Стандартизация переноса между лабораториями проточных цитометров для обнаружения лимфоцитов у детей, вакцинированных против японского энцефалита

Резюме

В этом исследовании был разработан метод, облегчающий перенос экспериментальных настроек и шаблонов анализа между двумя проточными цитометрами в двух лабораториях для обнаружения лимфоцитов у детей, вакцинированных японским энцефалитом. Метод стандартизации экспериментов с проточным цитометром позволит эффективно проводить исследовательские проекты в нескольких центрах.

Аннотация

Все большему числу лабораторий необходимо собирать данные с нескольких проточных цитометров, особенно для исследовательских проектов, выполняемых в нескольких центрах. Проблемы использования двух проточных цитометров в разных лабораториях включают отсутствие стандартизированных материалов, проблемы совместимости программного обеспечения, несоответствия в настройке прибора и использование разных конфигураций для разных проточных цитометров. Для проведения стандартизированного эксперимента по проточной цитометрии для достижения согласованности и сопоставимости экспериментальных результатов в нескольких центрах был создан быстрый и осуществимый метод стандартизации для переноса параметров между различными проточными цитометрами.

Методы, разработанные в этом исследовании, позволили перенести экспериментальные настройки и шаблоны анализа между двумя проточными цитометрами в разных лабораториях для обнаружения лимфоцитов у детей, вакцинированных против японского энцефалита (ЯЭ). Между двумя цитометрами была получена постоянная интенсивность флуоресценции с использованием стандартных флуоресцентных шариков для установления настроек цитометра. Сопоставимые результаты были получены в двух лабораториях с разными типами приборов. Используя этот метод, мы можем стандартизировать анализ для оценки иммунной функции детей, вакцинированных ЯЭ, в разных лабораториях с разными инструментами, уменьшить различия в данных и результатах между проточными цитометрами в нескольких центрах и обеспечить осуществимый подход к взаимной аккредитации результатов лабораторных исследований. Метод стандартизации экспериментов с проточным цитометром обеспечит эффективное выполнение исследовательских проектов в нескольких центрах.

Введение

Стандартизация проточной цитометрии полезна для сопоставимости результатов, полученных от разных цитометров в разных лабораториях и исследовательских центрах, и способствует взаимному признанию результатов для повышения эффективности работы. Все большее число сценариев требует стандартизации. В процессе разработки лекарств важна стандартизация проточной цитометрии, поскольку разработанный и валидированный анализ будет поддерживать весь процесс разработки лекарств от доклинического до клинического анализа. Проточные цитометрические методы часто передаются между фармацевтической промышленностью и сотрудничающими лабораториями¹. Кроме того, важно получить сопоставимые данные многоцентровых клинических исследований. Например, в рамках многоцентрового проекта клинических исследований системных аутоиммунных заболеваний был разработан рабочий процесс стандартизации для получения сопоставимых данных многоцентровой проточной цитометрии².

Стандартизация методов проточной цитометрии является сложной задачей. Проблемы, с которыми сталкиваются лаборатории, связаны с отсутствием стандартизированных материалов, проблемами совместимости программного обеспечения, несоответствиями в настройке приборов и использованием различных конфигураций между различными проточными цитометрами и расходящимися стратегиями стробирования между центрами ^3,4. Поэтому важно провести анализ пробелов между лабораториями. Доступ к образцам, системы качества, квалификация персонала и конфигурация приборов должны быть проверены, чтобы убедиться в соблюдении требований.

В настоящее время у детей, привитых вакциной против японского энцефалита (ЯЭ), значительно снижается заболеваемость ЯЭ⁵. Мониторинг иммунных клеток периферической крови может помочь понять изменения клеточно-опосредованного адаптивного иммунитета после вакцинации и корреляцию между изменениями в подмножествах лимфоцитов периферической крови и эффектами вакцинации. Из-за ограниченной стабильности образцов цельной крови оценка эффективности вакцины часто проводится в нескольких центрах. Для этого анализа мы определили наивные CD8+ или CD4+ Т-клетки как CD27+ CD45RA+, Т-клетки центральной памяти (T CM) как CD27+ CD45RA^{-, эффекторные} Т-клетки памяти (T_EM) как CD27-CD45RA-, а терминально дифференцированные эффекторные Т-клетки памяти (T_EMRA) как CD27-CD45RA⁺. CD19⁺ В-клетки могут быть разделены на популяции, которые экспрессируют CD27 по сравнению с IgD ^6,7, наивные В-клетки экспрессируют CD27n В-клетки памяти (mBCs) могут быть идентифицированы на основе экспрессии IgD^6, а регуляторные Т-клетки (Tregs) могут быть идентифицированы как CD4 ⁺ CD25 ⁺⁺ CD127^{с низким 8}. Для проведения стандартизированного эксперимента по проточной цитометрии для достижения согласованности и сопоставимости экспериментальных результатов в нескольких центрах был создан быстрый и осуществимый метод стандартизации для облегчения передачи протоколов между различными проточными цитометрами для обнаружения лимфоцитов в цельной крови детей, вакцинированных ЯЭ. Шесть здоровых детей (2 года) были набраны из Пекинской детской больницы Столичного медицинского университета. После первичной и бустерной вакцинации живой аттенуированной вакциной JE SA14-14-2 менее чем за 6 месяцев до этого у добровольцев были взяты образцы периферической крови. Высокосопоставимые данные были получены из различных инструментов в соответствии со стандартизированными процедурами, что полезно для многоцентровых оценок.

протокол

Исследование было одобрено Комитетом по этике Пекинской детской больницы Столичного медицинского университета (номер одобрения: 2020-k-85). Информированное согласие людей было отменено, поскольку в этом исследовании использовались только остаточные образцы после клинических испытаний. В этом исследовании участвуют две лаборатории. В передаточной лаборатории был разработан стандартизированный метод с использованием одного проточного цитометра. Цитометр в этой лаборатории в дальнейшем именуется цитометром А. Лаборатория метода испытаний - это лаборатория, которая получает методы с использованием другого проточного цитометра, и цитометр в этой лаборатории в дальнейшем именуется цитометром B.

1. Сбор образцов периферической крови и подготовка клеток

1. Собирают образцы периферической крови (2 мл) у детей, вакцинированных ЯЭ, и невакцинированных детей в 2-антикоагулянтные пробирки ЭДТА-К с помощью стандартной венепункции.
2. Смешайте образец цельной крови, перевернув пробирки вверх дном в 10 раз. Добавьте 100 мкл цельной крови в пробирку размером 12 мм x 75 мм. Сделайте каждый образец в двух экземплярах.
3. Добавьте 10 мкл блестящего буфера для окрашивания (буфер BV) в тюбик размером 12 мм x 75 мм. Добавьте 5 мкл каждого антитела (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; коэффициент разведения: 1:20) и 20 мкл антитела (CD25, CD45RA; коэффициент разведения: 1:5) в буфер BV. Осторожно вихряйте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы и информация о реагентах антител приведены в таблице 1.
4. Добавьте коктейль антител в пробирку с образцом цельной крови. Осторожно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте.
5. Разбавьте 10-кратный лизирующий раствор 1:10 дистиллированной водой, чтобы приготовить 1-кратный лизирующий раствор. Лизируют образцы крови, добавляя 2 мл 1x лизирующего раствора. Осторожно перемешайте и инкубируйте в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре.
6. Центрифугу при 300 × г в течение 5 мин и сцедить надосадочную жидкость.
7. Ресуспендируют гранулу в 2 мл 1x PBS, центрифугу при 300 × г в течение 5 мин и декантируют надосадочную жидкость.
8. Ресуспендировать гранулы в 0,5 мл 1x PBS и тщательно перемешать. Хранить при температуре от 2 °C до 8 °C. Отправьте образцы в две лаборатории для проточного цитометрического анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отрицательный контрольный образец и одноцветный контроль клеток должны обрабатываться одновременно.

2. Подготовка компенсационных бусин и одинарного контроля

1. Этикетка V500-анти-CD45 одноокрашенный, APC-H7-анти-CD3 одноокрашенный, FITC-анти-CD4 одноокрашенный, R718-анти-CD8 одноокрашенный, BV605-анти-CD27 одноокрашенный, APC-анти-CD45RA одноокрашенный, PE-анти-CD25 одноокрашенный, BV421-анти-CD127 одноокрашенный, BB700-анти-CD19 одноокрашенный и PE-CY7-анти-IgD одноокрашенный.
2. Добавьте 100 мкл 1x буфера с фосфатным буфером (DPBS) Dulbecco, содержащего 1% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), в пробирку из полистирола с круглым дном.
3. Добавьте 50 мкл отрицательных шариков и 50 мкл антимышиных шариков Ig, κ в каждую трубку и вихрь.
4. Добавьте 2 мкл каждого меченого антитела (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) в однотонную пробирку. Аккуратно перемешайте смесь и инкубируйте в течение 15 минут в темноте при комнатной температуре (от 20 ° C до 25 ° C).
5. Ресуспендируют шарики в 2 мл 1x PBS, центрифугу при 300 × г в течение 5 мин и декантируют надосадочную жидкость.
6. Ресуспендируйте шарики в 0,5 мл 1x PBS и тщательно перемешайте. Хранить при температуре от 2 °C до 8 °C.

3. Использование одинаковых названий конфигураций на разных цитометрах в двух лабораториях

1. Создайте новую конфигурацию в программном обеспечении цитометра А. Нажмите кнопку « Цитометр » и выберите «Просмотреть конфигурации», чтобы отобразить окно конфигурации.
2. В списке конфигураций щелкните правой кнопкой мыши папку базовых конфигураций, выберите пункт Создать папку и переименуйте ее.
3. Щелкните правой кнопкой мыши базовую конфигурацию и выберите «Копировать».
4. Щелкните правой кнопкой мыши новую папку и вставьте базовую конфигурацию, чтобы создать новую конфигурацию. Переименуйте новую конфигурацию в "Standardized Method Transfer".
5. Перетащите имя параметра, например FITC, из списка Параметры на соответствующий детектор (530/30).
6. Измените дополнительные параметры (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 и BV605) в новой конфигурации.
7. Следуйте этому методу, чтобы создать новую конфигурацию на другой модели проточного цитометра, используя то же имя «Стандартизированный перенос метода». Убедитесь, что конфигурация включает одинаковые параметры для каждого датчика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы успешно идентифицировать шаблон эксперимента на двух разных моделях проточных цитометров, убедитесь, что имя совпадает.
8. В конфигурациях цитометра используйте шарики настройки и отслеживания цитометра (CST) для определения базового уровня цитометра и отслеживания производительности цитометра. Нажмите кнопку «Цитометр » и выберите CST , чтобы отобразить рабочее пространство настройки и отслеживания цитометра.
9. Добавьте три капли (150 мкл) установочных шариков в 0,5 мл 1x PBS в пробирке из полистирола с круглым дном объемом 5 мл. Поместите пробирку с шариками на цитометр.
10. В окне " Управление установкой " выберите "Определить базовую линию" и нажмите кнопку "Выполнить".

4. Стандартизация эксперимента с использованием цитометра А в передающей лаборатории

1. Запустите проверку производительности с помощью настройки цитометра и контрольных шариков, чтобы убедиться, что цитометр работает хорошо.
2. В окне браузера программного обеспечения щелкните правой кнопкой мыши настройки цитометра и выберите « Параметры приложения », чтобы создать рабочий лист.
3. Используя неокрашенный образец, отрегулируйте напряжение фотоумножителя (ФЭУ) FSC, SSC и всех параметров флуоресценции. КФС: 260; КСК: 460; ФИТК: 490; ПЭ: 575; ВВ700: 620; PE-CY7: 640; БТР: 600; Р718: 620; БТР-Н7: 620; БВ421: 466; В500: 420; и BV605: 505.
4. Щелкните правой кнопкой мыши параметры экспериментального цитометра и выберите параметры приложения , чтобы сохранить его.
5. Нажмите на кнопку эксперимента и выберите меню настройки компенсации . Затем выберите Создать элементы управления компенсацией, чтобы автоматически добавить элементы управления компенсацией .
6. Записывайте данные для всех контрольных шариков компенсации.
7. Нажмите на эксперимент и выберите настройку компенсации. Затем рассчитайте компенсацию автоматически.
8. Запись данных для элементов управления с одним окрашиванием.
9. Используйте CD45RA APC для изменения значения компенсации R718 до 15% APC. Используйте CD19 BB700 для изменения значения компенсации APC-H7 до 14% BB700. Используйте CD8 R718 для изменения значения компенсации APC-H7 до 60% R718.
10. Запишите данные для бусин CST.
11. Создайте глобальный рабочий лист шаблона целевого значения для ярких бусин CST.
12. Используя график FSC/SSC, нарисуйте полигональные ворота для ярких бусин CST. Получите графики гистограммы 10 каналов флуоресценции для ярких шариков CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 и BV605. Создайте интервальные ворота на графиках гистограммы. Создайте представление статистики, показав медиану интервальных вентилей.
13. Запустите образцы на проточном цитометре; Соберите в общей сложности 25 000 лимфоцитов.
14. Создайте глобальный лист шаблона анализа для образцов.
15. Используйте следующий пример стратегии стробирования:
    1. Используя точечную диаграмму CD45/боковой зоны рассеяния (SSC-A), нарисуйте полигональные ворота, чтобы идентифицировать популяцию интактных лимфоцитов, исключив при этом мусор.
    2. Используя точечную диаграмму CD3/CD19, нарисуйте прямоугольные ворота, чтобы выбрать CD3+ Т-клетки и CD19⁺ В-клетки.
    3. Используя точечный график CD4/CD8, нарисуйте квадратный затвор, чтобы выбрать CD4+ или CD8⁺ Т-клетки (клетки с высокой флуоресценцией для этих маркеров соответственно).
    4. Используя точечную диаграмму CD45RA/CD27, нарисуйте четыре затвора для разделения CD8+ или CD4+ Т-клеток на наивные (CD27⁺CD45RA⁺), T_CM (CD27+ CD45RA-), T_EM (CD27-CD45RA-) и T_EMRA (CD27-CD45RA^{+) клетки}.
    5. Используя точечную диаграмму CD25/CD127, нарисуйте четыре затвора, чтобы разделить CD4⁺ Т-клетки на клетки Treg (CD4⁺CD25⁺⁺CD127^низкий).
    6. Используя точечный график CD27 / IgD, нарисуйте четыре ворота, чтобы разделить CD19+ В-клетки на наивные В-клетки (CD27-IgD⁺) и В-клетки памяти (CD27⁺IgD^-).
16. Сохраните экспериментальный шаблон на цитометре А.
17. Используйте компакт-диск для экспорта экспериментального шаблона.

5. Перенос экспериментального шаблона на цитометр Б в лаборатории методов испытаний

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальный шаблон включает в себя настройки прибора, шаблон анализа и шаблон целевого значения медианной интенсивности флуоресценции (MFI).

1. Проведите проверку производительности с помощью шариков CST, чтобы убедиться, что цитометр работает хорошо.
2. Импортируйте экспериментальный шаблон и создайте эксперимент для цитометра B, используя шаблон.
3. Используйте одну и ту же партию шариков CST для регулировки напряжений флуоресцентных параметров для каждого флуоресцентного канала в соответствии с предыдущим прибором MFI.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значения MFI варьируются в пределах ±5% (MFI ярких шариков до и после переноса показаны в таблице 2).
4. При необходимости отрегулируйте напряжение для FSC, используя неокрашенный образец.
5. Щелкните правой кнопкой мыши настройки экспериментального цитометра и выберите настройки приложения, чтобы сохранить настройки приложения .
6. Используйте CD45RA APC для изменения значения компенсации R718 до 15% APC. Используйте CD19 BB700 для изменения значения компенсации APC-H7 до 24% BB700. Используйте CD8 R718 для изменения значения компенсации APC-H7 до 60% R718.
7. Запустите образцы на проточном цитометре; Соберите в общей сложности 25 000 лимфоцитов.

6. Согласованность экспериментальных результатов, полученных на двух цитометрах

1. Оцените различия в подмножествах лимфоцитов между инструментами с помощью односторонней ANOVA (p < 0,05).

Результаты

На рисунке 1 показан глобальный рабочий лист шаблона целевого значения для ярких бусин CST. Используя график FSC/SSC, рисуются полигональные ворота для выбора ярких бусин CST. Для ярких шариков CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 и BV605 были получены графики гистограммы 10 каналов ?...

Обсуждение

Иммунофенотипирование подмножеств лимфоцитов периферической крови может помочь понять изменения клеточно-опосредованного адаптивного иммунитета после вакцинации у детей. В клинических применениях возникают непредвиденные ситуации, такие как несвоевременное обнаружение образцов ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube