом переваривания или перетирания во время сбора урожая или оставления клеток на длительное время в среде DMEM/F12 перед посевом.
  6. На 1-м этапе 1-го дня кратковременно прогревают базальную среду энтодермы до 37 °С в ванне и размораживают добавки MR и CJ. Приготовьте среду стадии 1А, добавив добавку MR и CJ в базальную среду энтодермы. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  7. Отработанную среду отсасывают из лунок, добавляют среду Stage 1A и инкубируют в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы стирки не требуются. Удалите все неприкрепленные клетки из культуры, осторожно встряхнув культуральную планшет перед заменой среды. Избегайте разрушения монослоя, не касаясь наконечника пипетки ко дну лунки во время извлечения среды и путем мягкого добавления среды.
  8. На этапе 1 день 2 кратковременно прогрейте базальную среду энтодермы в ванне с температурой 37 °С и разморозьте добавку CJ. Приготовьте среду стадии 1B, добавив добавку CJ в базальную среду энтодермы. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  9. Отработанную среду отсасывают из лунок, добавляют среду Stage 1B и инкубируют в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.
  10. На этапе 1 день 3 повторите шаги 2.8-2.9. Переходите к этапу 2.
  11. На 1-й день 2-го этапа разогрейте базальную среду 2-4 стадии поджелудочной железы в ванне с температурой 37 °C и разморозьте добавки 2A и 2B. Приготовьте среду 2A, добавив добавки 2A и 2B в базальную среду 2-4 стадии поджелудочной железы. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  12. Отработанную среду отсасывают из лунок, добавляют среду Stage 2A и инкубируют в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.
  13. На 2-й день 2-го этапа разогрейте базальную среду 2-4 стадии поджелудочной железы в ванне с температурой 37 °C и разморозьте добавку 2B. Приготовьте среду для стадии 2B, добавив добавку 2B к базальной среде 2-4 стадии поджелудочной железы. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  14. Отработанную среду отсасывают из лунок, добавляют среду Stage 2B и инкубируют в инкубаторе с влажностью 37 °C, 5%CO2 в течение 24 ч.
  15. На этапе 2 день 3 повторите шаги 2.13-2.14. Переходите к этапу 3.
  16. На стадии 3 день 1 разогреть базальную среду поджелудочной железы 2-4 стадии в ванне с температурой 37 °C и разморозить Добавка 3. Приготовьте среду 3-й стадии, добавив добавку 3 в базальную среду 2-4 стадии поджелудочной железы. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  17. Отработанную среду отсасывают из лунок, добавляют среду Stage 3 и инкубируют в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 24 ч.
  18. На этапе 3 день 2 и день 3 повторите шаги 2.16-2.17. Переходите к этапу 4.
  19. На 4-й стадии 1-й день теплую базальную среду 2-4 стадии в ванне с температурой 37 °C и разморозить Дополнение 4. Приготовьте среду 4-й стадии, добавив добавку 4 в базальную среду 2-4 стадии поджелудочной железы. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  20. Отработанную среду отсасывают из лунок, добавляют среду Stage 4 и инкубируют в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 24 ч.
  21. На 4-м этапе со 2-го по 4-й день повторите шаги 2.19-2.20. Перейдите к шагам агрегирования.

3. Агрегация в кластеры-предшественники поджелудочной железы с использованием микролуночных планшетов диаметром 400 мкм

  1. На этапе 4 и на 5-й день предварительно обработайте микролунки (например, в формате 24-луночных планшетов) 500 мкл раствора для промывки против адгезии на лунку.
  2. Подготовьте балансировочную пластину и центрифугируйте микролуночный планшет при 1 300 × г в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте планшет под микроскопом, чтобы убедиться, что в микролунках не осталось пузырьков. Снова центрифугируйте еще 5 минут, если пузырьки остаются в каких-либо микролунках.
  3. Отсосите раствор для промывки против прилипания из лунок и промойте один раз 1 мл DPBS. Аспирируйте DPBS из лунок и добавляйте 1 мл агрегационной среды в каждую лунку.
  4. Отработанную среду удалить из культур-предшественников поджелудочной железы и однократно промыть ДПБС. Диссоциируют культуры на отдельные клетки с помощью диссоциационного реагента при 37 °C в течение 10-12 мин. Промойте клетки теплым DMEM/F12, переложите в пробирку и отжмите при 300 × г в течение 5 минут.
  5. Повторно суспендируйте гранулы клеток в среде агрегации и выполните подсчет клеток в реальном времени. Засейте 2,4-3,6 миллиона клеток на лунку (т.е. 2000-3000 клеток на микролунку) и добавьте среду агрегации в каждую лунку, чтобы получить окончательный объем 2 мл на лунку.
  6. Осторожно пропипетируйте клетки вверх и вниз несколько раз наконечником P1000, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток по всей лунке. Не вводите пузырьки в микролунки. Центрифугируйте планшет микролунок при 300 × г в течение 5 мин для захвата клеток в микролунках. Инкубируют планшет с микролунками в инкубаторе с влажностью 37 °C, 5%СО2 в течение 24 ч агрегации и приступают к стадиям дифференциации 5-7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не потревожить пластину во время агрегации. Для оптимального формирования заполнителя может потребоваться до 48 часов инкубационного времени.

4. Дифференцировка кластеров-предшественников поджелудочной железы, полученных от kit, в hPSC-островки

  1. На 5-й стадии 1-й день прогревают базальную среду 5-7 стадии в ванне с температурой 37 °С и размораживают добавки (см. табл. 1 и табл. 2). Приготовьте среду 5-й стадии, добавив добавки (к конечным рабочим концентрациям) в базальную среду 5-7 стадии. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  2. После образования агрегата осторожно пропипетируйте агрегаты вверх и вниз несколько раз наконечником пипетки P1000, чтобы всплыть все неагрегированные ячейки. Дайте заполнителям осесть под действием силы тяжести (подождите ~1 минуту). Осторожно удалите отработанную среду (содержащую плавающие неагрегированные ячейки) из скважины, насколько это возможно, избегая аспирационных заполнителей.
  3. Энергично распределите свежую среду Stage 5 на поверхность планшета микролунок, чтобы удалить заполнители из микролунок. Перекачка заполнителей в 6-луночные установки со сверхнизким навесным оборудованием (ULA). Промойте один раз средой Stage 5, чтобы полностью извлечь заполнители из микролунок.
  4. Соберите все заполнители в 6-луночной скважине ULA, повторно суспендируйте агрегаты в среде Стадии 5 и отрегулируйте плотность до 20 кластеров на 100 мкл (например, ожидается, что из каждой скважины будет извлечено ~ 1 200 кластеров). Ресуспендировать 1 200 кластеров в 6 мл среды Stage 5). С помощью многоканальной пипетки дозируйте 50 мкл среды Stage 5 в каждую лунку планшета с плоским дном на 96 лунок ULA. Заполните угловые и краевые лунки 200 мкл DPBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования крайних лунок для культивирования заполнителей, так как они склонны к большему испарению; В противном случае используйте 96-луночный планшет, который предназначен для минимизации испарения по краям (например, 96-луночные планшеты со встроенными рвами) или поместите культуральную планшет в инкубатор клеточных культур с высоким микроклиматом.
  5. Добавьте 100 мкл кластерной ресуспендирования в каждую лунку планшета с плоским дном 96 лунок ULA, в результате чего получится в общей сложности 150 мкл питательной среды, содержащей в среднем 20 кластеров на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно перемешивайте ресуспендию доильного аппарата каждый раз перед дозированием в 96 лунок.
  6. Поместите культуральные планшеты на ровную поверхность в инкубатор с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 на 24 часа.
  7. На Этапе 5 день 2 приготовьте среду Стадии 5, следуя шагу 4.1.
  8. Используйте многоканальную пипетку, чтобы удалить ~90 мкл отработанной среды из каждой лунки и обновить 100 мкл среды Stage 5.
  9. На этапе 5 день 3 повторите шаги 4.7-4.8. Переходите к этапу 6.
  10. На 1-й день 6-й стадии подогреть базальную среду 5-7 стадии в ванне с температурой 37 °С и разморозить добавки (см. табл. 1 и табл. 2). Приготовьте среду 6-й стадии, добавив добавки (до конечных рабочих концентраций) в базальную среду 5-7 стадии. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  11. Используйте многоканальную пипетку, чтобы удалить ~90 мкл отработанной среды и обновить 100 мкл среды Stage 6 на лунку.
  12. На этапе 6, со 2-го по 8-й день, повторите шаги 4.10-4.11. Переходите к этапу 7.
  13. На 7-й стадии 1-й день прогрейте базальную среду 5-7 стадии в ванне с температурой 37 °С и оттайте добавки (см. табл. 1 и табл. 2). Приготовьте среду 7-й стадии, добавив добавки (к конечным рабочим концентрациям) в базальную среду 5-7 стадии. Хорошо перемешайте и сразу же используйте.
  14. Используйте многоканальную пипетку, чтобы удалить ~90 мкл отработанной среды и обновить 100 мкл среды Stage 7 на лунку.
  15. На этапе 7, со 2-го по 12-й день, повторите шаги 4.13-4.14. Приступают к характеризации in vitro .

5. Проточный цитометрический анализ

  1. Удалите питательную среду и промойте один раз DPBS. Диссоциируют культуры (планарные клетки-предшественники или дифференцирующиеся кластеры) на отдельные клетки с помощью диссоциационного реагента путем инкубации при 37 °C в течение 10-12 мин. Смойте буфером FACS и отжим при 300 × г в течение 5 минут.
  2. Ресуспендируйте гранулу клетки в буфере FACS и выполните подсчет клеток. Отжим клетки при 300 × г в течение 5 мин. Ресуспендировать отдельные клетки в 500 мкл буфера Fix/Perm в течение 10 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием доведите буфер Fix/Perm до комнатной температуры. Буфер Fix/Perm содержит параформальдегид (PFA). Осторожно обращайтесь с PFA в вытяжном шкафу и утилизируйте в соответствии с рекомендациями учреждения.
  3. Отжим при 500 × г в течение 3 мин, дважды промыть 500 мкл 1 буфера для химической завивки/промывки и ресуспендировать в 300 мкл 1 буфера для химической завивки/стирки. Переложите 100 мкл одноклеточной ресуспензии (каждая из которых содержит 2,5-3 × 105 клеток) в три пробирки для контроля неокрашенности, контроля изотипа и окрашивания антителами (см. Таблицу материалов для получения информации об образцах антител и разведении). Выдерживать 45 мин при комнатной температуре и накрыть фольгой.
  4. Отжим при 500 × г в течение 3 мин. Промойте два раза с 500 мкл 1x буфера для химической завивки/стирки. Ресуспендируйте образцы в 100 мкл буфера FACS и проанализируйте окрашенные клетки (см. Таблицу материалов для внутриклеточного окрашивания маркеров на определенных стадиях) с помощью проточного цитометра и программного обеспечения (например, FlowJo).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы не анализируются немедленно, храните их при температуре 4°C в защищенном от света месте. Для стратегии стробирования данные потока сначала стробируются по свойствам рассеяния (FSC-A и SSC-A) для удаления мелкого клеточного мусора, а затем по свойствам FSC-A и FSC-ширины для идентификации синглетов. Положительное и отрицательное стробирование определяется контролем стволовых клеток и/или неокрашенными изотипами.

6. Иммунное окрашивание по всему креплению

  1. Соберите грозди в пробирку для микрофуги. Заселяют кластеры под действием силы тяжести. Отработанную среду аспирировать и один раз промыть 1 мл PBS (с кальцием и магнием). Зафиксируйте кластеры 1 мл 4% PFA при температуре 4°C на ночь.
  2. Однократно промыть PBST и пермеабилизировать 20-30 кластеров 500 мкл 0,3% TritonX-100 в пробирке для микрофуги при температуре окружающей среды в течение не менее 6 ч на наклонном шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для больших кластеров требуется более длительное время пермеабилизации (до 24 ч).
  3. Кластеры инкубируют в 100 мкл блокирующего буфера при температуре окружающей среды в течение 1 ч на наклонном шейкере. Удалите блокирующий буфер и инкубируйте кластеры со 100 мкл первичных антител, разведенных в буфере для разведения антител при температуре окружающей среды, в течение ночи на наклонном шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если фон сильный во время визуализации, инкубируйте с первичными антителами при 4 °C.
  4. Тщательно промыть 3 x 30 минут с 500 мкл PBST на наклонном шейкере (угол наклона установлен на 8, скорость установлена на 20).
  5. Инкубируют кластеры со 100 мкл вторичных антител в буфере для разведения антител при температуре окружающей среды в течение ночи на наклонном шейкере. Накройте трубочки фольгой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если фон во время визуализации сильный, инкубируйте со вторичными антителами при 4 °C.
  6. Промойте один раз 500 мкл PBST. Добавить 100 мкл раствора 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (10 мкг/мл в PBST) и окрашивать при температуре окружающей среды в течение 10-15 мин. Накройте пленкой и берегите от света.
  7. Тщательно промывайте 3 x 30 минут 500 мкл PBST на наклонном шейкере. Накройте тюбики фольгой на этапе мойки.
  8. Кластеры прикрепляют к предметным стеклам камеры визуализации (см. таблицу материалов), предварительно покрытым тканевым клеем в соответствии с протоколом производителя и опубликованными протоколами20,21.
  9. Закрепить средством для очистки тканей (80% глицерин в растворе PBS) и накрыть стеклянными покровными стеклами. Беречь от света до получения конфокальной визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы не визуализируются сразу, храните их при температуре 4 °C в защищенном от света месте.

7. Статический анализ ГСИС

  1. Теплый буфер бикарбоната Kreb's Ringer (3,3 г KRB) с низким содержанием глюкозы, буфер KRB с высоким содержанием глюкозы (16,7 г) и буфер KCl KRB 30 мМ в ванне с температурой 37 °C.
  2. Вручную выберите кластеры подходящего размера и промойте 2 мл теплого буфера KRB 3,3 г. Переложите кластеры в 6-луночный планшет, не обработанный тканевой культурой, и уравновешивают в 2 мл теплого буфера 3,3G KRB в течение 1 ч в инкубаторе с влажностью 37 °C, 5% CO2 .
  3. После уравновешивания заполните пробирную камеру (см. Таблицу материалов) 100 мкл теплого буфера KRB 3,3G. Вручную соберите пять гроздей и перенесите их в центр пробирной камеры. Инкубируют в течение 30 мин в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники для дозаторов объемом 10 мкл для переноса кластеров с минимальным объемом среды.
  4. Осторожно соберите ~100 мкл надосадочной жидкости и храните ее при -30 °C до измерения базальной секреции инсулина (см. шаг 7.9). Не сушите и не теряйте грозди на этом этапе. Немедленно добавьте 100 мкл теплого буфера KRB 16,7G в пробирную камеру и инкубируйте те же кластеры в течение 30 мин в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C, 5%CO2 .
  5. Осторожно соберите ~100 мкл надосадочной жидкости и храните ее при -30 °C до измерения стимулированной глюкозой секреции инсулина (см. шаг 7.9). Немедленно добавьте 100 мкл теплого 30 мМ буфера KCl KRB в пробирную камеру и инкубируйте те же кластеры в течение 30 мин в инкубаторе с увлажненной температурой 37 °C и 5% CO2 .
  6. Осторожно соберите ~100 мкл надосадочной жидкости и храните при -30 °C до измерения секреции инсулина, стимулированного KCl (см. шаг 7.9). Немедленно добавьте 100 мкл лизисного буфера RIPA в пробирную камеру и перенесите лизисный буфер, содержащий все пять кластеров, в пробирку для микрофуги.
  7. Опционально) Разбейте доильные аппараты вручную путем энергичного растирания наконечником дозатора P200. Вихрь в течение 30 с и инкубация на льду в течение 30 мин, после чего еще 30 с вихрем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте полный лизис с помощью вихря и достаточное время инкубации на льду.
  8. Отжим при 8 000 × г в течение 1 мин. Соберите надосадочную жидкость и храните при температуре -30 °C до измерения общего содержания инсулина (см. шаг 7.9).
  9. Измеряют инсулин человека в образцах надосадочной жидкости с помощью набора для ИФА инсулина человека в соответствии с протоколом производителя и опубликованными протоколами20,22.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторного замораживания и размораживания образцов надосадочной жидкости. Образцы с более чем тремя циклами замораживания и оттаивания не должны подвергаться анализу.

Результаты

Мы разработали гибридную стратегию дифференцировки стволовых клеток в инсулин-секретирующие hPSC-островки в семь этапов, которая использует набор предшественников поджелудочной железы для первых четырех стадий планарной культуры, за которой следует модифицированный протокол, постро?...

Обсуждение

В этой статье описывается семиступенчатый гибридный протокол, который позволяет генерировать островки hPSC, способные секретировать инсулин при глюкозном исследовании в течение 40 дней культивирования in vitro. Считается, что среди этих многочисленных этапов эффективная индукция око?...

Раскрытие информации

Тимоти Киффер (Timothy J. Kieffer) был сотрудником ViaCyte во время подготовки этой рукописи. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы выражаем признательность за поддержку со стороны компаний STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF и Канадского института исследований в области здравоохранения. Цзя Чжао (Jia Zhao) и Шэнхуэй Лян (Shenghui Liang) являются лауреатами премии Майкла Смита Health Research BC Trainee Award. Митчелл Дж.С. Браам (Mitchell J.S. Braam) является стипендиатом Mitacs Accelerate Fellowship. Диепирие Г. Иворима является лауреатом стипендии Александра Грэма Белла для выпускников Канады и памятной премии Политехнической школы CFUW 1989 года. Мы искренне благодарим д-ра Эдуарда Г. Стэнли (Edouard G. Stanley) из MCRI и Университета Монаша за совместное использование линии Mel1 INS GFP/W, а также Институт диабета Альберты (Alberta Diabetes Institute Islet Core) за изоляцию и распространение островков человека. Мы также выражаем признательность за поддержку со стороны Института наук о жизни (Life Sciences Institute Imaging and Flow Cytometry) при Университете Британской Колумбии. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3)SigmaT6397Thyroid hormone
4% PFA solutionSanta Cruz Biotechnologysc-281692Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottomCorning Costar (VWR)CLS3474Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
AccutaseSTEMCELL Technologies07920Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 platesSTEMCELL Technologies34415400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 platesSTEMCELL Technologies34815800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG)R&D SystemsIC2400G1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype ControlR&D SystemsIC108G1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)BD Sciences5660321:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype ControlR&D SystemsIC0041G1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ)BD Pharmingen5658311:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ)BD Sciences5656891:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ)BD Sciences5633381:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ)BD Sciences5625941:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype ControlBD Sciences5577141:50 in flow cytometry
ALK5i IICayman Chemicals14794TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution STEMCELL Technologies7010Microwell Rinsing Solution
Assay chamberCellvisD35-10-1-NFor static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA)Thermo Fisher ScientificBP1600-100For immunostaining procedure
CK19 antibodyDAKOM08881:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucoseSigmaG8769Medium supplement
DAPISigmaD9542For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555Life technologiesA214321:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647Life technologiesA214471:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555Life technologiesA315701:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647Life technologiesA315711:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555Life technologiesA315721:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647Life technologiesA315731:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647Life technologiesA214481:500 in whole mount immunofluorescence
DPBSSigmaD8537Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, humanAlpco80-INSHU-E01.1For human insulin measurement
Fatty acid-free BSAProliant68700Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution KitBD Sciences554714Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation ReagentSTEMCELL Technologies7174For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibodySigmaG26541:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibodyThermo Fisher ScientificPA1-377821:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x)Gibco35050061L-glutamine supplement
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4For tissue clearing and mounting
GSi XXSigma Millipore565789Notch inhibitor
HeparinSigmaH3149Medium supplement
ITS-X (100x)Thermo Fisher Scientific51500056Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189 STEMCELL Technologies72147BMP antagonist
MAFA antibodyAbcamab264051:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualifiedThermo Fisher Scientific08-774-552Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 mediumLife technologies10372019Base medium
mTeSR1 Complete KitSTEMCELL Technologies85850stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine)SigmaA9165Antioxidant
NaHCO3SigmaS6297Medium supplement
NEUROD1 antibodyR&D SystemsAF27461:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibodyDSHBF55A12-c1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibodyR&D SystemsAF62971:200 in whole mount immunofluorescence
PBSSigmaD8662With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibodyAbcamab472671:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ)BD Sciences5658601:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k)BD Sciences5630231:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)BD Sciences5621611:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype ControlBD Sciences5546801:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)BD Sciences5645631:200 in flow cytometry
R428 Cayman Chemicals21523AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-transSigmaR2625Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10xSigma20-188For hormone extraction
SANT-1SigmaS4572SHH inhibitor
SLC18A1 antibodySigmaHPA0637971:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibodySigmaHPA0194721:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor KitSTEMCELL Technologies05120Basal media and supplements included
Synaptophysin antibodyNovusNB120-166591:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100SigmaX100For permeabilization
Trolox Sigma Millipore648471Vitamin E analog
TrypLE Enzyme ExpressLife technologies12604-021cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibodyR&D SystemsAF35861:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632STEMCELL Technologies72304ROCK inhibitor
Zinc sulfateSigmaZ0251Medium supplement

Ссылки

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
  5. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  6. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  7. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  8. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  9. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  10. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  11. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  12. Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
  13. Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278 (2013).
  14. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  15. Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
  16. Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
  17. Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
  18. Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
  19. Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046 (2023).
  20. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540 (2019).
  21. Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245 (2021).
  22. Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
  23. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  24. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  25. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  26. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  27. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  28. Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
  29. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190 (2020).
  30. Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
  31. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  32. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

196R96in vitroHPSC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены