Estandarización de la transferencia a través de laboratorios entre citómetros de flujo para la detección de linfocitos en niños vacunados con encefalitis japonesa

Resumen

En este estudio, se desarrolló un método para facilitar la transferencia de entornos experimentales y plantillas de análisis entre dos citómetros de flujo en dos laboratorios para la detección de linfocitos en niños vacunados con encefalitis japonesa. El método de estandarización para los experimentos del citómetro de flujo permitirá que los proyectos de investigación se lleven a cabo de manera efectiva en múltiples centros.

Resumen

Un número cada vez mayor de laboratorios necesita recopilar datos de múltiples citómetros de flujo, especialmente para proyectos de investigación realizados en múltiples centros. Los desafíos de usar dos citómetros de flujo en diferentes laboratorios incluyen la falta de materiales estandarizados, problemas de compatibilidad de software, inconsistencias en la configuración del instrumento y el uso de diferentes configuraciones para diferentes citómetros de flujo. Para establecer un experimento estandarizado de citometría de flujo para lograr la consistencia y comparabilidad de los resultados experimentales en múltiples centros, se estableció un método de estandarización rápido y factible para transferir parámetros a través de diferentes citómetros de flujo.

Los métodos desarrollados en este estudio permitieron la transferencia de configuraciones experimentales y plantillas de análisis entre dos citómetros de flujo en diferentes laboratorios para la detección de linfocitos en niños vacunados con encefalitis japonesa (JE). Se obtuvo una intensidad de fluorescencia consistente entre los dos citómetros utilizando perlas estándar de fluorescencia para establecer la configuración del citómetro. Se obtuvieron resultados comparables en dos laboratorios con diferentes tipos de instrumentos. Usando este método, podemos estandarizar el análisis para evaluar la función inmune de niños vacunados con JE en diferentes laboratorios con diferentes instrumentos, disminuir las diferencias en datos y resultados entre citómetros de flujo en múltiples centros y proporcionar un enfoque factible para la acreditación mutua de resultados de laboratorio. El método de estandarización de los experimentos con citómetros de flujo garantizará el desempeño efectivo de los proyectos de investigación en múltiples centros.

Introducción

La estandarización de la citometría de flujo es útil para la comparabilidad de los resultados obtenidos de diferentes citómetros en diferentes laboratorios y centros de estudio, y conduce al reconocimiento mutuo de los resultados para mejorar la eficiencia del trabajo. Un número cada vez mayor de escenarios requiere estandarización. Durante el proceso de desarrollo del fármaco, la estandarización de la citometría de flujo es importante, ya que un ensayo desarrollado y validado apoyará todo el proceso de desarrollo del fármaco desde el análisis preclínico hasta el clínico. Los métodos de citometría de flujo se transfieren con frecuencia entre la industria farmacéutica y los laboratorios colaboradores¹. Además, es esencial obtener datos comparables de estudios clínicos multicéntricos. Por ejemplo, se desarrolló un flujo de trabajo de estandarización en el Proyecto de Investigación Clínica Multicéntrica de Enfermedades Autoinmunes Sistémicas para obtener datos comparables de la citometría de flujo multicéntrica².

La estandarización de los métodos de citometría de flujo es un desafío. Los desafíos experimentados en los laboratorios se atribuyen a la falta de materiales estandarizados, problemas de compatibilidad de software, inconsistencias en la configuración del instrumento y el uso de diferentes configuraciones entre diferentes citómetros de flujo y estrategias de compuerta divergentes entre los centros ^3,4. Por lo tanto, es importante realizar un análisis de brecha entre laboratorios. El acceso a la muestra, los sistemas de calidad, las calificaciones del personal y la configuración del instrumento deben revisarse para garantizar que se cumplan los requisitos.

En la actualidad, los niños vacunados con la vacuna contra la encefalitis japonesa (JE) tienen una incidencia significativamente reducida de JE⁵. El monitoreo de las células inmunitarias de la sangre periférica puede ayudar a comprender los cambios en la inmunidad adaptativa mediada por células después de la vacunación y la correlación entre los cambios en los subconjuntos de linfocitos de sangre periférica y los efectos de la vacunación. Debido a la estabilidad limitada de las muestras de sangre total, las evaluaciones de la eficacia de la vacuna a menudo se realizan en múltiples centros. Para este análisis, definimos las células T CD8+ o CD4+ naïve como CD27+ CD45RA+, las células T de memoria central (T_CM) como CD27+ CD45RA-, las células T con memoria efectora (T_EM) como CD27- CD45RA-, y las células T de memoria efectora diferenciadas terminalmente (T_EMRA) como CD27^- CD45RA⁺. Las células B CD19⁺ se pueden separar en poblaciones que expresan CD27 versus IgD ^6,7, las células B naïve expresan células B de memoria CD27n (mBCs) pueden identificarse en base a la expresión de IgD^6, y las células T reguladoras (Tregs) pueden identificarse como CD4+CD25+⁺CD127^{bajo 8}. Para establecer un experimento estandarizado de citometría de flujo para lograr la consistencia y comparabilidad de los resultados experimentales en múltiples centros, se estableció un método de estandarización rápido y factible para facilitar la transferencia de protocolos a través de diferentes citómetros de flujo para la detección de linfocitos en la sangre total de niños vacunados con JE. Seis niños sanos (2 años de edad) fueron reclutados del Hospital de Niños de Beijing, Universidad Médica Capital. Después de recibir una vacuna de refuerzo y cebador con una vacuna JE SA14-14-2 viva atenuada menos de 6 meses antes, se recolectaron muestras de sangre periférica de los voluntarios. Se obtuvieron datos altamente comparables de diferentes instrumentos siguiendo procedimientos estandarizados, lo cual es útil para evaluaciones multicéntricas.

Protocolo

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de Niños de Beijing, Capital Medical University (Número de aprobación: 2020-k-85). Se renunció al consentimiento informado de sujetos humanos, ya que solo se utilizaron muestras residuales después de las pruebas clínicas en este estudio. Dos laboratorios están involucrados en este estudio. El laboratorio de transferencia es donde se desarrolló el método estandarizado utilizando un citómetro de flujo. El citómetro en este laboratorio se denominará en lo sucesivo citómetro A. El laboratorio de métodos de prueba es el laboratorio que recibe métodos que utilizan otro citómetro de flujo, y el citómetro en este laboratorio se denominará en lo sucesivo citómetro B.

1. Recolección de muestras de sangre periférica y preparación celular

1. Recolectar muestras de sangre periférica (2 ml) de niños vacunados con JE y niños no vacunados en tubos anticoagulados con EDTA-K₂ mediante venopunción estándar.
2. Mezcle toda la muestra de sangre girando los tubos al revés 10 veces. Agregue 100 μL de sangre total a un tubo de 12 mm x 75 mm. Haga cada muestra por duplicado.
3. Añadir 10 μL de tampón de tinción brillante (tampón BV) a un tubo de 12 mm x 75 mm. Añadir 5 μL de cada anticuerpo (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; factor de dilución: 1:20) y 20 μL de anticuerpo (CD25, CD45RA; factor de dilución: 1:5) al tampón BV. Vórtice suavemente.
   NOTA: Los volúmenes y la información de los reactivos de anticuerpos se muestran en la Tabla 1.
4. Agregue el cóctel de anticuerpos en el tubo con la muestra de sangre completa. Vortex suavemente e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos en la oscuridad.
5. Diluir la solución de lisado 10x 1:10 con agua destilada para preparar 1x solución de lisado. Lise las muestras de sangre agregando 2 ml de solución de lisado 1x. Vortex suavemente e incubar durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
6. Centrifugar a 300 × g durante 5 min y decantar el sobrenadante.
7. Resuspender el pellet en 2 mL de 1x PBS, centrifugar a 300 × g durante 5 min, y decantar el sobrenadante.
8. Resuspender el pellet en 0.5 mL de 1x PBS y mezclar bien. Conservar entre 2 °C y 8 °C. Envíe las muestras a los dos laboratorios para el análisis citométrico de flujo.
   NOTA: La muestra de control negativo y el control de teñida única de celda deben procesarse simultáneamente.

2. Preparación de perlas de compensación y control de una sola mancha

1. Etiqueta V500-anti-CD45 de una sola tinción, APC-H7-anti-CD3 de una sola tinción, FITC-anti-CD4 de una sola tinción, R718-anti-CD8 de una sola tinción, BV605-anti-CD27 de una sola tinción, APC-anti-CD45RA de una sola tinción, PE-anti-CD25 de una sola tinción, BV421-anti-CD127 de una sola tinción, BB700-anti-CD19 de una sola tinción y PE-CY7-anti-IgD de una sola tinción.
2. Agregue 100 μL de 1 tampón salino tamponado con fosfato (DPBS) de Dulbecco que contenga 1% de suero bovino fetal (FBS) a un tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml.
3. Agregue 50 μL de las perlas negativas y 50 μL de las perlas anti-ratón Ig, κ a cada tubo y vórtice.
4. Agregue 2 μL de cada anticuerpo marcado (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) a un tubo de una sola tinción. Vortex la mezcla suavemente e incubar durante 15 min en la oscuridad a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C).
5. Resuspender las perlas en 2 ml de 1x PBS, centrifugar a 300 × g durante 5 min y decantar el sobrenadante.
6. Resuspender las perlas en 0,5 ml de 1x PBS y mezclar bien. Conservar entre 2 °C y 8 °C.

3. Usar nombres de configuración idénticos en los diferentes citómetros en dos laboratorios

1. Cree una nueva configuración en el software del citómetro A. Haga clic en el botón Citómetro y elija ver configuraciones para mostrar la ventana de configuración.
2. En la lista de configuración, haga clic con el botón secundario en la carpeta de configuraciones base, elija Nueva carpeta y cámbiele el nombre.
3. Haga clic con el botón derecho en la configuración base y elija copiar.
4. Haga clic con el botón secundario en la nueva carpeta y pegue la configuración base para crear una nueva configuración. Cambie el nombre de la nueva configuración a "Transferencia de método estandarizado".
5. Arrastre el nombre del parámetro, como FITC, de la lista Parámetros al detector apropiado (530/30).
6. Edite parámetros adicionales (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 y BV605) a la nueva configuración.
7. Siga este método para crear una nueva configuración en un modelo de citómetro de flujo diferente utilizando el mismo nombre "Transferencia de método estandarizado". Asegúrese de que la configuración incluye los mismos parámetros para cada detector.
   NOTA: Para identificar correctamente la plantilla de experimento en los dos modelos diferentes de citómetro de flujo, asegúrese de que el nombre sea coherente.
8. En las configuraciones del citómetro, utilice las perlas de configuración y seguimiento del citómetro (CST) para definir la línea de base del citómetro y realizar un seguimiento del rendimiento del citómetro. Haga clic en el botón Citómetro y elija CST para mostrar el espacio de trabajo de configuración y seguimiento del citómetro.
9. Agregue tres gotas (150 μL) de perlas de configuración a 0.5 ml de 1x PBS en un tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml. Coloque el tubo de cuentas en el citómetro.
10. En la ventana Control de instalación , elija Definir línea base y haga clic en Ejecutar.

4. Experimento de estandarización usando citómetro A en el laboratorio de transferencia

1. Ejecute una comprobación de rendimiento utilizando la configuración del citómetro y las perlas de seguimiento para verificar que el citómetro está funcionando bien.
2. En la ventana del navegador de software, haga clic con el botón derecho en la configuración del citómetro y elija Configuración de la aplicación para crear una hoja de cálculo.
3. Usando una muestra no teñida, ajuste los voltajes del tubo fotomultiplicador (PMT) de FSC, SSC y todos los parámetros de fluorescencia. FSC: 260; CSS: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; APC: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; y BV605: 505.
4. Haga clic con el botón derecho en la configuración del citómetro del experimento y elija la configuración de la aplicación para guardarla.
5. Haga clic en el botón del experimento y elija el menú de configuración de compensación . A continuación, elija Create compensation controls (Crear controles de compensación) para agregar automáticamente controles de compensación.
6. Registre los datos de todas las perlas de control de compensación.
7. Haga clic en el experimento y elija la configuración de compensación. Luego, calcule la compensación automáticamente.
8. Registre datos para controles de celda única teñida.
9. Utilice CD45RA APC para modificar el valor de compensación de R718 al 15% de APC. Utilice CD19 BB700 para modificar el valor de compensación de APC-H7 al 14% BB700. Utilice CD8 R718 para modificar el valor de compensación de APC-H7 al 60% R718.
10. Registre los datos de las cuentas CST.
11. Cree una hoja de cálculo global de la plantilla de valor de destino para las cuentas brillantes de CST.
12. Usando un diagrama FSC/SSC, dibuje la puerta del polígono para las cuentas brillantes CST. Obtenga gráficos de histograma de 10 canales de fluorescencia para las perlas brillantes CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 y BV605. Crear puertas de intervalo en los gráficos de histograma. Cree la vista de estadísticas mostrando la mediana de las puertas de intervalo.
13. Ejecute las muestras en el citómetro de flujo; recolectar un total de 25.000 linfocitos.
14. Cree una hoja de cálculo global de la plantilla de análisis para los ejemplos.
15. Utilice la siguiente estrategia de activación de ejemplo:
    1. Usando un diagrama de puntos CD45/área de dispersión lateral (SSC-A), dibuje la puerta del polígono para identificar la población de linfocitos intactos mientras excluye los desechos.
    2. Usando un diagrama de puntos CD3/CD19, dibuje una puerta rectangular para seleccionar las células T CD3+ y las células B CD19⁺.
    3. Usando un diagrama de puntos CD4/CD8, dibuje una puerta cuádruple para seleccionar células T CD4+ o CD8⁺ (células con una alta fluorescencia para estos marcadores, respectivamente).
    4. Usando un diagrama de puntos CD45RA/CD27, dibuje una puerta cuádruple para subdividir las células T CD8+ o CD4+ en células T naïve (CD27⁺CD45RA+), T_CM (CD27+ CD45RA-), T_EM (CD27-CD45RA-) y T_EMRA (CD27-CD45RA⁺).
    5. Usando un diagrama de puntos CD25/CD127, dibuje una puerta cuádruple para subdividir las células T CD4⁺ en células Treg (CD4+CD25+^{+CD127 bajo}).
    6. Usando un diagrama de puntos CD27/IgD, dibuje una puerta cuádruple para subdividir las células B CD19+ en células B ingenuas (CD27-IgD+) y células B de memoria (CD27⁺IgD^-).
16. Guarde la plantilla experimental en el citómetro A.
17. Utilice el CD-ROM para exportar la plantilla experimental.

5. Transferencia de la plantilla experimental al citómetro B en el laboratorio de métodos de prueba

NOTA: La plantilla experimental incluye la configuración del instrumento, la plantilla de análisis y la plantilla de valor objetivo de la intensidad de fluorescencia mediana (MFI).

1. Realice una verificación de rendimiento utilizando perlas CST para verificar que el citómetro esté funcionando bien.
2. Importe la plantilla experimental y cree un experimento para el citómetro B utilizando la plantilla.
3. Utilice el mismo lote de perlas CST para ajustar los voltajes de los parámetros fluorescentes para cada canal de fluorescencia para que coincida con el instrumento MFI anterior.
   NOTA: Los valores de MFI varían dentro del ±5% (la MFI de las perlas brillantes antes y después de la transferencia se muestra en la Tabla 2).
4. Ajuste el voltaje para FSC usando la muestra sin teñir, si es necesario.
5. Haga clic con el botón derecho en la configuración del citómetro experimental y elija la configuración de la aplicación para guardar la configuración de la aplicación .
6. Utilice CD45RA APC para modificar el valor de compensación de R718 al 15% de APC. Utilice CD19 BB700 para modificar el valor de compensación de APC-H7 al 24% BB700. Utilice CD8 R718 para modificar el valor de compensación de APC-H7 al 60% R718.
7. Ejecute las muestras en el citómetro de flujo; recolectar un total de 25.000 linfocitos.

6. Consistencia entre los resultados experimentales obtenidos en los dos citómetros

1. Evaluar las diferencias en los subconjuntos de linfocitos entre los instrumentos utilizando ANOVA unidireccional (p < 0,05).

Resultados

La figura 1 muestra una hoja de cálculo global de la plantilla de valor objetivo para las cuentas brillantes de CST. Usando una gráfica FSC/SSC, se dibuja una puerta poligonal para seleccionar las cuentas brillantes CST. Se obtuvieron gráficos de histograma de 10 canales de fluorescencia para las perlas brillantes CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 y BV605. El valor objetivo para cada parámetro se muestra mostrando la mediana dentro de las puertas del histograma...

Discusión

El inmunofenotipado de los subgrupos de linfocitos de sangre periférica puede ayudar a comprender los cambios en la inmunidad adaptativa mediada por células después de la vacunación en niños. En aplicaciones clínicas, ocurren situaciones inesperadas, como la falta de detección de muestras de manera oportuna o el reemplazo de un citómetro de flujo; Por lo tanto, se necesitan métodos estandarizados rápidos que faciliten las transferencias entre citómetros de flujo en diferentes laboratorios 9,10,11.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube