일본 뇌염 예방 접종 아동의 림프구 검출을 위한 유세포 분석기 간 실험실 간 이동 표준화

요약

이 연구에서는 일본 뇌염 예방 접종을 받은 어린이의 림프구 검출을 위해 두 실험실에서 두 개의 유세포 분석기 간에 실험 설정 및 분석 템플릿의 이동을 용이하게 하는 방법을 개발했습니다. 유세포 분석기 실험의 표준화 방법을 통해 여러 센터에서 연구 프로젝트를 효과적으로 수행할 수 있습니다.

초록

점점 더 많은 실험실이 여러 유세포 분석기에서 데이터를 수집해야 하며, 특히 여러 센터에서 수행되는 연구 프로젝트의 경우 더욱 그렇습니다. 서로 다른 실험실에서 두 개의 유세포 분석기를 사용할 때의 문제에는 표준화된 재료의 부족, 소프트웨어 호환성 문제, 기기 설정의 불일치, 서로 다른 유세포 분석기에 대한 다른 구성 사용 등이 포함됩니다. 여러 센터에서 실험 결과의 일관성과 비교 가능성을 달성하기 위해 표준화된 유세포 분석 실험을 확립하기 위해 서로 다른 유세포 분석기에 매개변수를 전송하기 위한 신속하고 실현 가능한 표준화 방법이 수립되었습니다.

이 연구에서 개발된 방법을 통해 일본 뇌염(JE) 예방 접종을 받은 어린이의 림프구 검출을 위해 서로 다른 실험실에 있는 두 개의 유세포 분석기 간에 실험 설정 및 분석 템플릿을 전송할 수 있었습니다. 형광 표준 비드를 사용하여 두 세포분석기 사이에서 일관된 형광 강도를 얻어 세포분석기 설정을 설정하였다. 서로 다른 유형의 기기를 사용하는 두 실험실에서 비슷한 결과를 얻었습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 서로 다른 실험실에서 서로 다른 기기를 사용하여 JE 백신 접종 어린이의 면역 기능을 평가하기 위한 분석을 표준화하고, 여러 센터의 유세포 분석기 간의 데이터 및 결과의 차이를 줄이고, 실험실 결과의 상호 인증을 위한 실행 가능한 접근 방식을 제공할 수 있습니다. 유세포 분석기 실험의 표준화 방법은 여러 센터에서 연구 프로젝트의 효과적인 수행을 보장합니다.

서문

유세포 분석의 표준화는 서로 다른 실험실 및 연구 센터의 서로 다른 세포계에서 얻은 결과를 비교할 수 있는 데 유용하며 결과를 상호 인식하여 작업 효율성을 개선하는 데 도움이 됩니다. 점점 더 많은 시나리오에 표준화가 필요합니다. 약물 개발 과정에서 유세포 분석 표준화는 중요한데, 이는 개발되고 검증된 분석법이 전임상부터 임상 분석에 이르는 전체 약물 개발 프로세스를 지원하기 때문입니다. 유세포 분석법은 제약 산업과 협력 실험실 간에 자주 이전됩니다¹. 또한 다중심 임상 연구에서 비교 가능한 데이터를 얻는 것이 필수적입니다. 예를 들어, 다기관 유세포 분석(multicentric flow cytometry)에서 비교 가능한 데이터를 얻기 위해 전신 자가면역 질환 다기관 임상 연구 프로젝트(Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project)에서 표준화 워크플로우가 개발되었습니다².

유세포 분석법의 표준화는 어려운 과제입니다. 실험실 전반에서 발생하는 문제는 표준화된 재료의 부족, 소프트웨어 호환성 문제, 기기 설정의 불일치, 서로 다른 유세포 분석기 간의 서로 다른 구성 사용 및 센터 간의 다양한 게이팅 전략에 기인합니다 ^3,4. 따라서 실험실 간의 갭 분석을 수행하는 것이 중요합니다. 시료 접근, 품질 시스템, 인력 자격 및 기기 구성을 검토하여 요구 사항이 충족되는지 확인해야 합니다.

현재 일본뇌염(JE) 백신을 접종한 어린이는 JE⁵의 발병률이 유의하게 감소했습니다. 말초 혈액 면역 세포를 모니터링하면 백신 접종 후 세포 매개 적응 면역의 변화와 말초 혈액 림프구 하위 집합의 변화와 백신 접종 효과 간의 상관 관계를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전혈 샘플의 제한된 안정성으로 인해 백신 효능 평가는 종종 여러 센터에서 수행됩니다. 이 분석을 위해 우리는 나이브 CD8+ 또는 CD4+ T 세포를 CD27+ CD45RA+로, 중심 기억 T 세포(T_CM)를 CD27+ CD45RA-로, 이펙터 기억 T 세포(T_EM)를 CD27-CD45RA-^{로, 말}단 분화 이펙터 기억 T 세포(T_EMRA)를 CD27-CD45RA⁺로 정의했습니다. CD19⁺ B 세포는 IgD ^6,7 대 CD27을 발현하는 집단으로 분리할 수 있고, 나이브 B 세포는 IgD⁶의 발현을 기반으로 CD27n 기억 B 세포(mBC)를 발현하는 집단으로 분리할 수 있으며^, 조절 T 세포(Treg)는 CD4⁺CD25⁺⁺CD127^{low 8}로 식별할 수 있습니다. 여러 센터에서 실험 결과의 일관성과 비교 가능성을 달성하기 위해 표준화된 유세포 분석 실험을 확립하기 위해 JE 백신 접종을 받은 어린이의 전혈에서 림프구를 검출하기 위해 다양한 유세포 분석기에 걸친 프로토콜 전달을 용이하게 하기 위해 신속하고 실현 가능한 표준화 방법을 수립했습니다. 6 명의 건강한 어린이 (2 세)가 수도 의과 대학 베이징 아동 병원에서 모집되었습니다. 6개월 이내에 약독화 생백신인 JE SA14-14-2 백신으로 프라임 및 부스트 백신을 접종한 후 지원자로부터 말초 혈액 샘플을 수집했습니다. 표준화된 절차에 따라 다양한 기기에서 매우 유사한 데이터를 얻었으며, 이는 다기관 평가에 도움이 됩니다.

프로토콜

이 연구는 수도 의과 대학 베이징 아동 병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호: 2020-k-85). 임상 시험 후 잔류 샘플만 이 연구에서 사용되었기 때문에 인간 피험자의 정보에 입각한 동의는 면제되었습니다. 이 연구에는 두 개의 실험실이 참여합니다. 이송 실험실 은 하나의 유세포 분석기를 사용하여 표준화된 방법을 개발한 곳입니다. 이 실험실의 세포분석기는 이하 세포분석기 A라고 합니다. 시험법 연구실은 다른 유세포 분석기를 이용하여 방법을 받는 실험실이며, 이 연구실 의 세포분석기는 이하 세포계 B라고 합니다.

1. 말초 혈액 샘플 수집 및 세포 준비

1. 표준 정맥 천자에 의해 EDTA-K₂-항응고 튜브에서 JE 백신 접종 아동 및 백신 접종되지 않은 아동의 말초 혈액 샘플(2mL)을 수집합니다.
2. 튜브를 거꾸로 10배 돌려 전혈 샘플을 혼합합니다. 100 μL의 전혈을 12 mm x 75 mm 튜브에 넣습니다. 각 샘플을 이중으로 만듭니다.
3. 10μL의 브릴리언트 염색 완충액(BV 완충액)을 12mm x 75mm 튜브에 추가합니다. 각 항체(CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; 희석 계수: 1:20) 5μL와 항체 20μL(CD25, CD45RA; 희석 계수: 1:5)를 BV 완충액에 추가합니다. 부드럽게 소용돌이.
   참고: 항체 시약의 부피와 정보는 표 1에 나와 있습니다.
4. 항체 칵테일을 전혈 샘플과 함께 튜브에 추가합니다. 부드럽게 소용돌이 치고 실온에서 어둠 속에서 15 분 동안 배양합니다.
5. 10x 용해 용액을 증류수로 1:10으로 희석하여 1x 용해 용액을 제조한다. 혈액 샘플을 용해하여 1x 용해 용액 2mL를 추가합니다. 소용돌이를 부드럽게 하고 실온의 어두운 곳에서 10분 동안 배양합니다.
6. 300 × g 에서 5 분 동안 원심 분리하고 상청액을 디캔팅합니다.
7. 펠릿을 1x PBS 2mL에 재현탁하고 300× g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 경사지게 합니다.
8. 펠릿을 0.5mL의 1x PBS에 재현탁하고 완전히 혼합합니다. 2 °C 내지 8 °C에서 보관한다. 유세포 분석을 위해 샘플을 두 실험실로 보냅니다.
   참고: 음성 대조군 샘플과 세포 단일 염색 대조군은 동시에 처리해야 합니다.

2. 보상 비드 및 단일 염색 제어 준비

1. 라벨 V500-anti-CD45 single-stained, APC-H7-anti-CD3 single-stained, FITC-anti-CD4 single-stained, R718-anti-CD8 single-stained, BV605-anti-CD27 single-stained, APC-anti-CD45RA single-stained, PE-anti-CD25 single-stained, BV421-anti-CD127 single-stained, BB700-anti-CD19 single-stained, 및 PE-CY7-anti-IgD single-stained tube.
2. 1% 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 1x Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS) 완충액 100μL를 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관에 추가합니다.
3. 50 μL의 음성 비드와 50 μL의 항-마우스 Ig, κ 비드를 각 튜브에 넣고 소용돌이칩니다.
4. 각 표지 항체(CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) 2μL를 단일 염색 튜브에 추가합니다. 혼합물을 부드럽게 와동시키고 실온(20°C 내지 25°C)의 암실에서 15분 동안 인큐베이션한다.
5. 비드를 2mL의 1x PBS에 재현탁하고, 300× g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 디캔팅합니다.
6. 0.5mL의 1x PBS에 비드를 재현탁하고 완전히 혼합합니다. 2 °C 내지 8 °C에서 보관한다.

3. 두 실험실의 서로 다른 유세포분석기에서 동일한 구성 이름 사용

1. Cytometer A의 소프트웨어에서 새 구성을 만듭니다. Cytometer 버튼을 클릭하고 구성 보기를 선택하여 구성 창을 표시합니다.
2. 구성 목록에서 기본 구성 폴더를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 새 폴더를 선택한 다음 이름을 바꿉니다.
3. 기본 구성을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 복사를 선택합니다.
4. 새 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 기본 구성을 붙여넣어 새 구성을 만듭니다. 새 구성의 이름을 "표준화된 방법 전송"으로 바꿉니다.
5. 매개변수 이름(예: FITC)을 매개변수 목록에서 해당 감지기(530/30)로 끕니다.
6. 추가 매개변수(PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 및 BV605)를 새 구성으로 편집합니다.
7. 이 방법에 따라 "표준화된 분석법 이전"이라는 동일한 이름을 사용하여 다른 유세포 분석기 모델에 새 구성을 만듭니다. 구성에 각 감지기에 대해 동일한 매개 변수가 포함되어 있는지 확인합니다.
   참고: 두 개의 서로 다른 유세포 분석기 모델에서 실험 템플릿을 성공적으로 식별하려면 이름이 일관성이 있어야 합니다.
8. 세포분석기 구성에서 세포분석기 설정 및 추적(CST) 비드를 사용하여 세포분석기 기준선을 정의하고 세포분석기 성능을 추적합니다. Cytometer 버튼을 클릭하고 CST를 선택하여 Cytometer 설정 및 추적 작업 공간을 표시합니다.
9. 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관에 있는 0.5mL의 1x PBS에 셋업 비드 3방울(150μL)을 추가합니다. 비드 튜브를 세포분석기에 놓습니다.
10. Setup Control(설정 제어) 창에서 Define Baseline(기준 정의)을 선택하고 Run(실행)을 클릭합니다.

4. 이식 실험실에서 세포분석기 A를 이용한 실험 표준화

1. 세포분석기 설정 및 추적 비드를 사용하여 성능 검사를 실행하여 세포분석기가 제대로 작동하는지 확인합니다.
2. 소프트웨어 브라우저 창에서 유세포분석기 설정을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 응용 프로그램 설정을 선택하여 워크시트를 만듭니다.
3. 염색되지 않은 샘플을 사용하여 FSC, SSC 및 모든 형광 매개변수의 광전자 증배관(PMT) 전압을 조정합니다. FSC: 260; SSC: 460년; 핏: 490; 체육: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; APC: 600; R718: 620년; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; 및 BV605:505.
4. 실험 유세포분석기 설정을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 애플리케이션 설정을 선택하여 저장합니다.
5. 실험 버튼을 클릭하고 보상 설정 메뉴를 선택합니다. 그런 다음 보정 제어 생성(Create compensation controls)을 선택하여 보정 제어를 자동으로 추가합니다.
6. 모든 보정 제어 비드에 대한 데이터를 기록합니다.
7. 실험을 클릭하고 보정 설정을 선택합니다. 그런 다음 보상을 자동으로 계산합니다.
8. 세포 단일 염색 대조군에 대한 데이터를 기록합니다.
9. CD45RA APC를 사용하여 R718의 보상 값을 15% APC로 수정합니다. CD19 BB700을 사용하여 APC-H7의 보정 값을 14% BB700으로 수정합니다. CD8 R718을 사용하여 APC-H7의 보정 값을 60% R718로 수정합니다.
10. CST 비드에 대한 데이터를 기록합니다.
11. CST 밝은 구슬에 대한 목표 값 템플릿의 전역 워크시트를 만듭니다.
12. FSC/SSC 플롯을 사용하여 CST 밝은 비드에 대한 다각형 게이트를 그립니다. CST 브라이트 비드(FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 및 BV605)에 대한 10개의 형광 채널의 히스토그램 플롯을 얻습니다. 히스토그램 플롯에 구간 게이트를 만듭니다. 간격 게이트의 중앙값을 표시하여 통계 보기를 만듭니다.
13. 유세포 분석기에서 샘플을 실행합니다. 총 25,000 개의 림프구를 수집합니다.
14. 샘플에 대한 분석 템플릿의 전역 워크시트를 만듭니다.
15. 다음 샘플 게이팅 전략을 사용합니다.
    1. CD45/측면 산란 영역(SSC-A) 도트 플롯을 사용하여 폴리곤 게이트를 그려 파편을 제외하고 손상되지 않은 림프구 집단을 식별합니다.
    2. CD3/CD19 도트 플롯을 사용하여 직사각형 게이트를 그려 CD3+ T 세포와 CD19⁺ B 세포를 선택합니다.
    3. CD4/CD8 도트 플롯을 사용하여 쿼드 게이트를 그려 CD4+ 또는 CD8⁺ T 세포(각각 이러한 마커에 대한 형광이 높은 세포)를 선택합니다.
    4. CD45RA/CD27 도트 플롯을 사용하여 CD8+ 또는 CD4+ T 세포를 나이브(CD27⁺CD45RA+),_Tcm(CD27+ CD45RA^-), TEM(CD27-CD45RA^{-) 및} T_EMRA(CD27-CD45RA⁺) 세포로 세분화하는 쿼드 게이트를 그립니다.
    5. CD25/CD127 도트 플롯을 사용하여 쿼드 게이트를 그려 CD4⁺ T 세포를 Treg 세포(CD4⁺CD25⁺⁺CD127^낮음)로 세분화합니다.
    6. CD27/IgD 도트 플롯을 사용하여 쿼드 게이트를 그려 CD19+ B 세포를 나이브 B 세포(CD27-IgD⁺)와 기억 B 세포(CD27⁺IgD^-)로 세분화합니다.
16. 실험 템플릿을 세포분석기 A에 저장합니다.
17. CD-ROM을 사용하여 실험 템플릿을 내보냅니다.

5. 실험 템플릿을 테스트 방법 실험실의 세포계 B로 전송

참고: 실험 템플릿에는 기기 설정, 분석 템플릿 및 중간 형광 강도(MFI)의 목표값 템플릿이 포함됩니다.

1. CST 비드를 사용하여 성능 검사를 수행하여 세포분석기가 제대로 작동하는지 확인합니다.
2. 실험 템플릿을 가져오고 템플릿을 사용하여 세포분석기 B에 대한 실험을 만듭니다.
3. 동일한 로트의 CST 비드를 사용하여 이전 MFI 기기와 일치하도록 각 형광 채널의 형광 매개변수 전압을 조정합니다.
   알림: MFI 값은 ±5% 이내로 다양합니다(전사 전후의 밝은 비드의 MFI는 표 2에 나와 있음).
4. 필요한 경우 염색되지 않은 샘플을 사용하여 FSC의 전압을 조정합니다.
5. 실험용 세포분석기 설정을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 애플리케이션 설정을 선택하여 애플리케이션 설정을 저장합니다.
6. CD45RA APC를 사용하여 R718의 보상 값을 15% APC로 수정합니다. CD19 BB700을 사용하여 APC-H7의 보상 값을 24% BB700으로 수정합니다. CD8 R718을 사용하여 APC-H7의 보정 값을 60% R718로 수정합니다.
7. 유세포 분석기에서 샘플을 실행합니다. 총 25,000 개의 림프구를 수집합니다.

6. 두 세포계에서 얻은 실험 결과 간의 일관성

1. 일원 ANOVA를 사용하여 기기 간 림프구 하위 집합의 차이를 평가합니다(p < 0.05).

결과

그림 1은 CST 브라이트 비드에 대한 목표 값 템플릿의 전역 워크시트를 보여줍니다. FSC/SSC 플롯을 사용하여 CST 브라이트 비드를 선택하기 위해 다각형 게이트를 그립니다. CST 브라이트 비드에 대해 10개의 형광 채널의 히스토그램 플롯을 얻었다: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 및 BV605. 각 파라미터에 대한 목표값은 히스토그램 게이트 내의 중앙값을 표 2

토론

말초 혈액 림프구 하위 집합의 면역 표현형은 소아에서 백신 접종 후 세포 매개 적응 면역의 변화를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 임상 적용에서는 적시에 샘플을 검출하지 못하거나 유세포 분석기를 교체하는 것과 같은 예기치 않은 상황이 발생합니다. 그러므로, 서로 다른 실험실에서 유세포 분석기 간의 이동을 용이하게 하는 신속하고 표준화된 방법이 필요하다 ^9,10,11...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube