Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu insulinproduzierenden Inselclustern

Zusammenfassung

Die Differenzierung von Stammzellen in Inselzellen bietet eine alternative Lösung zur herkömmlichen Diabetesbehandlung und Krankheitsmodellierung. Wir beschreiben ein detailliertes Stammzellkulturprotokoll, das ein kommerzielles Differenzierungskit mit einer zuvor validierten Methode kombiniert, um die Herstellung von Insulin sezernierenden, aus Stammzellen gewonnenen Inseln in einer Schale zu unterstützen.

Zusammenfassung

Die Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) in insulinsezernierende Betazellen liefert Material für die Untersuchung der Betazellfunktion und der Diabetesbehandlung. Es besteht jedoch nach wie vor eine Herausforderung bei der Gewinnung von aus Stammzellen gewonnenen Betazellen, die native menschliche Betazellen adäquat nachahmen. Aufbauend auf früheren Studien wurden hPSC-abgeleitete Inselzellen generiert, um ein Protokoll mit verbesserten Differenzierungsergebnissen und Konsistenz zu erstellen. Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein Pankreas-Vorläufer-Kit in den Phasen 1-4, gefolgt von einem Protokoll, das aus einer zuvor 2014 veröffentlichten Arbeit (im Folgenden als "R-Protokoll" bezeichnet) während der Phasen 5-7 modifiziert wurde. Detaillierte Verfahren für die Verwendung des Pankreas-Vorläufer-Kits und der Mikrotiterplatten mit einem Durchmesser von 400 μm zur Erzeugung von Pankreas-Vorläuferclustern, das R-Protokoll für die endokrine Differenzierung in einem statischen 96-Well-Suspensionsformat sowie die In-vitro-Charakterisierung und funktionelle Bewertung von hPSC-abgeleiteten Inseln sind enthalten. Das vollständige Protokoll dauert 1 Woche für die anfängliche hPSC-Expansion, gefolgt von ~5 Wochen, um insulinproduzierende hPSC-Inseln zu erhalten. Personal mit grundlegenden Stammzellkulturtechniken und Ausbildung in biologischen Assays kann dieses Protokoll reproduzieren.

Einleitung

Betazellen der Bauchspeicheldrüse schütten Insulin aus, das auf einen Anstieg des Blutzuckerspiegels reagiert. Patienten, die aufgrund der autoimmunen Zerstörung von Betazellen bei Typ-1-Diabetes (T1D)¹ oder aufgrund einer Betazelldysfunktion bei Typ-2-Diabetes (T2D)² keine ausreichende Insulinproduktion aufweisen, werden in der Regel mit der Gabe von exogenem Insulin behandelt. Trotz dieser lebensrettenden Therapie kann sie nicht genau mit der exquisiten Kontrolle des Blutzuckers mithalten, wie sie durch die dynamische Insulinsekretion aus echten Betazellen erreicht wird. Daher leiden die Patienten häufig unter den Folgen lebensbedrohlicher hypoglykämischer Episoden und anderer Komplikationen, die aus chronischen hyperglykämischen Exkursionen resultieren. Die Transplantation menschlicher Leicheninseln stellt bei T1D-Patienten erfolgreich eine strenge glykämische Kontrolle wieder her, ist jedoch durch die Verfügbarkeit von Inselspendern und Schwierigkeiten bei der Reinigung gesunder Inseln für die Transplantation eingeschränkt ^3,4. Diese Herausforderung kann prinzipiell durch den Einsatz von hPS-Zellen als alternatives Ausgangsmaterial gelöst werden.

Derzeitige Strategien zur Generierung von Insulin-sezernierenden Inseln aus hPS-Zellen in vitro zielen häufig darauf ab, den Prozess der embryonalen Entwicklung der Bauchspeicheldrüse in vivo nachzuahmen ^5,6. Dies erfordert die Kenntnis der verantwortlichen Signalwege und die zeitgesteuerte Zugabe entsprechender löslicher Faktoren, um kritische Stadien der sich entwickelnden embryonalen Bauchspeicheldrüse nachzuahmen. Das Pankreasprogramm beginnt mit der Bindung in das definitive Endoderm, das durch die Transkriptionsfaktoren Gabelkopfbox A2 (FOXA2) und geschlechtsbestimmende Region Y-Box 17 (SOX17)⁷ gekennzeichnet ist. Die sukzessive Differenzierung des definitiven Endoderms beinhaltet die Bildung eines primitiven Darmschlauchs, der in einen hinteren Vorderdarm übergeht, der die Pankreas- und Zwölffingerdarm-Homöobox 1 (PDX1)^7,8,9 exprimiert, und die epitheliale Expansion in pankreatische Vorläuferzellen^, die PDX1 und NK6-Homöobox 1 (NKX6.1)^10,11 co-exprimieren.

Das weitere Engagement für endokrine Inselzellen geht einher mit der vorübergehenden Expression des pro-endokrinen Masterregulators Neurogenin-3 (NGN3)12 und der stabilen Induktion der wichtigsten Transkriptionsfaktoren neuronale Differenzierung 1 (NEUROD1) und NK2-Homöobox 2 (^NKX2.2)¹³. Anschließend werden die wichtigsten hormonexprimierenden Zellen, wie insulinproduzierende Betazellen, Glucagon-produzierende Alphazellen, Somatostatin-produzierende Delta-Zellen und Pankreas-Polypeptid-produzierende PY-Zellen, programmiert. Mit diesem Wissen sowie Entdeckungen aus umfangreichen Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening-Studien haben jüngste Fortschritte die Erzeugung von hPSC-Inseln mit Zellen ermöglicht, die Betazellen ähneln, die zur Insulinsekretion fähig sind 14,15,16,17,18,19.

Es wurde über schrittweise Protokolle zur Generierung von Glukose-responsiven Betazellen berichtet 6,14,18,19. Aufbauend auf diesen Studien beinhaltet das vorliegende Protokoll die Verwendung eines Pankreas-Vorläuferkits zur Generierung von PDX1+/NKX6.1⁺ Pankreas-Vorläuferzellen in einer planaren Kultur, gefolgt von der Aggregation von Mikrotiterplatten zu Clustern einheitlicher Größe und der weiteren Differenzierung in Richtung Insulin-sezernierende hPSC-Inseln mit dem R-Protokoll in einer statischen 3D-Suspensionskultur. Qualitätskontrollanalysen, einschließlich Durchflusszytometrie, Immunfärbung und funktioneller Bewertung, werden zur rigorosen Charakterisierung der differenzierenden Zellen durchgeführt. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte der gerichteten Differenzierung und skizziert die in vitro Charakterisierungsansätze.

Protokoll

Dieses Protokoll basiert auf der Arbeit mit hPSC-Leitungen, einschließlich H1, HUES4 PDXeG und Mel1 INS^GFP/W, unter speiserfreien Bedingungen. In diesem Abschnitt wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung beschrieben, wobei im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" unterstützende Daten aus der Differenzierung von Mel1 INS^GFP/W aufgeführt sind. Wir empfehlen, dass weitere Optimierungen erforderlich sind, wenn Sie mit anderen hPSC-Linien arbeiten, die hier nicht aufgeführt sind. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Reagenzien und Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Herstellung von Differenzierungsmedien und -lösungen

ANMERKUNG: Siehe Tabelle 1 für alle herzustellenden Lösungen und Tabelle 2 für die Differenzierungsmedien.

1. Bereiten Sie alle Medien und Reagenzien für die Zellkultur in einer sterilen Biosicherheitswerkbank vor. Zellkulturbezogene Lösungen und Basalmedien vor Gebrauch in einem Bad kurz auf 37 °C erwärmen.
   HINWEIS: Stellen Sie, wie unten beschrieben, täglich neue Differenzierungsmedien her, indem Sie Nahrungsergänzungsmittel hinzufügen und sie am selben Tag verwenden. Alternativ bietet das Pankreas-Vorläufer-Kit die Möglichkeit, ein größeres Volumen im Voraus vorzubereiten, das über mehrere Tage gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet werden kann. Beide Methoden zur Medienaufbereitung erweisen sich als bewährt. Beachten Sie, dass es nicht empfohlen wird, Medien über einen längeren Zeitraum im Wasserbad zu belassen. Bei der täglichen Zubereitung von Medien wird empfohlen, Nahrungsergänzungsmittel zu aliquotieren, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden.

2. Differenzierung von hPSCs in Pankreas-Vorläuferzellen

1. Halten Sie undifferenzierte hPS-Zellen auf Matrigel-beschichteten Gefäßen in mTeSR1-Komplettmedium aufrecht und führen Sie täglich einen Mediumwechsel durch. Während der Erhaltungskultur werden hPSCs alle 3-4 Tage mit dem Zelldissoziationsreagenz gemäß dem Protokoll des Herstellers verabreicht, wenn die Zellen eine Konfluenz von ~70 % erreicht haben. Um die Differenzierung zu initiieren, werden die Zellen in einzelne Zellen dissoziiert und auf mit 6-Well- oder 12-Well-Gewebekulturen behandelte Platten (mit Medienvolumina von 2 ml bzw. 1 ml pro Well) ausgesät.
   HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für Anweisungen zur Lagerung von endoderm Basalmedium und seinen Aliquoten.
2. Anschwemmkulturvertiefungen mit hESC-qualifiziertem Matrigel (verdünnt in eiskaltem DMEM/F12, wie vom Herstellerprotokoll empfohlen) vorschwemmen und die Platte 30 Minuten lang in einen befeuchteten 37 °C und 5 % CO₂ -Inkubator legen.
3. Die Matrigel-beschichtete Platte auf Raumtemperatur stellen (innerhalb von 3 h verbrauchen).
4. Das verbrauchte Medium aus der hPSC-Kultur absaugen und einmal mit DPBS spülen. Die hPSC-Kultur wird mit einem Zelldissoziationsenzym bei 37 °C für 3-5 min in einzelne Zellen dissoziiert. Spülen Sie die Zellen ab, indem Sie warmes DMEM/F12-Medium hinzufügen, in ein konisches 15-ml- oder 50-ml-Röhrchen überführen und 5 Minuten lang bei 300 × g schleudern.
5. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit Stammzell-Komplettmedium plus 10 μM Y-27632 und führen Sie eine Lebendzellzählung (Trypanblau negativ) mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler durch. Verdünntes Matrigel absaugen und lebende Zellen mit einer Dichte von 1,60-1,80 × 10 5/^cm2 sofort in Matrigel-beschichtete Vertiefungen aufnehmen und 24 h lang in einem befeuchteten 37 °C und⁵ % CO₂ -% -Inkubator inkubieren. Fahren Sie mit Schritt 1 fort.
   HINWEIS: Dies führt zu einer anfänglichen Konfluenz von ~95 % für die Initiierung der Differenzierung. Laut Herstellerprotokoll wird eine Aussaatdichte von 2,6 × 10⁵/^cm2 empfohlen. Es wird empfohlen, verschiedene Aussaatdichten zu testen, um den optimalen Wert für eine Zelllinie zu ermitteln und die Zellviabilität zu überprüfen. Wenn die Lebensfähigkeit unter 80 % liegt, fahren Sie nicht mit der Differenzierung fort. Eine geringe Zelllebensfähigkeit kann das Ergebnis einer Überverdauung oder Übertriturierung während der Ernte oder des Verbleibs der Zellen in DMEM/F12-Medium vor der Aussaat sein.
6. Auf Stufe 1 Tag 1 das Endoderm-Basalmedium kurz in einem Bad auf 37 °C erwärmen und die Nahrungsergänzungsmittel MR und CJ auftauen. Bereiten Sie das Medium der Stufe 1A vor, indem Sie dem Basalmedium des Endoderms Supplement MR und CJ hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
7. Das verbrauchte Medium wird aus den Vertiefungen abgesaugt, Medium der Stufe 1A zugegeben und in einem befeuchteten 37 °C, 5 % CO₂ -Inkubator für 24 h inkubiert.
   HINWEIS: Waschschritte sind nicht erforderlich. Entfernen Sie alle nicht anhaftenden Zellen aus der Kultur, indem Sie die Kulturplatte vor dem Mediumwechsel vorsichtig schütteln. Vermeiden Sie eine Unterbrechung der Monoschicht, indem Sie die Pipettenspitze während der Entfernung des Mediums und durch die sanfte Zugabe des Mediums nicht mit dem Boden der Vertiefung berühren.
8. Auf Stufe 1 Tag 2 das Endoderm-Basalmedium in einem 37 °C warmen Bad kurz erwärmen und Supplement CJ auftauen. Bereiten Sie das Medium der Stufe 1B vor, indem Sie Supplement CJ zum Endoderm-Basalmedium hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
9. Das verbrauchte Medium wird aus den Vertiefungen abgesaugt, Medium der Stufe 1B hinzugefügt und 24 h lang in einem befeuchteten 37 °C_{C und} 5 % CO 2 -Inkubator inkubiert.
10. Wiederholen Sie an Tag 3 der Stufe 1 die Schritte 2.8 bis 2.9. Fahren Sie mit Phase 2 fort.
11. An Tag 1 der Stufe 2 das Basalmedium der Bauchspeicheldrüse der Stufe 2-4 in einem 37 °C heißen Bad erwärmen und die Ergänzungen 2A und 2B auftauen. Bereiten Sie das Medium der Stufe 2A vor, indem Sie die Ergänzungen 2A und 2B zum Basalmedium der Bauchspeicheldrüse der Stufe 2-4 hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
12. Das verbrauchte Medium wird aus Vertiefungen abgesaugt, Medium der Stufe 2A zugegeben und 24 Stunden lang in einem befeuchteten 37 °C und 5 % CO₂ -Inkubator inkubiert.
13. An Tag 2 der Stufe 2 das Basalmedium der Bauchspeicheldrüse der Stufe 2-4 in einem 37 °C warmen Bad erwärmen und die Ergänzung 2B auftauen. Bereiten Sie das Medium der Stufe 2B vor, indem Sie das Medium der Bauchspeicheldrüse der Stufe 2-4 in das Basalmedium der Bauchspeicheldrüse der Stufe 2-4 geben. Gut mischen und sofort verwenden.
14. Das verbrauchte Medium wird aus den Wells abgesaugt, Medium der Stufe 2B hinzugefügt und in einem befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ 24 h inkubiert.
15. Wiederholen Sie in Phase 2 Tag 3 die Schritte 2.13 bis 2.14. Fahren Sie mit Phase 3 fort.
16. Auf Stufe 3 Tag 1 Bauchspeicheldrüsen-Basalmedium der Stufe 2-4 in einem 37 °C warmen Bad erwärmen und Ergänzung 3 auftauen. Bereiten Sie das Medium der Stufe 3 vor, indem Sie dem Basalmedium der Stufe 2-4 der Bauchspeicheldrüse Nahrungsergänzungsmittel 3 hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
17. Das verbrauchte Medium wird aus Vertiefungen abgesaugt, Medium der Stufe 3 hinzugefügt und 24 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ -% inkubiert.
18. Wiederholen Sie in Phase 3, Tag 2 und Tag 3 die Schritte 2.16-2.17. Fahren Sie mit Phase 4 fort.
19. Auf Stufe 4 Tag 1 Bauchspeicheldrüsen-Basalmedium der Stufe 2-4 in einem 37 °C warmen Bad erwärmen und Ergänzung 4 auftauen. Bereiten Sie das Medium der Stufe 4 vor, indem Sie das Nahrungsergänzungsmittel 4 zum Basalmedium der Bauchspeicheldrüse der Stufe 2-4 hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
20. Das verbrauchte Medium wird aus Vertiefungen abgesaugt, Medium der Stufe 4 hinzugefügt und 24 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert.
21. Wiederholen Sie in Phase 4 Tag 2 bis Tag 4 die Schritte 2.19-2.20. Fahren Sie mit den Aggregationsschritten fort.

3. Aggregation zu Pankreas-Vorläuferclustern unter Verwendung von Mikrotiterplatten mit einem Durchmesser von 400 μm

1. In Phase 4 Tag 5 behandeln Sie die Mikrowells (z. B. 24-Well-Plattenformat) mit 500 μl Anti-Adhärenz-Spüllösung pro Well.
2. Bereiten Sie eine Waageplatte vor und zentrifugieren Sie die Mikrotiterplatte bei 1.300 × g 5 Minuten lang.
   HINWEIS: Überprüfen Sie die Platte unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass keine Blasen in den Mikrowellen zurückbleiben. Zentrifugieren Sie erneut für weitere 5 Minuten, wenn Blasen in Mikrowellen eingeschlossen bleiben.
3. Saugen Sie die Anti-Adhärenz-Spüllösung aus den Vertiefungen an und spülen Sie sie einmal mit 1 ml DPBS ab. Saugen Sie das DPBS aus den Vertiefungen ab und geben Sie 1 ml Aggregationsmedium in jede Vertiefung.
4. Entfernen Sie das verbrauchte Medium aus den Pankreas-Vorläuferkulturen und waschen Sie es einmal mit DPBS. Dissoziation der Kulturen in Einzelzellen mit Dissoziationsreagenz bei 37 °C für 10-12 min. Spülen Sie die Zellen mit warmem DMEM/F12 ab, geben Sie sie in ein Röhrchen und schleudern Sie sie bei 300 × g für 5 Minuten.
5. Resuspendieren Sie das Zellpellet im Aggregationsmedium und führen Sie eine Lebendzellzählung durch. Säen Sie 2,4-3,6 Millionen Gesamtzellen pro Well (d. h. 2.000-3.000 Zellen pro Mikrowelle) und fügen Sie Aggregationsmedium zu jeder Vertiefung hinzu, um ein Endvolumen von 2 ml pro Well zu erreichen.
6. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig mehrmals mit einer P1000-Pipettenspitze auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in der Vertiefung zu gewährleisten. Führen Sie keine Blasen in Mikrowellen ein. Zentrifugieren Sie die Mikrotiterplatte bei 300 × g für 5 Minuten, um die Zellen in den Mikrowellen zu erfassen. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte in einem befeuchteten 37 °C heißen, 5 % CO_{2 -} Inkubator für eine 24-stündige Aggregation und fahren Sie mit der Differenzierung der Stufen 5 bis 7 fort.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, die Platte während der Zeit der Aggregation nicht zu stören. Bis zu 48 Stunden Inkubationszeit können für eine optimale Aggregatbildung erforderlich sein.

4. Differenzierung von Kit-abgeleiteten Pankreas-Vorläuferclustern in hPSC-Inselzellen

1. An Tag 1 der Stufe 5 das Basalmedium der Stufe 5-7 in einem 37 °C warmen Bad erwärmen und ergänzen (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2). Bereiten Sie das Medium der Stufe 5 vor, indem Sie dem Basalmedium der Stufe 5-7 Zusätze (zu den endgültigen Arbeitskonzentrationen) hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
2. Nach der Aggregatbildung pipettieren Sie die Aggregate vorsichtig mehrmals mit einer P1000-Pipettenspitze auf und ab, um alle nicht aggregierten Zellen schwimmen zu lassen. Lassen Sie die Aggregate durch die Schwerkraft absetzen (warten Sie ~1 Minute). Entfernen Sie vorsichtig das verbrauchte Medium (das die schwimmenden, nicht aggregierten Zellen enthält) so weit wie möglich aus der Vertiefung und vermeiden Sie dabei das Ansaugen von Aggregaten.
3. Geben Sie frisches Medium der Stufe 5 kräftig auf die Oberfläche der Mikrotiterplatte, um Aggregate aus den Mikrowellen zu entfernen. Überführen Sie die Aggregate in 6-Wells (Ultralow Attachment, ULA). Einmal mit Medium der Stufe 5 spülen, um die Aggregate vollständig aus den Mikrowellen zu entfernen.
4. Sammeln Sie alle Aggregate in den ULA 6-Wells, resuspendieren Sie die Aggregate im Medium der Stufe 5 und passen Sie die Dichte auf 20 Cluster pro 100 μl an (z. B. werden ~1.200 Cluster aus jeder Vertiefung erwartet. Resuspendierung von 1.200 Clustern in 6 ml Medium der Stufe 5). Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 μl Medium der Stufe 5 in jede Vertiefung einer ULA-Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen zu dosieren. Füllen Sie die Eck- und Randvertiefungen mit 200 μl DPBS.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Randschächte für die Kultivierung von Zuschlagstoffen zu verwenden, da sie zu mehr Verdunstung neigen. Andernfalls verwenden Sie eine 96-Well-Platte, die so konzipiert ist, dass die Verdunstung entlang der Ränder minimiert wird (z. B. 96-Well-Platten mit eingebauten Gräben), oder legen Sie die Kulturplatte in einen Mikroklima-Zellkultur-Inkubator mit hoher Luftfeuchtigkeit.
5. Geben Sie 100 μl der Cluster-Resuspension in jede Vertiefung der ULA-Flachbodenplatte mit 96 Wells, was zu insgesamt 150 μl Nährmedium führt, das durchschnittlich 20 Cluster pro Well enthält.
   HINWEIS: Mischen Sie die Cluster-Resuspension jedes Mal vorsichtig, bevor Sie sie in 96-Wells dosieren.
6. Kulturplatten werden 24 h lang auf einer ebenen Fläche in einen befeuchteten Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ gelegt.
7. Bereiten Sie an Tag 2 der Stufe 5 die mittlere Stufe nach Schritt 4.1 vor.
8. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um ~90 μl des verbrauchten Mediums aus jeder Vertiefung zu entfernen, und frischen Sie es mit 100 μl Medium der Stufe 5 auf.
9. Wiederholen Sie an Tag 3 der Stufe 5 die Schritte 4.7 bis 4.8. Fahren Sie mit Phase 6 fort.
10. An Tag 1 der Stufe 6 das Basalmedium der Stufe 5-7 in einem Bad bei 37 °C erwärmen und auftauen (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2). Bereiten Sie das Medium der Stufe 6 vor, indem Sie dem Basalmedium der Stufe 5-7 Zusätze (zu den endgültigen Arbeitskonzentrationen) hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
11. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um ~90 μl des verbrauchten Mediums zu entfernen, und frischen Sie es mit 100 μl Medium der Stufe 6 pro Well auf.
12. Wiederholen Sie in Phase 6, Tag 2 bis Tag 8 die Schritte 4.10-4.11. Fahren Sie mit Phase 7 fort.
13. An Tag 1 der Stufe 7 das Basalmedium der Stufe 5-7 in einem 37 °C warmen Bad erwärmen und die Nahrungsergänzungsmittel auftauen (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2). Bereiten Sie das Medium der Stufe 7 vor, indem Sie dem Basalmedium der Stufe 5-7 Zusätze (zu den endgültigen Arbeitskonzentrationen) hinzufügen. Gut mischen und sofort verwenden.
14. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um ~90 μl des verbrauchten Mediums zu entfernen und mit 100 μl Medium der Stufe 7 pro Well aufzufrischen.
15. Wiederholen Sie auf Etappe 7 Tag 2 bis Tag 12 die Schritte 4.13-4.14. Fahren Sie mit der In-vitro-Charakterisierung fort.

5. Durchflusszytometrische Analyse

1. Nährmedien entfernen und einmal mit DPBS waschen. Dissoziation der Kulturen (planare Vorläuferzellen oder differenzierende Cluster) in Einzelzellen mit Dissoziationsreagenz durch Inkubation bei 37 °C für 10-12 min. Mit FACS-Puffer abspülen und bei 300 × g 5 Minuten schleudern.
2. Resuspendieren Sie das Zellpellet im FACS-Puffer und führen Sie die Zellzählung durch. Schleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 5 Minuten. Resuspendieren Sie einzelne Zellen in 500 μl Fix/Perm-Puffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Bringen Sie den Fix/Perm-Puffer vor Gebrauch auf Raumtemperatur. Der Fix/Perm-Puffer enthält Paraformaldehyd (PFA). PFA vorsichtig in einem Abzug behandeln und gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgen.
3. 3 Minuten lang bei 500 × g schleudern, zweimal mit 500 μl 1x Perm/Wash-Puffer waschen und in 300 μl 1x Perm/Wash-Puffer resuspendieren. 100 μl Einzelzell-Resuspension (jeweils mit 2,5-3 × 10⁵ Zellen) werden zur ungefärbten Kontrolle, Isotypkontrolle und Antikörperfärbung in drei Mikrofugenröhrchen überführt (siehe Materialtabelle für Informationen zu Probenantikörpern und Verdünnungen). 45 min bei Raumtemperatur inkubieren und mit Folie abdecken.
4. Bei 500 × g 3 Min. schleudern. Zweimal mit 500 μl 1x Dauerwellen-/Waschpuffer waschen. Resuspendieren Sie die Proben in 100 μl FACS-Puffer und analysieren Sie die gefärbten Zellen (siehe Materialtabelle für die intrazelluläre Färbung von Markern in bestimmten Stadien) mit einem Durchflusszytometer und einer Software (z. B. FlowJo).
   HINWEIS: Wenn die Proben nicht sofort untersucht werden, lagern Sie sie bei 4 °C und vor Licht geschützt. Bei der Anschnittstrategie werden die Strömungsdaten zunächst durch Streueigenschaften (FSC-A und SSC-A) gesteuert, um kleine Zelltrümmer zu entfernen, gefolgt von FSC-A- und FSC-Breiteneigenschaften, um Singuletts zu identifizieren. Positives und negatives Gating wird durch Stammzellkontrollen und/oder ungefärbte Isotypkontrollen bestimmt.

6. Immunfärbung des gesamten Mounts

1. Sammle Cluster in einem Mikrofugenröhrchen. Besiedeln Sie Cluster durch die Schwerkraft. Saugen Sie das verbrauchte Medium ab und spülen Sie es einmal mit 1 ml PBS (mit Kalzium und Magnesium) ab. Fixieren Sie die Cluster mit 1 ml 4% PFA bei 4 °C über Nacht.
2. Einmal mit PBST spülen und 20-30 Cluster mit 500 μl 0,3% TritonX-100 in einem Mikrofugenröhrchen bei Raumtemperatur für mindestens 6 h auf einem Kippschüttler permeabilisieren.
   HINWEIS: Für große Cluster ist eine längere Permeabilisierungszeit (bis zu 24 Stunden) erforderlich.
3. Inkubieren Sie die Cluster in 100 μl Sperrpuffer bei Raumtemperatur für 1 h auf einem Kippschüttler. Entfernen Sie den Blockierungspuffer und inkubieren Sie die Cluster mit 100 μl Primärantikörpern, die in Antikörperverdünnungspuffer bei Raumtemperatur über Nacht auf einem Kippschüttler verdünnt wurden.
   HINWEIS: Wenn der Hintergrund während der Bildgebung stark ist, mit Primärantikörpern bei 4 °C inkubieren.
4. 3 x 30 min mit 500 μl PBST gründlich auf einem Kippschüttler waschen (Neigungswinkel auf 8 eingestellt, Geschwindigkeit auf 20 eingestellt).
5. Inkubieren Sie die Cluster mit 100 μl Sekundärantikörpern in Antikörperverdünnungspuffer bei Raumtemperatur über Nacht auf einem Kippschüttler. Decken Sie die Röhrchen mit Folie ab.
   HINWEIS: Wenn der Hintergrund während der Bildgebung stark ist, mit Sekundärantikörpern bei 4 °C inkubieren.
6. Einmal mit 500 μl PBST ausspülen. Fügen Sie 100 μl 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Lösung (10 μg/ml in PBST) hinzu und färben Sie sie bei Raumtemperatur für 10-15 Minuten. Mit Folie abdecken und vor Licht schützen.
7. 3 x 30 min mit 500 μl PBST gründlich auf einem Kippschüttler waschen. Decken Sie die Röhrchen während des Waschvorgangs mit Folie ab.
8. Befestigen Sie die Cluster auf Objektträgern der Bildgebungskammer (siehe Materialtabelle), die gemäß dem Protokoll des Herstellers und den veröffentlichten Protokollen^20,21 mit Gewebeklebstoff vorbeschichtet sind.
9. Mit gewebereinigendem Medium (80 % Glycerin in PBS-Lösung) bestücken und mit Deckgläsern abdecken. Bis zur konfokalen Bildgebung vor Licht schützen.
   HINWEIS: Wenn Proben nicht sofort abgebildet werden, lagern Sie sie bei 4 °C lichtgeschützt.

7. Statischer GSIS-Assay

1. Erwärmen Sie den Ringer-Bicarbonat-Puffer (3,3 G KRB) von Kreb mit niedrigem Glukosegehalt, den KRB-Puffer mit hohem Glukosegehalt (16,7 G) und den 30 mM KCl KRB-Puffer in einem 37 °C-Bad.
2. Wählen Sie von Hand auf die Größe abgestimmte Cluster aus und spülen Sie sie mit 2 ml warmem 3,3 G KRB-Puffer ab. Die Cluster werden in eine nicht mit Gewebekulturen behandelte 6-Well-Platte überführt und in 2 ml oder warmem 3,3 G KRB-Puffer für 1 h in einem befeuchteten 37 °C und 5 % CO₂ -Inkubator äquilibriert.
3. Nach der Äquilibrierung wird die Assay-Kammer (siehe Materialtabelle) mit 100 μl warmem 3,3 G KRB-Puffer gefüllt. Wählen Sie fünf Cluster von Hand aus und übertragen Sie sie in die Mitte der Analysekammer. 30 min in einem befeuchteten 37 °C, 5% CO₂ -Inkubator inkubieren.
   HINWEIS: Verwenden Sie 10-μl-Pipettenspitzen zum Übertragen von Clustern mit minimalem mittlerem Volumen.
4. ~100 μl des Überstandes vorsichtig auffangen und bei -30 °C bis zur Messung der Basalinsulinsekretion lagern (siehe Schritt 7.9). Trocknen Sie in diesem Schritt keine Trauben und verlieren Sie sie nicht. Sofort 100 μl warmer 16,7 G KRB-Puffer in die Assay-Kammer geben und dieselben Cluster 30 Minuten lang in einem befeuchteten 37 °C und 5 % CO₂ -Inkubator inkubieren.
5. ~100 μl des Überstandes vorsichtig auffangen und bei -30 °C lagern, bis die Glukose-stimulierte Insulinsekretion gemessen wird (siehe Schritt 7.9). Sofort 100 μl warmer 30 mM KCl KRB-Puffer in die Assay-Kammer geben und dieselben Cluster 30 Minuten lang in einem befeuchteten 37 °C und 5 % CO₂ -Inkubator inkubieren.
6. ~100 μl des Überstandes vorsichtig auffangen und bei -30 °C lagern, bis die KCl-stimulierte Insulinsekretion gemessen wurde (siehe Schritt 7.9). Geben Sie sofort 100 μl RIPA-Lysepuffer in die Assay-Kammer und überführen Sie den Lysepuffer, der alle fünf Cluster enthält, in ein Mikrofugenröhrchen.
7. Optional) Brechen Sie die Cluster manuell durch kräftiges Reiben mit einer P200-Pipettenspitze. 30 s Vortex und 30 min auf Eis inkubieren, gefolgt von weiteren 30 s Vortexing.
   HINWEIS: Stellen Sie eine vollständige Lyse durch Vortexing und eine ausreichende Inkubationszeit auf Eis sicher.
8. Bei 8.000 × g 1 Min. schleudern. Der Überstand wird aufgefangen und bei -30 °C gelagert, bis der Gesamtinsulingehalt gemessen wurde (siehe Schritt 7.9).
9. Messung des Humaninsulins in den überstehenden Proben mit einem Humaninsulin-ELISA-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers und den veröffentlichten Protokollen^20,22.
   HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen von überstehenden Proben. Proben mit mehr als drei Gefrier- und Auftauzyklen sollten nicht untersucht werden.

Ergebnisse

Wir haben eine Hybridstrategie entwickelt, um Stammzellen in sieben Schritten in insulinsezernierende hPSC-Inseln zu differenzieren, die ein Pankreas-Vorläuferkit für die ersten vier Stadien in planarer Kultur verwendet, gefolgt von einem modifizierten Protokoll, das auf einer zuvor beschriebenen Methode⁶ in einer statischen Suspensionskultur für die letzten drei Stadien aufbaut (Abbildung 1). Bei diesem Protokoll ist die Sicherstellung einer nahezu konfluenten (90...

Diskussion

In dieser Arbeit wird ein siebenstufiges Hybridprotokoll beschrieben, das die Erzeugung von hPSC-Inseln ermöglicht, die in der Lage sind, Insulin bei Glukoseprovokation innerhalb von 40 Tagen nach der Kultur in vitro zu sezernieren. Es wird angenommen, dass die effiziente Induktion des definitiven Endoderms unter diesen mehreren Schritten einen wichtigen Ausgangspunkt für die endgültigen Differenzierungsergebnisse darstellt^18,27,28

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma	T6397	Thyroid hormone
4% PFA solution	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	Should be handled in fume hood
96-Well, Ultralow Attachment, flat bottom	Corning Costar (VWR)	CLS3474	Flat bottom; for static suspension culture in the last three stages
Accutase	STEMCELL Technologies	07920	Dissociation reagent for Stage 4 cells
Aggrewell400 plates	STEMCELL Technologies	34415	400 µm diameter microwell plates
Aggrewell800 plates	STEMCELL Technologies	34815	800 µm diameter microwell plates
Alexa Fluor 488 Goat anti-Human FOXA2 (goat IgG)	R&D Systems	IC2400G	1:100 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 488 Goat IgG Isotype Control	R&D Systems	IC108G	1:100 in flow cytometry
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (mouse IgG2B)	BD Sciences	566032	1:250 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype Control	R&D Systems	IC0041G	1:500 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (mouse IgG1κ)	BD Pharmingen	565831	1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (mouse IgG1κ)	BD Sciences	565689	1:2,000 in flow cytometry
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1κ)	BD Sciences	563338	1:33 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (mouse IgG1κ)	BD Sciences	562594	1:50 in flow cytometry; used for assaying Stage 1 cells
Alexa Fluor 647 Mouse IgG1κ Isotype Control	BD Sciences	557714	1:50 in flow cytometry
ALK5i II	Cayman Chemicals	14794	TGF-beta signaling inhibitor
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Microwell Rinsing Solution
Assay chamber	Cellvis	D35-10-1-N	For static GSIS and confocal imaging purposes
Bovine serum albumin (BSA)	Thermo Fisher Scientific	BP1600-100	For immunostaining procedure
CK19 antibody	DAKO	M0888	1:50 in whole mount immunofluorescence
D-glucose	Sigma	G8769	Medium supplement
DAPI	Sigma	D9542	For nuclear counterstaining
DMEM/F12, HEPES	Thermo Fisher Scientific	11330032	Matrix diluting solution
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555	Life technologies	A21432	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647	Life technologies	A21447	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 555	Life technologies	A31570	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647	Life technologies	A31571	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 555	Life technologies	A31572	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 647	Life technologies	A31573	1:500 in whole mount immunofluorescence
Donkey anti-sheep Alexa Fluor 647	Life technologies	A21448	1:500 in whole mount immunofluorescence
DPBS	Sigma	D8537	Without Ca2+ and Mg2+
ELISA, insulin, human	Alpco	80-INSHU-E01.1	For human insulin measurement
Fatty acid-free BSA	Proliant	68700	Medium supplement
Fixation and Permeabilization Solution Kit	BD Sciences	554714	Fix/Perm and 10x Perm/Wash solutions included
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	7174	For clump passaging hPSCs during maintenance culture
Glucagon antibody	Sigma	G2654	1:400 in whole mount immunofluorescence
GLUT1 antibody	Thermo Fisher Scientific	PA1-37782	1:200 in whole mount immunofluorescence
GlutaMAX-I (100x)	Gibco	35050061	L-glutamine supplement
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-4	For tissue clearing and mounting
GSi XX	Sigma Millipore	565789	Notch inhibitor
Heparin	Sigma	H3149	Medium supplement
ITS-X (100x)	Thermo Fisher Scientific	51500056	Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine; medium supplement
LDN193189	STEMCELL Technologies	72147	BMP antagonist
MAFA antibody	Abcam	ab26405	1:200 in whole mount immunofluorescence
Matrigel, hESC-qualified	Thermo Fisher Scientific	08-774-552	Extracellular matrix for vessel surface coating
MCDB131 medium	Life technologies	10372019	Base medium
mTeSR1 Complete Kit	STEMCELL Technologies	85850	stem cell medium and 5x supplement included
N-Cys (N-acetyl cysteine)	Sigma	A9165	Antioxidant
NaHCO3	Sigma	S6297	Medium supplement
NEUROD1 antibody	R&D Systems	AF2746	1:20 in whole mount immunofluorescence
NKX6.1 antibody	DSHB	F55A12-c	1:50 in whole mount immunofluorescence
Pancreatic polypeptide antibody	R&D Systems	AF6297	1:200 in whole mount immunofluorescence
PBS	Sigma	D8662	With Ca2+ and Mg2+
PDX1 antibody	Abcam	ab47267	1:200 in whole mount immunofluorescence
PE Mouse anti-Human GCG (mouse IgG1κ)	BD Sciences	565860	1:2,000 in flow cytometry; used for assaying Stage 7 cells
PE Mouse anti-Human NKX6.1 (mouse IgG1k)	BD Sciences	563023	1:250 in flow cytometry
PE Mouse anti-Human PDX1 (mouse IgG1k)	BD Sciences	562161	1:200 in flow cytometry; used for assaying Stage 4 cells
PE Mouse IgG1κ Isotype Control	BD Sciences	554680	1:2,000 in flow cytometry
PE Mouse-Human Chromogranin A (CHGA, mouse IgG1k)	BD Sciences	564563	1:200 in flow cytometry
R428	Cayman Chemicals	21523	AXL tyrosine kinase inhibitor
Retinoid acid, all-trans	Sigma	R2625	Light-sensitive
RIPA lysis buffer, 10x	Sigma	20-188	For hormone extraction
SANT-1	Sigma	S4572	SHH inhibitor
SLC18A1 antibody	Sigma	HPA063797	1:200 in whole mount immunofluorescence
Somatostatin antibody	Sigma	HPA019472	1:100 in whole mount immunofluorescence
STEMdiff Pancreatic Progenitor Kit	STEMCELL Technologies	05120	Basal media and supplements included
Synaptophysin antibody	Novus	NB120-16659	1:25 in whole mount immunofluorescence
Triton X-100	Sigma	X100	For permeabilization
Trolox	Sigma Millipore	648471	Vitamin E analog
TrypLE Enzyme Express	Life technologies	12604-021	cell dissociation enzyme reagent for single cell passaging hPSCs
Trypsin1/2/3 antibody	R&D Systems	AF3586	1:25 in whole mount immunofluorescence
Y-27632	STEMCELL Technologies	72304	ROCK inhibitor
Zinc sulfate	Sigma	Z0251	Medium supplement