Padronização da Transferência entre Laboratórios entre Citômetros de Fluxo para Detecção de Linfócitos em Crianças Vacinadas com Encefalite Japonesa

Resumo

Neste estudo, foi desenvolvido um método para facilitar a transferência de cenários experimentais e modelos de análise entre dois citômetros de fluxo em dois laboratórios para a detecção de linfócitos em crianças vacinadas com encefalite japonesa. O método de padronização para os experimentos de citômetro de fluxo permitirá que os projetos de pesquisa sejam efetivamente conduzidos em vários centros.

Resumo

Um número crescente de laboratórios precisa coletar dados de vários citômetros de fluxo, especialmente para projetos de pesquisa realizados em vários centros. Os desafios do uso de dois citômetros de fluxo em laboratórios diferentes incluem a falta de materiais padronizados, problemas de compatibilidade de software, inconsistências na configuração do instrumento e o uso de diferentes configurações para diferentes citômetros de fluxo. Para estabelecer um experimento padronizado de citometria de fluxo para alcançar a consistência e a comparabilidade dos resultados experimentais em vários centros, um método de padronização rápido e viável foi estabelecido para transferir parâmetros entre diferentes citômetros de fluxo.

Os métodos desenvolvidos neste estudo permitiram a transferência de cenários experimentais e modelos de análise entre dois citômetros de fluxo em diferentes laboratórios para a detecção de linfócitos em crianças vacinadas com encefalite japonesa (JE). Uma intensidade de fluorescência consistente foi obtida entre os dois citômetros usando esferas padrão de fluorescência para estabelecer as configurações do citômetro. Resultados comparáveis foram obtidos em dois laboratórios com diferentes tipos de instrumentos. Usando este método, podemos padronizar a análise para avaliar a função imunológica de crianças vacinadas com JE em diferentes laboratórios com diferentes instrumentos, diminuir as diferenças de dados e resultados entre citômetros de fluxo em múltiplos centros e fornecer uma abordagem viável para a acreditação mútua de resultados laboratoriais. O método de padronização de experimentos de citômetros de fluxo garantirá o desempenho efetivo de projetos de pesquisa em vários centros.

Introdução

A padronização da citometria de fluxo é útil para a comparabilidade dos resultados obtidos de diferentes citômetros em diferentes laboratórios e centros de estudo, e conducente ao reconhecimento mútuo dos resultados para melhorar a eficiência do trabalho. Um número crescente de cenários requer padronização. Durante o processo de desenvolvimento do medicamento, a padronização da citometria de fluxo é importante, pois um ensaio desenvolvido e validado apoiará todo o processo de desenvolvimento do medicamento, desde a análise pré-clínica até a clínica. Os métodos citométricos de fluxo são frequentemente transferidos entre a indústria farmacêutica e os laboratórios colaboradores¹. Além disso, é essencial obter dados comparáveis de estudos clínicos multicêntricos. Por exemplo, um fluxo de trabalho de padronização foi desenvolvido no Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project para obter dados comparáveis da citometria de fluxo multicêntrica².

A padronização dos métodos de citometria de fluxo é um desafio. Os desafios vivenciados entre os laboratórios são atribuídos à falta de materiais padronizados, problemas de compatibilidade de software, inconsistências na configuração do instrumento e ao uso de diferentes configurações entre diferentes citômetros de fluxo e estratégias de gating divergentes entre os centros ^3,4. Portanto, é importante realizar uma análise de lacunas entre os laboratórios. O acesso a amostras, os sistemas de qualidade, as qualificações de pessoal e a configuração do instrumento devem ser revisados para garantir que os requisitos sejam atendidos.

Atualmente, as crianças vacinadas com a vacina contra encefalite japonesa (JE) têm uma incidência significativamente reduzida de JE⁵. O monitoramento das células imunes do sangue periférico pode ajudar a entender as mudanças na imunidade adaptativa mediada por células após a vacinação e a correlação entre as mudanças nos subconjuntos de linfócitos do sangue periférico e os efeitos da vacinação. Devido à estabilidade limitada das amostras de sangue total, as avaliações da eficácia da vacina são frequentemente realizadas em vários centros. Para esta análise, definimos células T CD8+ ou CD4+ ingênuas como CD27+ CD45RA+, células T de memória central (T_CM) como CD27+ CD45RA-, células T de memória efetora (T_EM) como CD27- CD45RA-, e células T de memória efetora terminalmente diferenciadas (T_EMRA) como CD27^- CD45RA⁺. As células B CD19⁺ podem ser separadas em populações que expressam CD27 versus IgD ^6,7, as células B ingênuas expressam células B de memória CD27n (mBCs) podem ser identificadas com base na expressão de IgD⁶ e as células T reguladoras (Tregs) podem ser identificadas como CD4⁺CD25⁺⁺CD127^{baixa 8}. Para estabelecer um experimento padronizado de citometria de fluxo para alcançar a consistência e comparabilidade dos resultados experimentais em múltiplos centros, um método de padronização rápido e viável foi estabelecido para facilitar a transferência de protocolos entre diferentes citômetros de fluxo para a detecção de linfócitos no sangue total de crianças vacinadas com JE. Seis crianças saudáveis (2 anos de idade) foram recrutadas do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University. Depois de receber uma vacinação prime e boost com uma vacina JE SA14-14-2 atenuada ao vivo menos de 6 meses antes, amostras de sangue periférico foram coletadas dos voluntários. Dados altamente comparáveis foram obtidos de diferentes instrumentos seguindo procedimentos padronizados, o que é útil para avaliações multicêntricas.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University (Número de Aprovação: 2020-k-85). O consentimento informado de seres humanos foi dispensado, pois apenas amostras residuais após testes clínicos foram utilizadas neste estudo. Dois laboratórios estão envolvidos neste estudo. O laboratório de transferência é onde o método padronizado foi desenvolvido usando um citômetro de fluxo. O citômetro neste laboratório é doravante referido como citômetro A. O laboratório de método de teste é o laboratório que recebe métodos usando outro citômetro de fluxo, e o citômetro neste laboratório é doravante referido como citômetro B.

1. Coleta de amostras de sangue periférico e preparação celular

1. Coletar amostras de sangue periférico (2 mL) de crianças vacinadas com JE e crianças não vacinadas em tubos anticoagulados EDTA-K₂ por punção venosa padrão.
2. Misture a amostra de sangue total virando os tubos de cabeça para baixo 10x. Adicione 100 μL de sangue total a um tubo de 12 mm x 75 mm. Faça cada amostra em duplicata.
3. Adicione 10 μL de tampão de mancha brilhante (tampão BV) a um tubo de 12 mm x 75 mm. Adicionar 5 μL de cada anticorpo (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; fator de diluição: 1:20) e 20 μL de anticorpo (CD25, CD45RA; fator de diluição: 1:5) ao tampão BV. Vórtice suavemente.
   NOTA: Os volumes e as informações dos reagentes de anticorpos são apresentados no quadro 1.
4. Adicione o coquetel de anticorpos no tubo com a amostra de sangue total. Vórtice suavemente e incubar à temperatura ambiente por 15 min no escuro.
5. Diluir a solução de lise 10x 1:10 com água destilada para preparar 1x solução de lise. Lise as amostras de sangue adicionando 2 mL de solução de lise 1x. Vórtice suavemente e incubar por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente.
6. Centrifugar a 300 × g durante 5 min e decantar o sobrenadante.
7. Ressuscite o pellet em 2 mL de PBS 1x, centrifugar a 300 × g por 5 min e decantar o sobrenadante.
8. Ressuscite o pellet em 0,5 mL de 1x PBS e misture bem. Conservar a 2 °C a 8 °C. Envie as amostras para os dois laboratórios para análise citométrica de fluxo.
   NOTA: A amostra de controlo negativo e o controlo de célula de coloração única devem ser processados simultaneamente.

2. Preparação de contas de compensação e controle de coloração única

1. Tubo de coloração única de APC-H7-anti-CD3 V500-anti-CD45, coloração única de APC-H7-anti-CD3, coloração única de FITC-anti-CD44, coloração única de R718-anti-CD8, coloração única de BV605-anti-CD27, coloração única de APC-anti-CD45RA, coloração única de PE-anti-CD25, coloração única de BV421-anti-CD127, coloração única de BB700-anti-CD19 e PE-CY7-anti-IgD de coloração única.
2. Adicione 100 μL de 1x tampão salino tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco contendo 1% de soro fetal bovino (FBS) a um tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL.
3. Adicionar 50 μL das contas negativas e 50 μL da Ig anti-rato, contas κ a cada tubo e vórtice.
4. Adicione 2 μL de cada anticorpo marcado (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) a um tubo de coloração única. Vórtice suavemente a mistura e incubar durante 15 min no escuro à temperatura ambiente (20 °C a 25 °C).
5. Ressuspeite as esferas em 2 mL de 1x PBS, centrifugar a 300 × g por 5 min e decantar o sobrenadante.
6. Ressuscite as contas em 0,5 mL de 1x PBS e misture bem. Conservar a 2 °C a 8 °C.

3. Usando nomes de configuração idênticos nos diferentes citômetros em dois laboratórios

1. Crie uma nova configuração no software do citômetro A. Clique no botão Citômetro e escolha Exibir configurações para exibir a janela de configuração.
2. Na lista de configurações, clique com o botão direito do mouse na pasta de configurações base, escolha Nova Pasta e renomeie-a.
3. Clique com o botão direito do mouse na configuração base e escolha copiar.
4. Clique com o botão direito do mouse na nova pasta e cole a configuração base para criar uma nova configuração. Renomeie a nova configuração como "Transferência de Método Padronizado".
5. Arraste o nome do parâmetro, como FITC, da lista Parâmetros para o detector apropriado (530/30).
6. Edite parâmetros adicionais (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605) para a nova configuração.
7. Siga este método para criar uma nova configuração em um modelo de citômetro de fluxo diferente usando o mesmo nome "Transferência de Método Padronizado". Certifique-se de que a configuração inclua os mesmos parâmetros para cada detector.
   Observação : para identificar com êxito o modelo de experimento nos dois modelos de citômetro de fluxo diferentes, certifique-se de que o nome é consistente.
8. Sob as configurações do citômetro, use as esferas de configuração e rastreamento do citômetro (CST) para definir a linha de base do citômetro e rastrear o desempenho do citômetro. Clique no botão Citômetro e escolha CST para exibir o espaço de trabalho de configuração e rastreamento do citômetro.
9. Adicione três gotas (150 μL) de esferas de configuração a 0,5 mL de 1x PBS em um tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL. Coloque o tubo de contas no citômetro.
10. Na janela Controle de Instalação , escolha Definir Linha de Base e clique em Executar.

4. Padronização do experimento usando citômetro A no laboratório de transferência

1. Execute uma verificação de desempenho usando a configuração do citômetro e os grânulos de rastreamento para verificar se o citômetro está funcionando bem.
2. Na janela do navegador de software, clique com o botão direito do mouse nas configurações do citômetro e escolha Configurações do aplicativo para criar uma planilha.
3. Usando uma amostra não corada, ajuste as tensões do tubo fotomultiplicador (PMT) do FSC, SSC e todos os parâmetros de fluorescência. FSC: 260; CCS: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; APC: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; e BV605: 505.
4. Clique com o botão direito do mouse nas configurações do citômetro do experimento e escolha as configurações do aplicativo para salvá-lo.
5. Clique no botão experimento e escolha o menu de configuração de compensação . Em seguida, escolha Criar controles de compensação para adicionar automaticamente controles de compensação.
6. Registre os dados de todas as contas de controle de compensação.
7. Clique no experimento e escolha a configuração de compensação. Em seguida, calcule a compensação automaticamente.
8. Registre dados para controles de célula de coloração única.
9. Use CD45RA APC para modificar o valor de compensação de R718 para 15% APC. Use CD19 BB700 para modificar o valor de compensação de APC-H7 para 14% BB700. Use CD8 R718 para modificar o valor de compensação de APC-H7 para 60% R718.
10. Registre os dados para as contas CST.
11. Crie uma planilha global do modelo de valor de destino para as contas brilhantes CST.
12. Usando um gráfico FSC/SSC, desenhe a porta do polígono para as contas brilhantes CST. Obtenha gráficos de histograma de 10 canais de fluorescência para as esferas brilhantes CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605. Crie portas de intervalo nos gráficos de histograma. Crie o modo de exibição de estatísticas mostrando a mediana das portas de intervalo.
13. Execute as amostras no citômetro de fluxo; coletar um total de 25.000 linfócitos.
14. Crie uma planilha global do modelo de análise para os exemplos.
15. Use a seguinte estratégia de bloqueio de exemplo:
    1. Usando um gráfico de pontos CD45/área de dispersão lateral (SSC-A), desenhe a porta do polígono para identificar a população de linfócitos intacta, excluindo os detritos.
    2. Usando um gráfico de pontos CD3/CD19, desenhe uma porta retangular para selecionar células T CD3+ e ^{células B} CD19⁺.
    3. Usando um gráfico de pontos CD4/CD8, desenhe uma porta quádrupla para selecionar células T CD4⁺ ou CD8⁺ (células com alta fluorescência para esses marcadores, respectivamente).
    4. Usando um gráfico de pontos CD45RA/CD27, desenhe uma porta quádrupla para subdividir as células T CD8⁺ ou CD4+ em células ingênuas (CD27⁺CD45RA+), T_CM (CD27+ CD45RA-), T_EM (CD27-CD45RA-) e T_EMRA (CD27-CD45RA+).
    5. Usando um gráfico de pontos CD25/CD127, desenhe uma porta quádrupla para subdividir as células T CD4⁺ em células Treg (CD4⁺CD25⁺⁺CD127^baixo).
    6. Usando um gráfico de pontos CD27/IgD, desenhe uma porta quádrupla para subdividir as células B CD19+ em células B ingênuas (CD27-IgD⁺) e células B de memória (CD27⁺IgD^-).
16. Salve o modelo experimental no citômetro A.
17. Use o CD-ROM para exportar o modelo experimental.

5. Transferência do molde experimental para o citômetro B no laboratório do método de teste

NOTA: O modelo experimental inclui configurações de instrumento, o modelo de análise e o modelo de valor alvo da intensidade de fluorescência mediana (MFI).

1. Realize uma verificação de desempenho usando esferas CST para verificar se o citômetro está funcionando bem.
2. Importe o modelo experimental e crie um experimento para o citômetro B usando o modelo.
3. Use o mesmo lote de grânulos CST para ajustar as tensões de parâmetro fluorescente para cada canal de fluorescência para corresponder ao instrumento MFI anterior.
   NOTA: Os valores de IFM variam dentro de ±5% (as IFM de grânulos brilhantes antes e depois da transferência são apresentadas no Quadro 2).
4. Ajuste a tensão para FSC usando a amostra não corada, se necessário.
5. Clique com o botão direito do mouse nas configurações do citômetro experimental e escolha as configurações do aplicativo para salvar as configurações do aplicativo .
6. Use CD45RA APC para modificar o valor de compensação de R718 para 15% APC. Use CD19 BB700 para modificar o valor de compensação de APC-H7 para 24% BB700. Use CD8 R718 para modificar o valor de compensação de APC-H7 para 60% R718.
7. Execute as amostras no citômetro de fluxo; coletar um total de 25.000 linfócitos.

6. Consistência entre os resultados experimentais obtidos nos dois citômetros

1. Avaliar as diferenças nos subconjuntos de linfócitos entre os instrumentos usando ANOVA one-way (p < 0,05).

Resultados

A Figura 1 mostra uma planilha global do modelo de valor de destino para as contas brilhantes CST. Usando um gráfico FSC/SSC, uma porta de polígono é desenhada para selecionar as contas brilhantes CST. Gráficos de histograma de 10 canais de fluorescência foram obtidos para as esferas brilhantes de STC: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605. O valor de destino para cada parâmetro é exibido mostrando a mediana dentro das portas do histograma na Tabela 2...

Discussão

A imunofenotipagem de subconjuntos de linfócitos do sangue periférico pode ajudar a entender as mudanças na imunidade adaptativa mediada por células após a vacinação em crianças. Em aplicações clínicas, ocorrem situações inesperadas, como a falha em detectar amostras em tempo hábil ou a substituição de um citômetro de fluxo; portanto, são necessários métodos padronizados rápidos que facilitem as transferências entre citômetros de fluxo em diferentes laboratórios9,10,11.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube