일본 뇌염 예방 접종 아동의 림프구 검출을 위한 유세포 분석기 간 실험실 간 이동 표준화

요약

이 연구에서는 일본 뇌염 예방 접종을 받은 어린이의 림프구 검출을 위해 두 실험실에서 두 개의 유세포 분석기 간에 실험 설정 및 분석 템플릿의 이동을 용이하게 하는 방법을 개발했습니다. 유세포 분석기 실험의 표준화 방법을 통해 여러 센터에서 연구 프로젝트를 효과적으로 수행할 수 있습니다.

초록

점점 더 많은 실험실이 여러 유세포 분석기에서 데이터를 수집해야 하며, 특히 여러 센터에서 수행되는 연구 프로젝트의 경우 더욱 그렇습니다. 서로 다른 실험실에서 두 개의 유세포 분석기를 사용할 때의 문제에는 표준화된 재료의 부족, 소프트웨어 호환성 문제, 기기 설정의 불일치, 서로 다른 유세포 분석기에 대한 다른 구성 사용 등이 포함됩니다. 여러 센터에서 실험 결과의 일관성과 비교 가능성을 달성하기 위해 표준화된 유세포 분석 실험을 확립하기 위해 서로 다른 유세포 분석기에 매개변수를 전송하기 위한 신속하고 실현 가능한 표준화 방법이 수립되었습니다.

이 연구에서 개발된 방법을 통해 일본 뇌염(JE) 예방 접종을 받은 어린이의 림프구 검출을 위해 서로 다른 실험실에 있는 두 개의 유세포 분석기 간에 실험 설정 및 분석 템플릿을 전송할 수 있었습니다. 형광 표준 비드를 사용하여 두 세포분석기 사이에서 일관된 형광 강도를 얻어 세포분석기 설정을 설정하였다. 서로 다른 유형의 기기를 사용하는 두 실험실에서 비슷한 결과를 얻었습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 서로 다른 실험실에서 서로 다른 기기를 사용하여 JE 백신 접종 어린이의 면역 기능을 평가하기 위한 분석을 표준화하고, 여러 센터의 유세포 분석기 간의 데이터 및 결과의 차이를 줄이고, 실험실 결과의 상호 인증을 위한 실행 가능한 접근 방식을 제공할 수 있습니다. 유세포 분석기 실험의 표준화 방법은 여러 센터에서 연구 프로젝트의 효과적인 수행을 보장합니다.

서문

유세포 분석의 표준화는 서로 다른 실험실 및 연구 센터의 서로 다른 세포계에서 얻은 결과를 비교할 수 있는 데 유용하며 결과를 상호 인식하여 작업 효율성을 개선하는 데 도움이 됩니다. 점점 더 많은 시나리오에 표준화가 필요합니다. 약물 개발 과정에서 유세포 분석 표준화는 중요한데, 이는 개발되고 검증된 분석법이 전임상부터 임상 분석에 이르는 전체 약물 개발 프로세스를 지원하기 때문입니다. 유세포 분석법은 제약 산업과 협력 실험실 간에 자주 이전됩니다¹. 또한 다중심 임상 연구에서 비교 가능한 데이터를 얻는 것이 필수적입니다. 예를 들어, 다기관 유세포 분석(multicentric flow cytometry)에서 비교 가능한 데이터를 얻기 위해 전신 자가면역 질환 다기관 임상 연구 프로젝트(Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project)에서 표준화 워크플로우가 개발되었습니다².

유세포 분석법의 표준화는 어려운 과제입니다. 실험실 전반에서 발생하는 문제는 표준화된 재료의 부족, 소프트웨어 호환성 문제, 기기 설정의 불일치, 서로 다른 유세포 분석기 간의 서로 다른 구성 사용 및 센터 간의 ....

프로토콜

이 연구는 수도 의과 대학 베이징 아동 병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호: 2020-k-85). 임상 시험 후 잔류 샘플만 이 연구에서 사용되었기 때문에 인간 피험자의 정보에 입각한 동의는 면제되었습니다. 이 연구에는 두 개의 실험실이 참여합니다. 이송 실험실 은 하나의 유세포 분석기를 사용하여 표준화된 방법을 개발한 곳입니다. 이 실험실의 세포분석기는 이하 세포분석기 A라고 합니다. 시험법 연구실은 다른 유세포 분석기를 이용하여 방법을 받는 실험실이며, 이 연구실 의 세포분석기는 이하 세포계 B라고 합니다.

1. 말초 혈액 샘플 수집 및 세포 준비

1. 표준 정맥 천자에 의해 EDTA-K₂-항응고 튜브에서 JE 백신 접종 아동 및 백신 접종되지 않은 아동의 말초 혈액 샘플(2mL)을 수집합니다.
2. 튜브를 거꾸로 10배 돌려 전혈 샘플을 혼합합니다. 100 μL의 전혈을 12 mm x 75 mm 튜브에 넣습니다. 각 샘플을 이중으로 만듭니다.
3. 10μL의 브릴리언트 염색 완충액(BV 완충액)을 12mm x 75mm 튜....

결과

그림 1은 CST 브라이트 비드에 대한 목표 값 템플릿의 전역 워크시트를 보여줍니다. FSC/SSC 플롯을 사용하여 CST 브라이트 비드를 선택하기 위해 다각형 게이트를 그립니다. CST 브라이트 비드에 대해 10개의 형광 채널의 히스토그램 플롯을 얻었다: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 및 BV605. 각 파라미터에 대한 목표값은 히스토그램 게이트 내의 중앙값을 표 2

토론

말초 혈액 림프구 하위 집합의 면역 표현형은 소아에서 백신 접종 후 세포 매개 적응 면역의 변화를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 임상 적용에서는 적시에 샘플을 검출하지 못하거나 유세포 분석기를 교체하는 것과 같은 예기치 않은 상황이 발생합니다. 그러므로, 서로 다른 실험실에서 유세포 분석기 간의 이동을 용이하게 하는 신속하고 표준화된 방법이 필요하다 ^9,10,11.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube