סטנדרטיזציה של העברה בין מעבדות בין ציטומטרים של זרימה לאיתור לימפוציטים בדלקת המוח היפנית ילדים מחוסנים

Summary

במחקר זה פותחה שיטה המאפשרת העברה של הגדרות ניסוי ותבניות ניתוח בין שני ציטומטרים של זרימה בשתי מעבדות לאיתור לימפוציטים בילדים מחוסנים לדלקת המוח היפנית. שיטת התקינה לניסויי ציטומטר הזרימה תאפשר לבצע פרויקטים מחקריים ביעילות במספר מרכזים.

Abstract

מספר גדל והולך של מעבדות צריכות לאסוף נתונים מציטומטרים מרובים של זרימה, במיוחד עבור פרויקטי מחקר המבוצעים על פני מרכזים מרובים. האתגרים בשימוש בשני ציטומטרים של זרימה במעבדות שונות כוללים היעדר חומרים סטנדרטיים, בעיות תאימות תוכנה, חוסר עקביות בהגדרת המכשירים ושימוש בתצורות שונות עבור ציטומטרים שונים של זרימה. כדי לבסס ניסוי ציטומטריית זרימה מתוקננת להשגת עקביות ויכולת השוואה של תוצאות ניסוי על פני מרכזים מרובים, הוקמה שיטת סטנדרטיזציה מהירה וישימה להעברת פרמטרים על פני ציטומטרים שונים של זרימה.

השיטות שפותחו במחקר זה אפשרו העברה של הגדרות ניסוי ותבניות ניתוח בין שני ציטומטרים של זרימה במעבדות שונות לאיתור לימפוציטים בילדים מחוסנים בדלקת המוח היפנית (JE). עוצמת פלואורסצנטיות עקבית התקבלה בין שני הציטומטרים באמצעות חרוזים סטנדרטיים פלואורסצנטיים כדי לקבוע את הגדרות הציטומטר. תוצאות דומות התקבלו בשתי מעבדות עם סוגים שונים של מכשירים. באמצעות שיטה זו, אנו יכולים לתקנן ניתוח להערכת תפקוד החיסון של ילדים שחוסנו ב- JE במעבדות שונות עם מכשירים שונים, להפחית את ההבדלים בנתונים ובתוצאות בין ציטוטמדי זרימה במספר מרכזים, ולספק גישה ישימה להסמכה הדדית של תוצאות מעבדה. שיטת הסטנדרטיזציה של ניסויי ציטומטר זרימה תבטיח ביצוע יעיל של פרויקטי מחקר על פני מרכזים מרובים.

Introduction

הסטנדרטיזציה של ציטומטריית זרימה שימושית להשוואת תוצאות המתקבלות מציטומטרים שונים במעבדות ומרכזי מחקר שונים, ותורמת להכרה הדדית בתוצאות לשיפור יעילות העבודה. מספר גדל והולך של תרחישים דורשים סטנדרטיזציה. במהלך תהליך פיתוח התרופה, סטנדרטיזציה של ציטומטריית זרימה חשובה, שכן בדיקה מפותחת ומתוקפת תתמוך בכל תהליך פיתוח התרופה מניתוח פרה-קליני ועד לניתוח קליני. שיטות ציטומטריות זרימה מועברות לעתים קרובות בין תעשיית התרופות לבין מעבדות משתפות פעולה¹. יתר על כן, חיוני לקבל נתונים דומים ממחקרים קליניים רב-מרכזיים. לדוגמה, זרימת עבודה של סטנדרטיזציה פותחה בפרויקט המחקר הקליני הרב-מרכזי למחלות אוטואימוניות מערכתיות כדי לקבל נתונים דומים מציטומטריית זרימה רב-צנטרית².

הסטנדרטיזציה של שיטות ציטומטריית זרימה היא מאתגרת. האתגרים שנחווים במעבדות שונות מיוחסים למחסור בחומרים סטנדרטיים, בעיות תאימות תוכנה, חוסר עקביות בהתקנת מכשירים, ושימוש בתצורות שונות בין ציטומטרים שונים של זרימה ואסטרטגיות gating שונות בין המרכזים ^3,4. לכן, חשוב לבצע ניתוח פער בין מעבדות. יש לבדוק גישה לדוגמה, מערכות איכות, כישורי כוח אדם ותצורת מכשירים כדי להבטיח עמידה בדרישות.

כיום, לילדים שחוסנו בחיסון נגד דלקת המוח היפנית (JE) יש שכיחות מופחתת משמעותית של JE⁵. ניטור תאי מערכת החיסון ההיקפיים בדם יכול לסייע בהבנת השינויים בחסינות הנרכשת בתיווך התא לאחר החיסון, ובקורלציה בין השינויים בתת-קבוצות לימפוציטים היקפיים בדם לבין השפעות החיסון. בשל היציבות המוגבלת של דגימות דם שלמות, הערכות של יעילות החיסון מבוצעות לעתים קרובות במספר מרכזים. לצורך ניתוח זה, הגדרנו תאי T נאיביים CD8+ או CD4+ כ- CD27+ CD45RA+, תאי T של זיכרון מרכזי (T_CM) כ- CD27+ CD45RA-, תאי T של זיכרון אפקט (T_EM) כ- CD27- CD45RA-, ותאי T של זיכרון אפקטור ממוין סופי (T_EMRA) כ- CD27^- CD45RA⁺. ניתן להפריד תאי CD19⁺ B לאוכלוסיות המבטאות CD27 לעומת IgD ^6,7, תאי B נאיביים מבטאים CD27n תאי זיכרון B (mBCs) ניתנים לזיהוי על סמך ביטוי IgD^6, ותאי T רגולטוריים (Tregs) ניתנים לזיהוי כ- CD4+CD25+^{+CD127 נמוך 8}. כדי לבסס ניסוי ציטומטריית זרימה מתוקננת להשגת עקביות ויכולת השוואה של תוצאות ניסוי במספר מרכזים, הוקמה שיטת סטנדרטיזציה מהירה וישימה כדי להקל על העברת פרוטוקולים על פני ציטומטרים שונים של זרימה לאיתור לימפוציטים בכל הדם של ילדים שחוסנו ב- JE. שישה ילדים בריאים (בני שנתיים) גויסו מבית החולים לילדים בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל. לאחר קבלת חיסון ראשוני וזריקת דחף בחיסון חי מוחלש JE SA14-14-2 פחות מ-6 חודשים קודם לכן, נאספו דגימות דם היקפיות מהמתנדבים. נתונים דומים מאוד התקבלו ממכשירים שונים בעקבות נהלים סטנדרטיים, אשר מועילים להערכות רב-מרכזיות.

Protocol

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לילדים בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל (מספר אישור: 2020-k-85). הסכמה מדעת של נבדקים אנושיים בוטלה כדגימות שיוריות בלבד לאחר שנעשה שימוש בבדיקות קליניות במחקר זה. במחקר זה מעורבות שתי מעבדות. המעבדה המעבירה היא המקום שבו פותחה השיטה הסטנדרטית באמצעות ציטומטר זרימה אחד. הציטומטר במעבדה זו מכונה להלן ציטומטר A. מעבדת שיטות הבדיקה היא המעבדה המקבלת שיטות באמצעות ציטומטר זרימה אחר, והציטומטר במעבדה זו מכונה להלן ציטומטר ב'.

1. איסוף דגימות דם היקפיות והכנת תאים

1. איסוף דגימות דם היקפיות (2 מ"ל) מילדים מחוסנים ב- JE וילדים לא מחוסנים בצינורות נוגדי קרישה EDTA-K₂ על ידי ניקור סטנדרטי.
2. מערבבים את כל דגימת הדם על ידי הפיכת הצינורות פי 10. הוסף 100 μL של דם שלם לצינור 12 מ"מ x 75 מ"מ. הפוך כל מדגם לכפול.
3. הוסף 10 μL של חיץ כתמים מבריק (BV buffer) לצינור בגודל 12 מ"מ x 75 מ"מ. הוסף 5 μL של כל נוגדן (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; גורם דילול: 1:20) ו 20 μL של נוגדן (CD25, CD45RA; גורם דילול: 1: 5) למאגר BV. מערבלים בעדינות.
   הערה: הנפחים והמידע של ריאגנטים נוגדנים מוצגים בטבלה 1.
4. מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים לצינור עם דגימת הדם המלאה. מערבבים בעדינות ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות בחושך.
5. לדלל את תמיסת השכיבה 10x 1:10 במים מזוקקים כדי להכין תמיסת שכיבה 1x. Lyse דגימות הדם על ידי הוספת 2 מ"ל של 1x פתרון lysing. מערבבים בעדינות ודגרים במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
6. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ו decant supernatant.
7. השהה מחדש את הגלולה ב 2 מ"ל של 1x PBS, צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות, ו decant את supernatant.
8. להשעות את הגלולה ב 0.5 מ"ל של 1x PBS ולערבב היטב. יש לאחסן ב-2°C עד 8°C. שלחו את הדגימות לשתי המעבדות לניתוח ציטומטרי זרימה.
   הערה: יש לעבד את דגימת הבקרה השלילית ואת הבקרה המוכתמת היחידה בתא בו-זמנית.

2. הכנת חרוזי פיצוי והדברה מוכתמת אחת

1. תווית V500-anti-CD45 מוכתם יחיד, APC-H7-anti-CD3 מוכתם יחיד, FITC-anti-CD4 מוכתם יחיד, R718-anti-CD8 מוכתם יחיד, BV605-anti-CD27 מוכתם יחיד, APC-anti-CD45RA מוכתם יחיד, PE-anti-CD25 מוכתם יחיד, BV421-anti-CD127 מוכתם יחיד, BB700-anti-CD19 מוכתם יחיד, PE-CY7-anti-IgD מוכתם יחיד.
2. הוסף 100 μL של חיץ מלח חוצץ פוספט (DPBS) של 1x Dulbecco המכיל 1% סרום בקר עוברי (FBS) למבחנה 5 מ"ל פוליסטירן בתחתית עגולה.
3. הוסף 50 μL של החרוזים השליליים ו 50 μL של Ig, κ חרוזים נגד עכבר לכל צינור ומערבולת.
4. הוסף 2 μL של כל נוגדן מסומן (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) לצינור מוכתם יחיד. מערבבים את התערובת בעדינות ודגרים במשך 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (20°C עד 25°C).
5. מרחפים מחדש את החרוזים ב 2 מ"ל של 1x PBS, צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות, ו decant את supernatant.
6. משעה מחדש את החרוזים ב 0.5 מ"ל של 1x PBS ומערבבים היטב. יש לאחסן ב-2°C עד 8°C.

3. שימוש בשמות תצורה זהים על הציטומטרים השונים בשתי מעבדות

1. צור תצורה חדשה בתוכנה של ציטומטר A. לחץ על הלחצן Cytometer ובחר View Configurations כדי להציג את חלון התצורה.
2. ברשימת התצורה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תיקיית תצורות הבסיס, בחר תיקיה חדשה ושנה את שמה.
3. לחץ לחיצה ימנית על תצורת הבסיס ובחר העתק.
4. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התיקיה החדשה והדבק את תצורת הבסיס כדי ליצור תצורה חדשה. שנה את שם התצורה החדשה ל"העברת שיטה מתוקננת".
5. גרור את שם הפרמטר, כגון FITC, מהרשימה פרמטרים אל הגלאי המתאים (530/30).
6. ערוך פרמטרים נוספים (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 ו- BV605) לתצורה החדשה.
7. בצע שיטה זו כדי ליצור תצורה חדשה במודל ציטומטר זרימה אחר באותו שם "העברת שיטה מתוקננת". ודא שהתצורה כוללת את אותם פרמטרים עבור כל גלאי.
   הערה: כדי לזהות בהצלחה את תבנית הניסוי בשני מודלים שונים של ציטומטר זרימה, ודא שהשם עקבי.
8. תחת תצורות הציטומטר, השתמש בחרוזי הגדרה ומעקב אחר ציטומטר (CST) כדי להגדיר את קו הבסיס של הציטומטר ולעקוב אחר ביצועי הציטומטר. לחץ על כפתור Cytometer ובחר CST כדי להציג את סביבת העבודה של הגדרת הציטומטר והמעקב.
9. הוסף שלוש טיפות (150 μL) של חרוזי התקנה ל 0.5 מ"ל של 1x PBS במבחנה 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית. מניחים את צינור החרוזים על הציטומטר.
10. בחלון Setup Control , בחר Define Baseline, ולחץ על Run.

4. ניסוי סטנדרטיזציה באמצעות ציטומטר A במעבדה המעבירה

1. הפעל בדיקת ביצועים באמצעות הגדרת הציטומטר וחרוזי מעקב כדי לוודא שהציטומטר מתפקד היטב.
2. בחלון דפדפן התוכנה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הגדרות הציטומטר ובחר הגדרות יישום כדי ליצור גליון עבודה.
3. באמצעות דגימה לא מוכתמת, התאם את מתחי צינור מכפיל האור (PMT) של FSC, SSC וכל הפרמטרים הפלואורסצנטיים. FSC: 260; SSC: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; נגמ"ש: 600; R718: 620; נגמ"ש-H7: 620; כ"ד 421: 466; V500: 420; וכ"ד 605: 505.
4. לחץ לחיצה ימנית על הגדרות ציטומטר הניסוי ובחר הגדרות יישום כדי לשמור אותו.
5. לחץ על כפתור הניסוי ובחר בתפריט הגדרת פיצוי . לאחר מכן, בחר צור בקרות פיצוי כדי להוסיף בקרות פיצוי באופן אוטומטי.
6. רשום נתונים עבור כל חרוזי בקרת הפיצוי.
7. לחץ על הניסוי ובחר הגדרת פיצוי. לאחר מכן, חשב את הפיצוי באופן אוטומטי.
8. רשום נתונים עבור פקדים המוכתמים בתא יחיד.
9. השתמש ב-CD45RA APC כדי לשנות את ערך הפיצוי של R718 ל-15% APC. השתמש ב- CD19 BB700 כדי לשנות את ערך הפיצוי של APC-H7 ל- 14% BB700. השתמש ב- CD8 R718 כדי לשנות את ערך הפיצוי של APC-H7 ל- 60% R718.
10. רשום נתונים עבור חרוזי CST.
11. צור גליון עבודה כללי של תבנית ערך היעד עבור החרוזים הבהירים של CST.
12. באמצעות תרשים FSC/SSC, צייר את שער המצולע עבור החרוזים הבהירים של CST. השג תרשימי היסטוגרמה של 10 תעלות פלואורסצנטיות עבור החרוזים הבהירים של CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 ו- BV605. צור שערי מרווחים בתרשימי ההיסטוגרמה. צור את תצוגת הסטטיסטיקה על-ידי הצגת החציון של שערי מרווחי הזמן.
13. הפעל את הדגימות על ציטומטר הזרימה; לאסוף סך של 25,000 לימפוציטים.
14. צור גליון עבודה כללי של תבנית הניתוח עבור הדגימות.
15. השתמש באסטרטגיית gating לדוגמה הבאה:
    1. באמצעות תרשים נקודות CD45/אזור פיזור צדדי (SSC-A), צייר את שער המצולע כדי לזהות את אוכלוסיית הלימפוציטים השלמה תוך הרחקת פסולת.
    2. באמצעות התוויית נקודות CD3/CD19, צייר שער מלבני כדי לבחור תאי T מסוג CD3+ ותאי CD19⁺ B.
    3. באמצעות תרשים נקודות CD4/CD8, צייר שער מרובע כדי לבחור תאי T מסוג CD4+ או CD8⁺ (תאים עם פלואורסצנטיות גבוהה עבור סמנים אלה, בהתאמה).
    4. באמצעות תרשים נקודות CD45RA/CD27, צייר שער מרובע כדי לחלק תאי T CD8+ או CD4+ לתאי T נאיביים (CD27⁺CD45RA+), T_CM (CD27+ CD45RA^{-), T} _EM (CD27-CD45RA^-) ותאי T_EMRA (CD27-CD45RA⁺).
    5. באמצעות תרשים נקודות CD25/CD127, צייר שער מרובע כדי לחלק תאי CD4⁺ T לתאי Treg (CD4+CD25+⁺CD127 ^נמוך).
    6. באמצעות תרשים נקודות CD27/IgD, צייר שער מרובע כדי לחלק תאי CD19+ B לתאי B נאיביים (CD27-IgD⁺) ותאי זיכרון B (CD27⁺IgD^-).
16. שמור את תבנית הניסוי בציטומטר A.
17. השתמש בתקליטור כדי לייצא את התבנית הניסיונית.

5. העברת תבנית הניסוי לציטומטר B במעבדת שיטת הבדיקה

הערה: תבנית הניסוי כוללת הגדרות מכשיר, תבנית ניתוח ותבנית ערך היעד של עוצמת פלואורסצנטיות חציונית (MFI).

1. בצע בדיקת ביצועים באמצעות חרוזי CST כדי לוודא שהציטומטר מתפקד היטב.
2. ייבא את תבנית הניסוי וצור ניסוי עבור ציטומטר B באמצעות התבנית.
3. השתמש באותה כמות של חרוזי CST כדי להתאים את מתחי הפרמטרים הפלואורסצנטיים עבור כל ערוץ פלואורסצנטי כך שיתאים למכשיר MFI הקודם.
   הערה: ערכי ה- MFI משתנים בתוך ±5% (ה- MFI של חרוזים בהירים לפני ואחרי העברה מוצג בטבלה 2).
4. כוונן את המתח עבור FSC באמצעות הדגימה הלא מוכתמת, במידת הצורך.
5. לחץ לחיצה ימנית על הגדרות הציטומטר הניסיוני ובחר הגדרות יישום כדי לשמור את הגדרות היישום.
6. השתמש ב-CD45RA APC כדי לשנות את ערך הפיצוי של R718 ל-15% APC. השתמש ב- CD19 BB700 כדי לשנות את ערך הפיצוי של APC-H7 ל- 24% BB700. השתמש ב- CD8 R718 כדי לשנות את ערך הפיצוי של APC-H7 ל- 60% R718.
7. הפעל את הדגימות על ציטומטר הזרימה; לאסוף סך של 25,000 לימפוציטים.

6. עקביות בין תוצאות הניסוי שהתקבלו על שני הציטומטרים

1. הערך את ההבדלים בתת-קבוצות לימפוציטים בין מכשירים באמצעות ANOVA חד-כיווני (p < 0.05).

תוצאות

איור 1 מציג גליון עבודה כללי של תבנית ערך היעד עבור החרוזים הבהירים של CST. באמצעות התוויית FSC/SSC, משורטט שער מצולע לבחירת החרוזים הבהירים של CST. חלקות היסטוגרמה של 10 תעלות פלואורסצנטיות התקבלו עבור חרוזים בהירים CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 ו- BV605. ערך היעד עבור כל פרמטר מו...

Discussion

אימונופנוטיפ של תת-קבוצות לימפוציטים היקפיים בדם יכול לעזור להבין את השינויים בחסינות הנרכשת התאית-תיווכת לאחר החיסון בילדים. ביישומים קליניים, מתרחשים מצבים בלתי צפויים, כגון כשל בזיהוי דגימות בזמן או החלפת ציטומטר זרימה; לכן, יש צורך בשיטות סטנדרטיות מהירות המאפשרות מעבר בין ציטומטרים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube