Standardisierung des Transfers zwischen Laboren zwischen Durchflusszytometern zum Nachweis von Lymphozyten bei mit japanischer Enzephalitis geimpften Kindern

Zusammenfassung

In dieser Studie wurde eine Methode entwickelt, um den Transfer von Versuchssettings und Analyseschablonen zwischen zwei Durchflusszytometern in zwei Laboratorien zum Nachweis von Lymphozyten bei mit Japanischer Enzephalitis geimpften Kindern zu erleichtern. Die Standardisierungsmethode für die Durchflusszytometer-Experimente wird es ermöglichen, Forschungsprojekte in mehreren Zentren effektiv durchzuführen.

Zusammenfassung

Immer mehr Labore müssen Daten von mehreren Durchflusszytometern sammeln, insbesondere für Forschungsprojekte, die in mehreren Zentren durchgeführt werden. Zu den Herausforderungen bei der Verwendung von zwei Durchflusszytometern in verschiedenen Labors gehören das Fehlen standardisierter Materialien, Software-Kompatibilitätsprobleme, Inkonsistenzen bei der Geräteeinrichtung und die Verwendung unterschiedlicher Konfigurationen für verschiedene Durchflusszytometer. Um ein standardisiertes Durchflusszytometrie-Experiment zu etablieren, um die Konsistenz und Vergleichbarkeit der experimentellen Ergebnisse über mehrere Zentren hinweg zu erreichen, wurde eine schnelle und praktikable Standardisierungsmethode etabliert, um Parameter über verschiedene Durchflusszytometer hinweg zu übertragen.

Die in dieser Studie entwickelten Methoden ermöglichten den Transfer von Versuchssettings und Analyseschablonen zwischen zwei Durchflusszytometern in verschiedenen Laboratorien zum Nachweis von Lymphozyten bei Kindern, die mit Japanischer Enzephalitis (JE) geimpft wurden. Eine konsistente Fluoreszenzintensität wurde zwischen den beiden Zytometern unter Verwendung von Fluoreszenz-Standardkügelchen erhalten, um die Zytometereinstellungen festzulegen. Vergleichbare Ergebnisse wurden in zwei Laboratorien mit unterschiedlichen Instrumententypen erzielt. Mit dieser Methode können wir die Analyse zur Bewertung der Immunfunktion von JE-geimpften Kindern in verschiedenen Labors mit unterschiedlichen Instrumenten standardisieren, die Unterschiede in den Daten und Ergebnissen zwischen Durchflusszytometern in mehreren Zentren verringern und einen praktikablen Ansatz für die gegenseitige Akkreditierung von Laborergebnissen bieten. Die Standardisierungsmethode von Durchflusszytometer-Experimenten wird die effektive Durchführung von Forschungsprojekten über mehrere Zentren hinweg sicherstellen.

Einleitung

Die Standardisierung der Durchflusszytometrie ist nützlich für die Vergleichbarkeit von Ergebnissen, die von verschiedenen Zytometern in verschiedenen Labors und Studienzentren erhalten wurden, und fördert die gegenseitige Anerkennung von Ergebnissen, um die Arbeitseffizienz zu verbessern. Immer mehr Szenarien erfordern eine Standardisierung. Während des Arzneimittelentwicklungsprozesses ist die Standardisierung der Durchflusszytometrie wichtig, da ein entwickelter und validierter Assay den gesamten Arzneimittelentwicklungsprozess von der präklinischen bis zur klinischen Analyse unterstützt. Durchflusszytometrische Methoden werden häufig zwischen der pharmazeutischen Industrie und kooperierenden Laboratorien transferiert¹. Darüber hinaus ist es wichtig, vergleichbare Daten aus multizentrischen klinischen Studien zu erhalten. So wurde beispielsweise im Rahmen des Multizentrischen Klinischen Forschungsprojekts Systemische Autoimmunerkrankungen ein Standardisierungs-Workflow entwickelt, um vergleichbare Daten aus der multizentrischen Durchflusszytometrie² zu erhalten.

Die Standardisierung von Durchflusszytometrie-Methoden ist eine Herausforderung. Die Herausforderungen, mit denen die Labore konfrontiert sind, werden auf das Fehlen standardisierter Materialien, Software-Kompatibilitätsprobleme, Inkonsistenzen bei der Geräteeinrichtung und die Verwendung unterschiedlicher Konfigurationen zwischen verschiedenen Durchflusszytometern und divergierenden Gating-Strategien zwischen den Zentren zurückgeführt ^3,4. Daher ist es wichtig, eine Lückenanalyse zwischen den Laboren durchzuführen. Der Probenzugang, die Qualitätssysteme, die Qualifikation des Personals und die Gerätekonfiguration müssen überprüft werden, um sicherzustellen, dass die Anforderungen erfüllt werden.

Gegenwärtig haben Kinder, die mit dem Impfstoff gegen Japanische Enzephalitis (JE) geimpft wurden, eine signifikant reduzierte Inzidenz von JE⁵. Die Überwachung peripherer Blutimmunzellen kann helfen, die Veränderungen der zellvermittelten adaptiven Immunität nach der Impfung und die Korrelation zwischen den Veränderungen in peripheren Blutlymphozyten-Untergruppen und den Auswirkungen der Impfung zu verstehen. Aufgrund der begrenzten Stabilität von Vollblutproben werden die Evaluierungen der Wirksamkeit des Impfstoffs häufig in mehreren Zentren durchgeführt. Für diese Analyse definierten wir naive CD8+- oder CD4+-T-Zellen als CD27+ CD45RA+, zentrale Gedächtnis-T-Zellen (T_CM) als CD27+ CD45RA-, Effektor-Gedächtnis-T-Zellen (T_EM) als CD27-CD45RA- und terminal-differenzierte Effektorgedächtnis-T-Zellen (T_EMRA⁾ als CD27-CD45RA⁺. CD19⁺ B-Zellen können in Populationen unterteilt werden, die CD27 gegenüber IgD ^6,7 exprimieren, naive B-Zellen exprimieren CD27n-Gedächtnis-B-Zellen (mBCs) können basierend auf der Expression von IgD⁶ identifiziert werden^, und regulatorische T-Zellen (Tregs) können als CD4⁺CD25⁺⁺CD127^{niedrig 8} identifiziert werden. Um ein standardisiertes Durchflusszytometrie-Experiment zu etablieren, um die Konsistenz und Vergleichbarkeit der experimentellen Ergebnisse in mehreren Zentren zu erreichen, wurde eine schnelle und praktikable Standardisierungsmethode etabliert, um die Übertragung von Protokollen zwischen verschiedenen Durchflusszytometern für den Nachweis von Lymphozyten im Vollblut von JE-geimpften Kindern zu erleichtern. Sechs gesunde Kinder (2 Jahre alt) wurden aus dem Beijing Children's Hospital der Capital Medical University rekrutiert. Nach einer Grund- und Auffrischungsimpfung mit einem attenuierten JE SA14-14-2-Lebendimpfstoff vor weniger als 6 Monaten wurden periphere Blutproben von den Freiwilligen entnommen. Es wurden hochgradig vergleichbare Daten von verschiedenen Instrumenten nach standardisierten Verfahren gewonnen, was für multizentrische Assessments hilfreich ist.

Protokoll

Die Studie wurde von der Ethikkommission des Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, genehmigt (Zulassungsnummer: 2020-k-85). Auf die Einverständniserklärung der Probanden wurde verzichtet, da in dieser Studie nur Restproben nach klinischen Tests verwendet wurden. An dieser Studie sind zwei Labore beteiligt. Im Transferlabor wurde die standardisierte Methode mit einem Durchflusszytometer entwickelt. Das Zytometer in diesem Labor wird im Folgenden als Zytometer A bezeichnet. Das Prüfverfahrenslabor ist das Labor, das Verfahren unter Verwendung eines anderen Durchflusszytometers erhält, und das Zytometer in diesem Labor wird im Folgenden als Zytometer B bezeichnet.

1. Periphere Blutprobenentnahme und Zellaufbereitung

1. Entnahme peripherer Blutproben (2 ml) von JE-geimpften Kindern und ungeimpften Kindern in EDTA-K 2-Antikoagulationsröhrchen durch Standardvenenpunktion.
2. Mischen Sie die Vollblutprobe, indem Sie die Röhrchen 10x auf den Kopf stellen. Geben Sie 100 μl Vollblut in ein 12 mm x 75 mm großes Röhrchen. Machen Sie jede Probe in doppelter Form.
3. Geben Sie 10 μl brillanten Fleckenpuffer (BV-Puffer) in ein 12 mm x 75 mm großes Röhrchen. Geben Sie 5 μl jedes Antikörpers (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; Verdünnungsfaktor: 1:20) und 20 μl Antikörper (CD25, CD45RA; Verdünnungsfaktor: 1:5) in den BV-Puffer. Wirbeln Sie sanft.
   ANMERKUNG: Die Volumina und Informationen der Antikörperreagenzien sind in Tabelle 1 aufgeführt.
4. Geben Sie den Antikörpercocktail in das Röhrchen mit der Vollblutprobe. Vorsichtig wirbeln und bei Raumtemperatur 15 Minuten im Dunkeln inkubieren.
5. Verdünnen Sie die 10-fache Lyselösung 1:10 mit destilliertem Wasser, um 1-fache Lyselösung herzustellen. Lysieren Sie die Blutproben durch Zugabe von 2 ml 1x Lyselösung. Vorsichtig vorwirbeln und 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Bei 300 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand dekantieren.
7. Das Pellet wird in 2 ml 1x PBS resuspendiert, bei 300 × g 5 min zentrifugiert und der Überstand dekantiert.
8. Resuspendieren Sie das Pellet in 0,5 ml 1x PBS und mischen Sie es gründlich. Bei 2 °C bis 8 °C lagern. Senden Sie die Proben zur durchflusszytometrischen Analyse an die beiden Labore.
   ANMERKUNG: Die Negativkontrollprobe und die einfach gefärbte Zellkontrolle müssen gleichzeitig verarbeitet werden.

2. Vorbereitung von Kompensationsperlen und Einzelfleckenkontrolle

1. Etikett V500-Anti-CD45 einfach gefärbt, APC-H7-Anti-CD3 einfach gefärbt, FITC-Anti-CD4 einfach gefärbt, R718-Anti-CD8 einfach gefärbt, BV605-Anti-CD27 einfach gefärbt, APC-Anti-CD45RA einfach gefärbt, PE-Anti-CD25 einfach gefärbt, BV421-Anti-CD127 einfach gefärbt, BB700-Anti-CD19 einfach gefärbt und PE-CY7-Anti-IgD einfach gefärbt.
2. Geben Sie 100 μl 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco, der 1 % fötales Rinderserum (FBS) enthält, in ein 5-ml-Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden.
3. Fügen Sie 50 μl der negativen Kügelchen und 50 μl der Anti-Maus-Ig-κ-Kügelchen zu jeder Röhre und jedem Wirbel hinzu.
4. Geben Sie 2 μl jedes markierten Antikörpers (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) in ein einfach gefärbtes Röhrchen. Die Mischung vorsichtig schwenken und 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur (20 °C bis 25 °C) inkubieren.
5. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 2 ml 1x PBS, zentrifugieren Sie sie bei 300 × g für 5 min und dekantieren Sie den Überstand.
6. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 0,5 ml 1x PBS und mischen Sie sie gründlich. Bei 2 °C bis 8 °C lagern.

3. Verwendung identischer Konfigurationsnamen auf den verschiedenen Zytometern in zwei Labors

1. Erstellen Sie eine neue Konfiguration in der Software des Zytometers A. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zytometer und wählen Sie Konfigurationen anzeigen , um das Konfigurationsfenster anzuzeigen.
2. Klicken Sie in der Konfigurationsliste mit der rechten Maustaste auf den Basiskonfigurationsordner, wählen Sie Neuer Ordner aus, und benennen Sie ihn um.
3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Basiskonfiguration und wählen Sie Kopieren.
4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den neuen Ordner , und fügen Sie die Basiskonfiguration ein, um eine neue Konfiguration zu erstellen. Benennen Sie die neue Konfiguration in "Standardisierter Methodentransfer" um.
5. Ziehen Sie den Parameternamen, z. B. FITC, aus der Liste Parameter auf den entsprechenden Detektor (530/30).
6. Bearbeiten Sie zusätzliche Parameter (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 und BV605) in die neue Konfiguration.
7. Befolgen Sie diese Methode, um eine neue Konfiguration für ein anderes Durchflusszytometermodell mit demselben Namen "Standardisierter Methodentransfer" zu erstellen. Stellen Sie sicher, dass die Konfiguration für jeden Melder die gleichen Parameter enthält.
   HINWEIS: Um die Versuchsvorlage auf den beiden verschiedenen Durchflusszytometermodellen erfolgreich zu identifizieren, stellen Sie sicher, dass der Name konsistent ist.
8. Verwenden Sie unter den Zytometerkonfigurationen CST-Perlen (Cytometer Setup and Tracking), um die Zytometer-Baseline zu definieren und die Leistung des Zytometers zu verfolgen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zytometer und wählen Sie CST, um den Arbeitsbereich für die Einrichtung und Verfolgung des Zytometers anzuzeigen.
9. Fügen Sie drei Tropfen (150 μl) Setup-Kügelchen zu 0,5 ml 1x PBS in einem 5-ml-Polystyrol-Reagenzglas mit rundem Boden hinzu. Legen Sie das Perlenröhrchen auf das Zytometer.
10. Wählen Sie im Fenster " Setup-Steuerung " die Option " Baseline definieren" aus, und klicken Sie auf "Ausführen".

4. Standardisierung des Experiments mit dem Zytometer A im übertragenden Labor

1. Führen Sie eine Leistungsprüfung mit dem Zytometer-Setup und den Tracking-Beads durch, um sicherzustellen, dass das Zytometer eine gute Leistung erbringt.
2. Klicken Sie im Software-Browser-Fenster mit der rechten Maustaste auf die Zytometereinstellungen und wählen Sie Anwendungseinstellungen , um ein Arbeitsblatt zu erstellen.
3. Stellen Sie unter Verwendung einer ungefärbten Probe die Photomultiplier-Röhrenspannungen (PMT) von FSC, SSC und allen Fluoreszenzparametern ein. FSC: 260; SSC: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; Schützenpanzer: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; und BV605: 505.
4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Einstellungen des Zytometers für das Experiment und wählen Sie die Anwendungseinstellungen , um es zu speichern.
5. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Experiment " und wählen Sie das Menü "Kompensationseinrichtung ". Wählen Sie dann Create compensation controls (Kompensationssteuerelemente erstellen) aus, um Kompensationssteuerelemente automatisch hinzuzufügen.
6. Zeichnen Sie Daten für alle Kompensationskontrollperlen auf.
7. Klicken Sie auf das Experiment und wählen Sie Kompensationseinrichtung. Berechnen Sie dann die Entschädigung automatisch.
8. Zeichnen Sie Daten für Einzelfärbe-Kontrollen auf.
9. Verwenden Sie CD45RA APC, um den Kompensationswert von R718 auf 15 % APC zu ändern. Verwenden Sie CD19 BB700, um den Kompensationswert von APC-H7 auf 14% BB700 zu ändern. Verwenden Sie CD8 R718, um den Kompensationswert von APC-H7 auf 60 % R718 zu ändern.
10. Zeichnen Sie die Daten für die CST-Perlen auf.
11. Erstellen Sie ein globales Arbeitsblatt mit der Zielwertvorlage für die hellen CST-Perlen.
12. Zeichnen Sie mit einem FSC/SSC-Diagramm das Polygongatter für die hellen CST-Perlen. Erhalten Sie Histogrammdiagramme von 10 Fluoreszenzkanälen für die hellen CST-Perlen: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 und BV605. Erstellen Sie Intervall-Gatter in den Histogrammdiagrammen. Erstellen Sie die Statistikansicht, indem Sie den Median der Intervallgatter anzeigen.
13. Führen Sie die Proben auf dem Durchflusszytometer aus. Sammeln Sie insgesamt 25.000 Lymphozyten.
14. Erstellen Sie ein globales Arbeitsblatt der Analysevorlage für die Proben.
15. Verwenden Sie die folgende Beispiel-Gating-Strategie:
    1. Zeichnen Sie unter Verwendung eines CD45/Side-Scatter-Area (SSC-A)-Punktdiagramms das Polygon-Gate, um die intakte Lymphozytenpopulation zu identifizieren und gleichzeitig Trümmer auszuschließen.
    2. Zeichnen Sie mit einem CD3/CD19-Punktdiagramm ein rechteckiges Gate, um CD3+ T-Zellen und CD19⁺ B-Zellen auszuwählen.
    3. Zeichnen Sie mit einem CD4/CD8-Punktdiagramm ein Quad-Gate, um CD4+- oder CD8⁺-T-Zellen auszuwählen (Zellen mit einer hohen Fluoreszenz für diese Marker).
    4. Zeichnen Sie mit einem CD45RA/CD27-Punktdiagramm ein Quad-Gate, um CD8+- oder CD4+-T-Zellen in naive (CD27⁺CD45RA+), T_CM (CD27+ CD45RA-), T_EM (CD27-CD45RA-) und T_EMRA-Zellen (CD27-CD45RA⁺) zu unterteilen.
    5. Zeichnen Sie mit einem CD25/CD127-Punktdiagramm ein Quad-Gate, um CD4⁺ T-Zellen in Treg-Zellen zu unterteilen (CD4⁺CD25⁺⁺CD127^niedrig).
    6. Zeichnen Sie mit einem CD27/IgD-Punktdiagramm ein Quad-Gate, um CD19+ B-Zellen in naive ^B-Zellen (CD27-IgD⁺) und Gedächtnis-B-Zellen (CD27⁺IgD^-) zu unterteilen.
16. Speichern Sie die experimentelle Vorlage auf dem Zytometer A.
17. Verwenden Sie die CD-ROM, um die experimentelle Vorlage zu exportieren.

5. Übertragung der Versuchsvorlage auf das Zytometer B im Prüfmethodenlabor

HINWEIS: Die experimentelle Vorlage enthält die Geräteeinstellungen, die Analysevorlage und die Zielwertvorlage der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI).

1. Führen Sie eine Leistungsprüfung mit CST-Kügelchen durch, um sicherzustellen, dass das Zytometer eine gute Leistung erbringt.
2. Importieren Sie die Versuchsvorlage und erstellen Sie mit der Vorlage ein Experiment für das Zytometer B.
3. Verwenden Sie die gleiche Menge an CST-Kügelchen, um die Fluoreszenzparameterspannungen für jeden Fluoreszenzkanal an das vorherige MFI-Gerät anzupassen.
   HINWEIS: Die MFI-Werte variieren innerhalb von ±5% (die MFI von hellen Perlen vor und nach der Übertragung sind in Tabelle 2 dargestellt).
4. Stellen Sie bei Bedarf die Spannung für FSC mit der ungefärbten Probe ein.
5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Einstellungen des experimentellen Zytometers und wählen Sie die Anwendungseinstellungen, um die Anwendungseinstellungen zu speichern.
6. Verwenden Sie CD45RA APC, um den Kompensationswert von R718 auf 15 % APC zu ändern. Verwenden Sie CD19 BB700, um den Kompensationswert von APC-H7 auf 24% BB700 zu ändern. Verwenden Sie CD8 R718, um den Kompensationswert von APC-H7 auf 60 % R718 zu ändern.
7. Führen Sie die Proben auf dem Durchflusszytometer aus. Sammeln Sie insgesamt 25.000 Lymphozyten.

6. Übereinstimmung zwischen den Versuchsergebnissen, die mit den beiden Zytometern erzielt wurden

1. Beurteilen Sie die Unterschiede in den Lymphozyten-Untergruppen zwischen den Instrumenten unter Verwendung der Einweg-ANOVA (p < 0,05).

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt ein globales Arbeitsblatt der Zielwertvorlage für die hellen CST-Perlen. Unter Verwendung eines FSC/SSC-Diagramms wird ein Polygon-Gate gezeichnet, um die hellen CST-Perlen auszuwählen. Histogrammdiagramme von 10 Fluoreszenzkanälen wurden für die hellen CST-Beads erhalten: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 und BV605. Der Zielwert für jeden Parameter wird angezeigt, indem der Median innerhalb der Histogrammgatter in Tabelle 2 angez...

Diskussion

Die Immunphänotypisierung von Untergruppen peripherer Blutlymphozyten kann helfen, die Veränderungen der zellvermittelten adaptiven Immunität nach der Impfung bei Kindern zu verstehen. In klinischen Anwendungen treten unerwartete Situationen auf, wie z. B. das Versäumnis, Proben rechtzeitig zu erkennen, oder der Austausch eines Durchflusszytometers; Daher sind schnell standardisierte Methoden erforderlich, die den Transfer zwischen Durchflusszytometern in verschiedenen Labors erleichtern^<...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube