Normalisation du transfert entre laboratoires entre cytomètres en flux pour la détection des lymphocytes chez les enfants vaccinés contre l’encéphalite japonaise

Résumé

Dans cette étude, une méthode a été développée pour faciliter le transfert de contextes expérimentaux et de modèles d’analyse entre deux cytomètres en flux dans deux laboratoires pour la détection des lymphocytes chez les enfants vaccinés contre l’encéphalite japonaise. La méthode de normalisation des expériences de cytomètre en flux permettra de mener efficacement des projets de recherche dans plusieurs centres.

Résumé

Un nombre croissant de laboratoires doivent collecter des données à partir de plusieurs cytomètres en flux, en particulier pour les projets de recherche réalisés dans plusieurs centres. Les défis liés à l’utilisation de deux cytomètres en flux dans différents laboratoires comprennent le manque de matériaux normalisés, les problèmes de compatibilité logicielle, les incohérences dans la configuration des instruments et l’utilisation de configurations différentes pour différents cytomètres en flux. Pour établir une expérience standardisée de cytométrie en flux afin d’assurer la cohérence et la comparabilité des résultats expérimentaux entre plusieurs centres, une méthode de normalisation rapide et réalisable a été établie pour transférer les paramètres entre différents cytomètres en flux.

Les méthodes développées dans cette étude ont permis le transfert de paramètres expérimentaux et de modèles d’analyse entre deux cytomètres en flux dans différents laboratoires pour la détection des lymphocytes chez les enfants vaccinés contre l’encéphalite japonaise (EJ). Une intensité de fluorescence constante a été obtenue entre les deux cytomètres en utilisant des billes standard de fluorescence pour établir les réglages du cytomètre. Des résultats comparables ont été obtenus dans deux laboratoires avec différents types d’instruments. En utilisant cette méthode, nous pouvons normaliser l’analyse pour évaluer la fonction immunitaire des enfants vaccinés par l’EJ dans différents laboratoires avec différents instruments, diminuer les différences de données et de résultats entre les cytomètres de flux dans plusieurs centres et fournir une approche réalisable pour l’accréditation mutuelle des résultats de laboratoire. La méthode de normalisation des expériences de cytomètre en flux assurera la performance efficace des projets de recherche dans plusieurs centres.

Introduction

La standardisation de la cytométrie en flux est utile pour la comparabilité des résultats obtenus à partir de différents cytomètres dans différents laboratoires et centres d’étude, et propice à la reconnaissance mutuelle des résultats pour améliorer l’efficacité du travail. Un nombre croissant de scénarios nécessitent une normalisation. Au cours du processus de développement du médicament, la normalisation de la cytométrie en flux est importante, car un test développé et validé soutiendra l’ensemble du processus de développement du médicament, de l’analyse préclinique à l’analyse clinique. Les méthodes de cytométrie en flux sont fréquemment transférées entre l’industrie pharmaceutique et les laboratoires collaborateurs¹. De plus, il est essentiel d’obtenir des données comparables à partir d’études cliniques multicentriques. Par exemple, un flux de travail de normalisation a été développé dans le cadre du projet de recherche clinique multicentrique sur les maladies auto-immunes systémiques afin d’obtenir des données comparables à partir de la cytométrie en flux multicentrique².

La normalisation des méthodes de cytométrie en flux est difficile. Les défis rencontrés dans les laboratoires sont attribués au manque de matériaux normalisés, aux problèmes de compatibilité logicielle, aux incohérences dans la configuration des instruments et à l’utilisation de configurations différentes entre différents cytomètres de flux et à des stratégies de contrôle divergentes entre les centres ^3,4. Par conséquent, il est important d’effectuer une analyse des écarts entre les laboratoires. L’accès aux échantillons, les systèmes qualité, les qualifications du personnel et la configuration des instruments doivent être examinés pour s’assurer que les exigences sont respectées.

À l’heure actuelle, les enfants vaccinés avec le vaccin contre l’encéphalite japonaise (EJ) ont une incidence significativement réduite de JE⁵. La surveillance des cellules immunitaires du sang périphérique peut aider à comprendre les changements dans l’immunité adaptative à médiation cellulaire après la vaccination, et la corrélation entre les changements dans les sous-ensembles de lymphocytes du sang périphérique et les effets de la vaccination. En raison de la stabilité limitée des échantillons de sang total, les évaluations de l’efficacité du vaccin sont souvent effectuées dans plusieurs centres. Pour cette analyse, nous avons défini les lymphocytes T CD8+ ou CD4+ naïfs comme CD27+ CD45RA+, les lymphocytes T à mémoire centrale (T CM) comme CD27+ CD45RA-, les lymphocytes T à mémoire effectrice (T EM) comme CD27- CD45RA^{-, et} les lymphocytes T à mémoire effectrice différenciée terminale (T_EMRA) comme CD27^- CD45RA⁺. Les lymphocytes B CD19⁺ peuvent être séparés en populations qui expriment CD27 par rapport aux IgD ^6,7, les lymphocytes B naïfs expriment CD27n mémoire Les lymphocytes B (mBC) peuvent être identifiés en fonction de l’expression des IgD^6, et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) peuvent être identifiés comme CD4+CD25+⁺CD127^{faible 8}. Pour établir une expérience standardisée de cytométrie en flux afin d’assurer la cohérence et la comparabilité des résultats expérimentaux dans plusieurs centres, une méthode de normalisation rapide et réalisable a été établie pour faciliter le transfert de protocoles entre différents cytomètres en flux pour la détection des lymphocytes dans le sang total des enfants vaccinés contre l’EJ. Six enfants en bonne santé (2 ans) ont été recrutés à l’hôpital pour enfants de Beijing de l’Université médicale de la capitale. Après avoir reçu une vaccination prime et boost avec un vaccin vivant atténué contre l’encéphalite japonaise SA14-14-2 moins de 6 mois auparavant, des échantillons de sang périphérique ont été prélevés chez les volontaires. Des données très comparables ont été obtenues à partir de différents instruments suivant des procédures normalisées, ce qui est utile pour les évaluations multicentriques.

Protocole

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital pour enfants de Beijing, Capital Medical University (numéro d’approbation: 2020-k-85). Le consentement éclairé des sujets humains a été levé car seuls les échantillons résiduels après l’utilisation d’essais cliniques dans cette étude. Deux laboratoires sont impliqués dans cette étude. Le laboratoire de transfert est l’endroit où la méthode normalisée a été développée à l’aide d’un cytomètre en flux. Le cytomètre de ce laboratoire est ci-après dénommé cytomètre A. Le laboratoire de méthodes d’essai est le laboratoire qui reçoit les méthodes utilisant un autre cytomètre en flux, et le cytomètre de ce laboratoire est ci-après dénommé cytomètre B.

1. Prélèvement d’échantillons de sang périphérique et préparation cellulaire

1. Prélever des échantillons de sang périphérique (2 mL) d’enfants vaccinés contre l’EJ et d’enfants non vaccinés dans des tubes anticoagulés à₂ EDTA-K par ponction veineuse standard.
2. Mélangez l’échantillon de sang total en retournant les tubes 10x. Ajouter 100 μL de sang total dans un tube de 12 mm x 75 mm. Faites chaque échantillon en double.
3. Ajouter 10 μL de tampon antitaches brillant (tampon BV) dans un tube de 12 mm x 75 mm. Ajouter 5 μL de chaque anticorps (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; facteur de dilution: 1:20) et 20 μL d’anticorps (CD25, CD45RA; facteur de dilution: 1:5) au tampon BV. Vortex doucement.
   REMARQUE : Les volumes et les informations sur les réactifs d’anticorps sont indiqués dans le Tableau 1.
4. Ajouter le cocktail d’anticorps dans le tube avec l’échantillon de sang total. Vortex doucement et incuber à température ambiante pendant 15 min dans l’obscurité.
5. Diluer la solution lysante 10x 1:10 avec de l’eau distillée pour préparer 1x solution lysante. Lyser les échantillons de sang en ajoutant 2 mL de 1x solution lysante. Vortex doucement et incuber pendant 10 min dans l’obscurité à température ambiante.
6. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min et décanter le surnageant.
7. Resuspendre la pastille dans 2 mL de 1x PBS, centrifuger à 300 × g pendant 5 min, et décanter le surnageant.
8. Remettez la pastille en suspension dans 0,5 mL de 1x PBS et mélangez soigneusement. A conserver entre 2 °C et 8 °C. Envoyez les échantillons aux deux laboratoires pour analyse cytométrique en flux.
   REMARQUE : L’échantillon témoin négatif et le témoin monocoloration de la cellule doivent être traités simultanément.

2. Préparation des billes de compensation et du contrôle à tache unique

1. Label V500-anti-CD45 mono-colorant, APC-H7-anti-CD3 mono-coloré, FITC-anti-CD4 mono-colorant, R718-anti-CD8 mono-colorant, BV605-anti-CD27 mono-colorant, APC-anti-CD45RA mono-colorant, PE-anti-CD25 mono-colorant, BV421-anti-CD127 mono-colorant, BB700-anti-CD19 mono-coloré et PE-CY7-anti-IgD mono-coloration.
2. Ajouter 100 μL de 1x tampon de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco contenant 1 % de sérum fœtal bovin (FBS) dans un tube à essai en polystyrène à fond rond de 5 mL.
3. Ajouter 50 μL de billes négatives et 50 μL de billes Ig, κ anti-souris à chaque tube et vortex.
4. Ajouter 2 μL de chaque anticorps marqué (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) dans un tube à coloration unique. Tourbillonner doucement le mélange et incuber pendant 15 min dans l’obscurité à température ambiante (20 °C à 25 °C).
5. Resuspendre les billes dans 2 mL de 1x PBS, centrifuger à 300 × g pendant 5 min, et décanter le surnageant.
6. Remettez les billes en suspension dans 0,5 mL de 1x PBS et mélangez bien. A conserver entre 2 °C et 8 °C.

3. Utilisation de noms de configuration identiques sur les différents cytomètres dans deux laboratoires

1. Créez une nouvelle configuration dans le logiciel du cytomètre A. Cliquez sur le bouton Cytomètre et choisissez afficher les configurations pour afficher la fenêtre de configuration.
2. Dans la liste de configuration, cliquez avec le bouton droit sur le dossier des configurations de base, choisissez Nouveau dossier et renommez-le.
3. Cliquez avec le bouton droit sur la configuration de base et choisissez Copier.
4. Cliquez avec le bouton droit sur le nouveau dossier et collez la configuration de base pour créer une nouvelle configuration. Renommez la nouvelle configuration « Transfert de méthode standardisée ».
5. Faites glisser le nom du paramètre, tel que FITC, de la liste Paramètres vers le détecteur approprié (530/30).
6. Modifiez des paramètres supplémentaires (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 et BV605) dans la nouvelle configuration.
7. Suivez cette méthode pour créer une nouvelle configuration sur un modèle de cytomètre en flux différent en utilisant le même nom « Transfert de méthode standardisé ». Assurez-vous que la configuration inclut les mêmes paramètres pour chaque détecteur.
   REMARQUE: Pour identifier avec succès le modèle d’expérience sur les deux modèles de cytomètre en flux différents, assurez-vous que le nom est cohérent.
8. Sous les configurations de cytomètre, utilisez des perles de configuration et de suivi du cytomètre (CST) pour définir la ligne de base du cytomètre et suivre les performances du cytomètre. Cliquez sur le bouton Cytomètre et choisissez CST pour afficher l’espace de travail de configuration et de suivi du cytomètre.
9. Ajouter trois gouttes (150 μL) de billes d’installation à 0,5 mL de 1x PBS dans un tube à essai en polystyrène à fond rond de 5 mL. Placez le tube de perles sur le cytomètre.
10. Dans la fenêtre Contrôle d’installation , choisissez Définir la ligne de base, puis cliquez sur Exécuter.

4. Normalisation de l’expérience à l’aide du cytomètre A dans le laboratoire de transfert

1. Exécutez une vérification des performances à l’aide de la configuration du cytomètre et des billes de suivi pour vérifier que le cytomètre fonctionne correctement.
2. Dans la fenêtre du navigateur logiciel, cliquez avec le bouton droit sur les paramètres du cytomètre et choisissez Paramètres de l’application pour créer une feuille de calcul.
3. À l’aide d’un échantillon non coloré, réglez les tensions du tube photomultiplicateur (PMT) du FSC, du SSC et de tous les paramètres de fluorescence. FSC : 260; SSC : 460; FITC : 490; PE : 575; BB700 : 620; PE-CY7 : 640; APC : 600; R718 : 620; APC-H7 : 620; BV421 : 466; V500: 420; et BV605: 505.
4. Cliquez avec le bouton droit sur les paramètres du cytomètre expérimental et choisissez les paramètres de l’application pour l’enregistrer .
5. Cliquez sur le bouton d’expérience et choisissez le menu de configuration de la compensation . Ensuite, choisissez Créer des contrôles de compensation pour ajouter automatiquement des contrôles de compensation.
6. Consigner les données de toutes les perles de contrôle de la rémunération.
7. Cliquez sur l’expérience et choisissez la configuration de la compensation. Ensuite, calculez la compensation automatiquement.
8. Enregistrer les données pour les témoins à coloration unique des cellules.
9. Utilisez CD45RA APC pour modifier la valeur de compensation de R718 à 15% APC. Utilisez CD19 BB700 pour modifier la valeur de compensation de l’APC-H7 à 14 % BB700. Utilisez CD8 R718 pour modifier la valeur de compensation de l’APC-H7 à 60 % R718.
10. Enregistrer les données pour les perles CST.
11. Créez une feuille de calcul globale du modèle de valeur cible pour les perles brillantes CST.
12. À l’aide d’un tracé FSC/SSC, dessinez la porte polygonale pour les perles brillantes CST. Obtenez des diagrammes d’histogramme de 10 canaux de fluorescence pour les billes brillantes CST : FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 et BV605. Créez des portes d’intervalle dans les diagrammes d’histogramme. Créez la vue des statistiques en affichant la médiane des portes d’intervalle.
13. Exécutez les échantillons sur le cytomètre en flux; collecter un total de 25 000 lymphocytes.
14. Créez une feuille de calcul globale du modèle d’analyse pour les exemples.
15. Utilisez l’exemple de stratégie de contrôle suivant :
    1. À l’aide d’un diagramme de points CD45/zone de diffusion latérale (SSC-A), dessinez la porte polygonale pour identifier la population de lymphocytes intacts tout en excluant les débris.
    2. À l’aide d’un diagramme à points CD3/CD19, dessinez une porte rectangulaire pour sélectionner les lymphocytes T CD3+ et les lymphocytes B CD19⁺.
    3. À l’aide d’un diagramme à points CD4/CD8, dessinez une porte quadruple pour sélectionner les lymphocytes T CD4+ ou CD8⁺ (cellules à fluorescence élevée pour ces marqueurs, respectivement).
    4. À l’aide d’un diagramme à points CD45RA/CD27, dessinez une porte quadruple pour subdiviser les lymphocytes T CD8+ ou CD4+ en cellules T naïves (CD27⁺CD45RA+), T_CM (CD27+ CD45RA-), T_EM (CD27-CD45RA^-) et T_EMRA (CD27-CD45RA⁺).
    5. À l’aide d’un diagramme à points CD25/CD127, dessinez une porte quadruple pour subdiviser les lymphocytes T CD4⁺ en cellules Treg (CD4+CD25+⁺CD127^faible).
    6. À l’aide d’un diagramme à points CD27/IgD, dessinez une porte quadruple pour subdiviser les cellules B CD19+ en cellules B naïves (CD27-IgD+) et en cellules B mémoire (CD27⁺IgD^-).
16. Enregistrez le modèle expérimental sur le cytomètre A.
17. Utilisez le CD-ROM pour exporter le modèle expérimental.

5. Transfert du gabarit expérimental au cytomètre B dans le laboratoire de la méthode d’essai

REMARQUE: Le modèle expérimental comprend les paramètres de l’instrument, le modèle d’analyse et le modèle de valeur cible de l’intensité de fluorescence médiane (MFI).

1. Effectuez une vérification des performances à l’aide de perles CST pour vérifier que le cytomètre fonctionne bien.
2. Importez le modèle expérimental et créez une expérience pour le cytomètre B à l’aide du modèle.
3. Utilisez le même lot de billes CST pour ajuster les tensions des paramètres fluorescents pour chaque canal de fluorescence afin qu’elles correspondent à l’instrument MFI précédent.
   NOTE: Les valeurs de l’IMF varient dans les ±5% (l’IMF des perles brillantes avant et après le transfert est indiquée dans le tableau 2).
4. Ajustez la tension pour FSC en utilisant l’échantillon non coloré, si nécessaire.
5. Cliquez avec le bouton droit sur les paramètres du cytomètre expérimental et choisissez Paramètres de l’application pour enregistrer les paramètres de l’application.
6. Utilisez CD45RA APC pour modifier la valeur de compensation de R718 à 15% APC. Utilisez CD19 BB700 pour modifier la valeur de compensation de l’APC-H7 à 24 % BB700. Utilisez CD8 R718 pour modifier la valeur de compensation de l’APC-H7 à 60 % R718.
7. Exécutez les échantillons sur le cytomètre en flux; collecter un total de 25 000 lymphocytes.

6. Cohérence entre les résultats expérimentaux obtenus sur les deux cytomètres

1. Évaluer les différences dans les sous-ensembles de lymphocytes entre les instruments à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle (p < 0,05).

Résultats

La figure 1 montre une feuille de calcul globale du modèle de valeur cible pour les perles brillantes CST. À l’aide d’un tracé FSC/SSC, une porte polygonale est dessinée pour sélectionner les perles brillantes CST. Des diagrammes d’histogramme de 10 canaux de fluorescence ont été obtenus pour les billes brillantes CST : FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 et BV605. La valeur cible pour chaque paramètre est affichée en montrant la médiane dans les portes de...

Discussion

L’immunophénotypage de sous-ensembles de lymphocytes du sang périphérique peut aider à comprendre les changements dans l’immunité adaptative à médiation cellulaire après la vaccination chez les enfants. Dans les applications cliniques, des situations inattendues se produisent, telles que l’incapacité de détecter les échantillons en temps opportun ou le remplacement d’un cytomètre en flux; Par conséquent, des méthodes normalisées rapides qui facilitent les transferts entre cytomètres en flux dans

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube