Japon Ensefaliti Aşılı Çocuklarda Lenfositlerin Tespiti için Akış Sitometreleri Arasında Laboratuvarlar Arasında Transferin Standardizasyonu

Özet

Bu çalışmada, Japon ensefalit aşılı çocuklarda lenfositlerin tespiti için iki laboratuvarda iki akış sitometresi arasında deneysel ortamların ve analiz şablonlarının transferini kolaylaştırmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Akış sitometresi deneyleri için standardizasyon yöntemi, araştırma projelerinin birden fazla merkezde etkili bir şekilde yürütülmesini sağlayacaktır.

Özet

Giderek artan sayıda laboratuvarın, özellikle birden fazla merkezde gerçekleştirilen araştırma projeleri için çoklu akış sitometrelerinden veri toplaması gerekmektedir. Farklı laboratuvarlarda iki akış sitometresi kullanmanın zorlukları, standartlaştırılmış malzemelerin eksikliğini, yazılım uyumluluk sorunlarını, cihaz kurulumundaki tutarsızlıkları ve farklı akış sitometreleri için farklı konfigürasyonların kullanılmasını içerir. Birden fazla merkezde deneysel sonuçların tutarlılığını ve karşılaştırılabilirliğini sağlamak için standartlaştırılmış bir akış sitometrisi deneyi oluşturmak için, parametreleri farklı akış sitometreleri arasında aktarmak için hızlı ve uygulanabilir bir standardizasyon yöntemi oluşturulmuştur.

Bu çalışmada geliştirilen yöntemler, Japon ensefaliti (JE) aşılı çocuklarda lenfositlerin tespiti için farklı laboratuvarlardaki iki akış sitometresi arasında deneysel ortamların ve analiz şablonlarının aktarılmasına olanak sağlamıştır. Sitometre ayarlarını oluşturmak için floresan standart boncuklar kullanılarak iki sitometre arasında tutarlı bir floresan yoğunluğu elde edildi. Farklı cihaz tiplerine sahip iki laboratuvarda karşılaştırılabilir sonuçlar elde edilmiştir. Bu yöntemi kullanarak, Je aşılı çocukların bağışıklık fonksiyonlarını farklı laboratuvarlarda farklı aletlerle değerlendirmek için analizleri standartlaştırabilir, birden fazla merkezdeki akış sitometreleri arasındaki veri ve sonuç farklılıklarını azaltabilir ve laboratuvar sonuçlarının karşılıklı akreditasyonu için uygulanabilir bir yaklaşım sağlayabiliriz. Akış sitometresi deneylerinin standardizasyon yöntemi, araştırma projelerinin birden fazla merkezde etkili bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlayacaktır.

Giriş

Akış sitometrisinin standardizasyonu, farklı laboratuvarlar ve çalışma merkezleri arasında farklı sitometrelerden elde edilen sonuçların karşılaştırılabilirliği için yararlıdır ve iş verimliliğini artırmak için sonuçların karşılıklı olarak tanınmasına elverişlidir. Giderek artan sayıda senaryo standardizasyon gerektirmektedir. İlaç geliştirme sürecinde, akış sitometrisi standardizasyonu önemlidir, çünkü geliştirilmiş ve doğrulanmış bir tahlil, klinik öncesi analizden klinik analize kadar tüm ilaç geliştirme sürecini destekleyecektir. Akış sitometrik yöntemleri sıklıkla ilaç endüstrisi ile işbirliği yapan laboratuvarlar arasında aktarılır¹. Ayrıca, çok merkezli klinik çalışmalardan karşılaştırılabilir veriler elde etmek esastır. Örneğin, çok merkezli akış sitometrisi^2'den karşılaştırılabilir veriler elde etmek için Sistemik Otoimmün Hastalıklar Çok Merkezli Klinik Araştırma Projesi'nde bir standardizasyon iş akışı geliştirilmiştir.

Akım sitometri yöntemlerinin standardizasyonu zordur. Laboratuvarlarda yaşanan zorluklar, standartlaştırılmış malzemelerin eksikliğine, yazılım uyumluluğu sorunlarına, cihaz kurulumundaki tutarsızlıklara ve farklı akış sitometreleri arasında farklı konfigürasyonların kullanılmasına ve merkezler arasındaki farklı geçiş stratejilerine bağlanmaktadır ^3,4. Bu nedenle, laboratuvarlar arasında bir boşluk analizi yapmak önemlidir. Numune erişimi, kalite sistemleri, personel nitelikleri ve cihaz konfigürasyonu, gereksinimlerin karşılandığından emin olmak için gözden geçirilmelidir.

Şu anda, Japon ensefaliti (JE) aşısı ile aşılanan çocuklar, JE⁵ insidansında önemli ölçüde azalmaya sahiptir. Periferik kan immün hücrelerinin izlenmesi, aşılama sonrası hücre aracılı adaptif bağışıklıktaki değişiklikleri ve periferik kan lenfosit alt kümelerindeki değişiklikler ile aşılamanın etkileri arasındaki korelasyonu anlamaya yardımcı olabilir. Tam kan örneklerinin sınırlı stabilitesi nedeniyle, aşı etkinliğinin değerlendirilmesi genellikle birden fazla merkezde yapılmaktadır. Bu analiz için naif CD8+ veya CD4+ T hücrelerini CD27+ CD45RA⁺, merkezi bellek T hücrelerini (T CM) CD27+ CD45RA-, efektör bellek T hücrelerini (T_EM) CD27- CD45RA-, terminal olarak farklılaşmış efektör bellek T hücrelerini (T EMRA) CD27^- CD45RA⁺ olarak tanımladık. CD19⁺ B hücreleri, CD27'yi IgD 6,7'ye karşı eksprese eden popülasyonlara ayrılabilir, naif B hücreleri CD27n bellek B hücrelerini (mBC'ler) eksprese eder^, IgD^6'nın ekspresyonuna dayanarak tanımlanabilir ve düzenleyici T hücreleri (Tregs) CD4 + CD25 ^{+ +} CD127^{düşük 8} olarak tanımlanabilir. Birden fazla merkezde deneysel sonuçların tutarlılığını ve karşılaştırılabilirliğini sağlamak için standartlaştırılmış bir akış sitometrisi deneyi oluşturmak için, Je aşılı çocukların tam kanındaki lenfositlerin tespiti için protokollerin farklı akış sitometreleri arasında transferini kolaylaştırmak için hızlı ve uygulanabilir bir standardizasyon yöntemi oluşturulmuştur. Altı sağlıklı çocuk (2 yaşında) Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Çocuk Hastanesi'nden işe alındı. 6 aydan daha kısa bir süre önce canlı zayıflatılmış bir JE SA14-14-2 aşısı ile bir prime ve boost aşılaması aldıktan sonra, gönüllülerden periferik kan örnekleri toplandı. Çok merkezli değerlendirmeler için yararlı olan standartlaştırılmış prosedürleri takip eden farklı araçlardan son derece karşılaştırılabilir veriler elde edilmiştir.

Protokol

Çalışma, Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Çocuk Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay Numarası: 2020-k-85). Bu çalışmada sadece klinik testlerden sonra kalıntı örnekler kullanıldığı için insan deneklerin bilgilendirilmiş onamından feragat edilmiştir. Bu çalışmada iki laboratuvar yer almaktadır. Transfer laboratuvarı , standartlaştırılmış yöntemin bir akış sitometresi kullanılarak geliştirildiği yerdir. Bu laboratuvardaki sitometre bundan böyle sitometre A olarak anılacaktır. Test yöntemi laboratuvarı , başka bir akış sitometresi kullanarak yöntemleri alan laboratuvardır ve bu laboratuvardaki sitometre bundan böyle sitometre B olarak anılacaktır.

1. Periferik kan örneği toplama ve hücre hazırlama

1. Standart venipunktur ile EDTA-K 2-antikoagüle tüplerde JE aşılı çocuklardan ve aşılanmamış çocuklardan periferik kan örnekleri (₂ mL) toplayın.
2. Tüpleri 10x baş aşağı çevirerek tam kan örneğini karıştırın. 12 mm x 75 mm'lik bir tüpe 100 μL tam kan ekleyin. Her örneği kopya halinde yapın.
3. 12 mm x 75 mm'lik bir tüpe 10 μL parlak leke tamponu (BV tamponu) ekleyin. BV tamponuna her bir antikorun 5 μL'sini (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; seyreltme faktörü: 1:20) ve 20 μL antikor (CD25, CD45RA; seyreltme faktörü: 1:5) ekleyin. Vorteks nazikçe girdap.
   NOT: Antikor reaktiflerinin hacimleri ve bilgileri Tablo 1'de gösterilmiştir.
4. Antikor kokteylini tam kan örneği ile tüpe ekleyin. Vorteksi nazikçe yapın ve karanlıkta 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
5. 1x lizing çözeltisi hazırlamak için 10x lizing çözeltisini 1:10 damıtılmış suyla seyreltin. 2 mL 1x lizing çözeltisi ekleyerek kan örneklerini lize edin. Vorteksi nazikçe yapın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika kuluçkaya yatırın.
6. 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı boşaltın.
7. Peleti 2 mL 1x PBS'de yeniden askıya alın, 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı boşaltın.
8. Peleti 0,5 mL 1x PBS içinde yeniden askıya alın ve iyice karıştırın. 2 °C ila 8 °C'de saklayın. Numuneleri akış sitometrik analizi için iki laboratuvara gönderin.
   NOT: Negatif kontrol numunesi ve hücre tek lekeli kontrol aynı anda işlenmelidir.

2. Kompanzasyon boncuklarının hazırlanması ve tek lekeli kontrol

1. Label V500-anti-CD45 tek lekeli, APC-H7-anti-CD3 tek lekeli, FITC-anti-CD4 tek lekeli, R718-anti-CD8 tek boyalı, BV605-anti-CD27 tek boyalı, APC-anti-CD45RA tek boyalı, PE-anti-CD25 tek lekeli, BV421-anti-CD127 tek lekeli, BB700-anti-CD19 tek lekeli ve PE-CY7-anti-IgD tek lekeli tüpler.
2. 5 mL'lik yuvarlak tabanlı polistiren test tüpüne% 1 fetal sığır serumu (FBS) içeren 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) tamponundan 100 μL ekleyin.
3. Her tüpe ve girdaba 50 μL negatif boncuk ve 50 μL fare karşıtı Ig, κ boncuk ekleyin.
4. Tek boyalı bir tüpe her etiketli antikorun (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) 2 μL'sini ekleyin. Karışımı nazikçe vorteksleyin ve oda sıcaklığında (20 ° C ila 25 ° C) karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın.
5. Boncukları 2 mL 1x PBS'de yeniden askıya alın, 5 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj yapın ve süpernatanı boşaltın.
6. Boncukları 0,5 mL 1x PBS ile yeniden askıya alın ve iyice karıştırın. 2 °C ila 8 °C'de saklayın.

3. İki laboratuvarda farklı sitometrelerde aynı konfigürasyon adlarını kullanma

1. Sitometre yazılımında yeni bir konfigürasyon oluşturun A. Sitometre düğmesine tıklayın ve konfigürasyon penceresini görüntülemek için Konfigürasyonları görüntüle'yi seçin.
2. Yapılandırma listesinde, temel yapılandırmalar klasörünü sağ tıklatın, Yeni Klasör'ü seçin ve yeniden adlandırın.
3. Temel yapılandırmayı sağ tıklatın ve kopyala'yı seçin.
4. Yeni klasörü sağ tıklatın ve yeni bir yapılandırma oluşturmak için temel yapılandırmayı yapıştırın. Yeni yapılandırmayı "Standartlaştırılmış Yöntem Aktarımı" olarak yeniden adlandırın.
5. FITC gibi parametre adını Parametreler listesinden uygun algılayıcıya (530/30) sürükleyin.
6. Ek parametreleri (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 ve BV605) yeni yapılandırmada düzenleyin.
7. Aynı adı "Standartlaştırılmış Yöntem Aktarımı" kullanan farklı bir akış sitometresi modelinde yeni bir yapılandırma oluşturmak için bu yöntemi izleyin. Yapılandırmanın her dedektör için aynı parametreleri içerdiğinden emin olun.
   NOT: İki farklı akış sitometresi modelinde deney şablonunu başarıyla tanımlamak için, adın tutarlı olduğundan emin olun.
8. Sitometre yapılandırmaları altında, sitometre taban çizgisini tanımlamak ve sitometre performansını izlemek için sitometre kurulum ve izleme (CST) boncuklarını kullanın. Sitometre düğmesine tıklayın ve sitometre kurulum ve izleme çalışma alanını görüntülemek için CST'yi seçin.
9. 5 mL'lik yuvarlak tabanlı polistiren test tüpünde 0,5 mL 1x PBS'ye üç damla (150 μL) kurulum boncuğu ekleyin. Boncuk tüpünü sitometreye yerleştirin.
10. Kurulum Denetimi penceresinde, Temeli Tanımla'yı seçin ve Çalıştır'ı tıklatın.

4. Transfer laboratuvarında sitometre A kullanarak deneyi standartlaştırma

1. Sitometre kurulumunu kullanarak bir performans kontrolü yapın ve sitometrenin iyi performans gösterdiğini doğrulamak için boncukları izleyin.
2. Yazılım tarayıcı penceresinde, sitometre ayarlarına sağ tıklayın ve bir çalışma sayfası oluşturmak için Uygulama Ayarları'nı seçin.
3. Lekesiz bir numune kullanarak FSC, SSC ve tüm floresan parametrelerinin fotoçarpan tüpü (PMT) voltajlarını ayarlayın. FSC: 260; SSC: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; APC: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; ve BV605: 505.
4. Deneme sitometresi ayarlarına sağ tıklayın ve kaydetmek için uygulama ayarlarını seçin.
5. Deneme düğmesine tıklayın ve telafi ayarları menüsünü seçin. Ardından, ücret denetimlerini otomatik olarak eklemek için Ücret denetimleri oluştur'u seçin.
6. Tüm kompanzasyon kontrol boncukları için verileri kaydedin.
7. Denemeye tıklayın ve telafi kurulumunu seçin. Ardından, ücreti otomatik olarak hesaplayın.
8. Hücre tek lekeli kontroller için verileri kaydedin.
9. R718'in telafi değerini %15 APC olarak değiştirmek için CD45RA APC kullanın. APC-H7'nin telafi değerini %14 BB700 olarak değiştirmek için CD19 BB700 kullanın. APC-H7'nin telafi değerini %60 R718 olarak değiştirmek için CD8 R718'i kullanın.
10. CST boncukları için verileri kaydedin.
11. CST parlak boncuklar için hedef değer şablonunun genel bir çalışma sayfasını oluşturun.
12. FSC/SSC grafiği kullanarak, CST parlak boncukları için çokgen kapısını çizin. CST parlak boncukları için 10 floresan kanalının histogram grafiklerini elde edin: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 ve BV605. Histogram grafiklerinde aralık geçitleri oluşturun. Aralık geçitlerinin medyanını göstererek istatistik görünümünü oluşturun.
13. Örnekleri akış sitometresinde çalıştırın; toplam 25.000 lenfosit toplamak.
14. Örnekler için çözümleme şablonunun genel bir çalışma sayfasını oluşturun.
15. Aşağıdaki örnek geçit stratejisini kullanın:
    1. CD45/yan dağılım alanı (SSC-A) nokta grafiği kullanarak, enkazı hariç tutarken sağlam lenfosit popülasyonunu tanımlamak için çokgen kapısını çizin.
    2. CD3/CD19 nokta grafiği kullanarak, CD3⁺ T hücrelerini ve CD19⁺ B hücrelerini seçmek için dikdörtgen bir kapı çizin.
    3. CD4/CD8 nokta grafiği kullanarak, CD4⁺ veya CD8⁺ T hücrelerini (sırasıyla bu belirteçler için yüksek floresansa sahip hücreler) seçmek için dörtlü bir kapı çizin.
    4. CD45RA/CD27 nokta grafiği kullanarak, CD8+ veya CD4+ T hücrelerini naif (CD27+CD45RA+), T_CM (CD27⁺ CD45RA-), T_EM ^(CD27-CD45RA-) ve T_EPRA (CD27-CD45RA⁺) hücrelerine bölmek için dörtlü bir kapı çizin.
    5. CD25/CD127 nokta grafiği kullanarak, CD4+ T hücrelerini Treg hücrelerine (CD4+CD25⁺⁺CD127^düşük) bölmek için dörtlü bir kapı çizin.
    6. CD27/IgD nokta grafiği kullanarak, ^CD19+ B hücrelerini naif B hücrelerine (CD27-IgD+) ve bellek B hücrelerine (CD27⁺IgD^-) bölmek için dörtlü bir kapı çizin.
16. Deneysel şablonu sitometre A'ya kaydedin.
17. Deneysel şablonu dışa aktarmak için CD-ROM'u kullanın.

5. Deney şablonunun test yöntemi laboratuvarında sitometre B'ye aktarılması

NOT: Deneysel şablon, cihaz ayarlarını, analiz şablonunu ve medyan floresan yoğunluğunun (MFI) hedef değer şablonunu içerir.

1. Sitometrenin iyi performans gösterdiğini doğrulamak için CST boncuklarını kullanarak bir performans kontrolü yapın.
2. Deneysel şablonu içe aktarın ve şablonu kullanarak B sitometresi için bir deneme oluşturun.
3. Her floresan kanalı için floresan parametre voltajlarını önceki MFI cihazıyla eşleşecek şekilde ayarlamak için aynı sayıda CST boncuğu kullanın.
   NOT: MFI değerleri %±5 arasında değişmektedir (aktarımdan önce ve sonra parlak boncukların MFI'sı Tablo 2'de gösterilmiştir).
4. Gerekirse lekesiz numuneyi kullanarak FSC voltajını ayarlayın.
5. Deneysel sitometre ayarlarına sağ tıklayın ve uygulama ayarlarını kaydetmek için uygulama ayarlarını seçin.
6. R718'in telafi değerini %15 APC olarak değiştirmek için CD45RA APC kullanın. APC-H7'nin telafi değerini %24 BB700 olarak değiştirmek için CD19 BB700 kullanın. APC-H7'nin telafi değerini %60 R718 olarak değiştirmek için CD8 R718'i kullanın.
7. Örnekleri akış sitometresinde çalıştırın; toplam 25.000 lenfosit toplamak.

6. İki sitometrede elde edilen deneysel sonuçlar arasındaki tutarlılık

1. Tek yönlü ANOVA kullanarak aletler arasındaki lenfosit alt gruplarındaki farklılıkları değerlendirin (p < 0.05).

Sonuçlar

Şekil 1'de, CST parlak boncukları için hedef değer şablonunun genel bir çalışma sayfası gösterilmektedir. Bir FSC/SSC grafiği kullanılarak, CST parlak boncuklarını seçmek için bir çokgen kapısı çizilir. CST parlak boncuklar için 10 floresan kanalının histogram grafikleri elde edildi: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 ve BV605. Her parametre için hedef değer, Tablo 2'deki histogram kapıları içindeki medyan gösterilerek görü...

Tartışmalar

Periferik kan lenfosit alt gruplarının immünofenotiplenmesi, çocuklarda aşılama sonrası hücre aracılı adaptif bağışıklıktaki değişikliklerin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Klinik uygulamalarda, numunelerin zamanında tespit edilememesi veya bir akış sitometresinin değiştirilmesi gibi beklenmeyen durumlar ortaya çıkar; bu nedenle, farklı laboratuvarlardaki akış sitometreleri arasında transferleri kolaylaştıran hızlı standartlaştırılmış yöntemlere ihtiyaç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube