日本脳炎ワクチン接種小児におけるリンパ球検出のためのフローサイトメーター間ラボ間移入の標準化

要約

本研究では、脳炎ワクチン接種児のリンパ球検出のために、2つの実験室の2つのフローサイトメーター間で実験設定と分析テンプレートの転送を容易にする方法を開発しました。フローサイトメーター実験の標準化手法により、複数のセンターで効果的に研究プロジェクトを実施できるようになります。

要約

特に複数の施設で実施される研究プロジェクトにおいて、複数のフローサイトメーターからデータを収集する必要があるラボが増えています。異なるラボで2つのフローサイトメーターを使用する場合の課題には、標準化された材料の欠如、ソフトウェアの互換性の問題、機器のセットアップの不一致、異なるフローサイトメーターで異なる構成を使用することなどがあります。標準化されたフローサイトメトリー実験を確立して、複数の施設にわたる実験結果の一貫性と比較可能性を達成するために、異なるフローサイトメーター間でパラメータを転送するための迅速かつ実行可能な標準化方法が確立されました。

この研究で開発された方法は、日本脳炎(JE)ワクチン接種小児のリンパ球を検出するために、異なる実験室の2つのフローサイトメーター間で実験設定と分析テンプレートを転送することを可能にしました。蛍光標準ビーズを使用して2つのサイトメーター間で一貫した蛍光強度を取得し、サイトメーターの設定を確立しました。異なる種類の機器を使用した2つの実験室で同等の結果が得られました。この方法を用いることで、異なる機器を持つ異なる検査室におけるJEワクチン接種児の免疫機能を評価するための解析を標準化し、複数の施設のフローサイトメーター間でデータと結果の差異を減少させ、検査結果の相互認定のための実行可能なアプローチを提供することができます。フローサイトメーター実験の標準化方法は、複数のセンターにわたる研究プロジェクトの効果的なパフォーマンスを保証します。

概要

フローサイトメトリーの標準化は、異なるラボや研究センターの異なるサイトメーターから得られた結果の比較可能性に役立ち、結果の相互認識に役立ち、作業効率を向上させます。標準化を必要とするシナリオが増えています。医薬品開発プロセスでは、開発および検証済みのアッセイが前臨床から臨床分析までの医薬品開発プロセス全体をサポートするため、フローサイトメトリーの標準化が重要です。フローサイトメトリー法は、製薬業界と協力ラボの間で頻繁に転送されます¹。さらに、多施設臨床試験から比較可能なデータを取得することが不可欠です。例えば、全身性自己免疫疾患多施設臨床研究プロジェクトでは、多中心フローサイトメ^トリー2から比較可能なデータを取得するための標準化ワークフローが開発されました。

フローサイトメトリー法の標準化は困難です。ラボ全体で発生する課題は、標準化された材料の欠如、ソフトウェアの互換性の問題、機器のセットアップの不一致、および異なるフローサイトメーター間での異なる構成の使用、およびセンター間の異なるゲーティング戦略に起因しています^3,4。したがって、ラボ間のギャップ分析を行うことが重要です。サンプルアクセス、品質システム、人員資格、および機器構成をレビューして、要件が満たされていることを確認する必要があります。

現在、日本脳炎(JE)ワクチンを接種した小児は、JE⁵の発生率が大幅に低下しています。末梢血免疫細胞のモニタリングは、ワクチン接種後の細胞媒介性適応免疫の変化、および末梢血リンパ球サブセットの変化とワクチン接種の効果との相関関係を理解するのに役立ちます。全血サンプルの安定性が限られているため、ワクチンの有効性の評価は複数の施設で行われることがよくあります。この解析では、ナイーブCD8⁺またはCD4+ T細胞をCD27+ CD45RA+、セントラルメモリーT細胞(_TCM)をCD27+ CD45RA-、エフェクターメモリーT細胞(T EM)をCD27-CD45RA^-、終末分化型エフェクターメモリーT細胞(T_EMRA)をCD27-CD45RA⁺と定義しました。CD19⁺ B細胞はCD27対IgD ^6,7を発現する集団に分離でき、ナイーブB細胞はIgD⁶の発現に基づいてCD27nメモリーB細胞(mBC)を発現し、制御性T細胞(Treg)はCD4 ⁺ CD25 ⁺⁺ CD127^低8として同定できます。標準化されたフローサイトメトリー実験を確立して、複数の施設での実験結果の一貫性と比較可能性を達成するために、JEワクチン接種を受けた子供の全血中リンパ球を検出するための異なるフローサイトメーター間でのプロトコルの転送を容易にするための迅速かつ実行可能な標準化方法が確立されました。首都医科大学北京小児病院から6人の健康な子供(2歳)が採用されました。弱毒生JE SA14-14-2ワクチンによるプライムおよびブーストワクチン接種を6か月以内に受けた後、末梢血サンプルをボランティアから収集しました。標準化された手順に従って、さまざまな機器から比較性の高いデータが得られ、多施設評価に役立ちます。

プロトコル

この研究は、首都医科大学北京小児病院の倫理委員会によって承認されました(承認番号:2020-k-85)。この研究では臨床試験後の残留サンプルのみが使用されたため、ヒト被験者のインフォームドコンセントは放棄されました。この研究には2つの研究室が関わっています。 トランスファーラボ では、1つのフローサイトメーターを使用して標準化されたメソッドが開発されました。本研究室のサイトメーターを以下、 サイトメーターAと呼びます。試験方法ラボとは、他のフローサイトメーターを用いた方法を受けるラボであり、本 ラボ のサイトメーターを 以下、サイトメーターBと呼ぶ。

1.末梢血サンプルの採取と細胞調製

1. 標準的な静脈穿刺によってEDTA-K 2抗凝固チューブでJEワクチン接種を受けた子供とワクチン未接種の子供から末梢血サンプル(₂ mL)を収集します。
2. チューブを10倍逆さまにして全血サンプルを混合します。100 μLの全血を12 mm x 75 mmのチューブに加えます。各サンプルを複製します。
3. 10 μLのブリリアントステインバッファー(BVバッファー)を12 mm x 75 mmのチューブに加えます。各抗体(CD45、CD3、CD4、CD8、CD127、CD27、CD19、IgD、希釈倍率:1:20)5 μLおよび抗体(CD25、CD45RA、希釈倍率:1:5)20 μLをBVバッファーに加えます。穏やかに渦を巻く。
   注:抗体試薬の容量と情報を 表1に示します。
4. 抗体カクテルを全血サンプルと一緒にチューブに加えます。穏やかにボルテックスし、暗所で15分間室温でインキュベートします。
5. 10倍溶解液を蒸留水で1:10に希釈し、1倍溶解液を調製します。2 mLの1x溶解液を加えて血液サンプルを溶解します。穏やかにボルテックスし、室温で暗所で10分間インキュベートします。
6. 300 × g で5分間遠心分離し、上清をデカントします。
7. ペレットを2 mLの1x PBSに再懸濁し、300 × g で5分間遠心分離し、上清をデカントします。
8. ペレットを0.5 mLの1x PBSに再懸濁し、完全に混合します。2°Cから8°Cで保管してください。 サンプルをフローサイトメトリー分析のために2つのラボに送ります。
   注:ネガティブコントロールのサンプルと細胞の単一染色コントロールは同時に処理する必要があります。

2. 補正ビーズの調製と単一染色コントロール

1. ラベル V500-抗CD45単一染色、APC-H7-抗CD3単一染色、FITC抗CD4単一染色、R718-抗CD8単一染色、BV605-抗CD27単一染色、APC-抗CD45RA単一染色、PE-抗CD25単一染色、BV421-抗CD127単一染色、BB700-抗CD19単一染色、およびPE-CY7-抗IgD単一染色チューブ。
2. 1%ウシ胎児血清(FBS)を含む1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)バッファー100 μLを5 mLの丸底ポリスチレン試験管に加えます。
3. 50 μLのネガティブビーズと50 μLの抗マウスIg、κビーズを各チューブとボルテックスに追加します。
4. 各標識抗体(CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、CD127、CD45RA、CD27、CD19、IgD)を2 μLずつ単染色チューブに加えます。混合物を穏やかにボルテックスし、室温(20°C〜25°C)の暗所で15分間インキュベートします。
5. ビーズを2 mLの1x PBSに再懸濁し、300 × g で5分間遠心分離し、上清をデカントします。
6. ビーズを0.5 mLの1x PBSに再懸濁し、完全に混合します。2°Cから8°Cで保管してください。

3. 2つのラボの異なるサイトメーターで同じ構成名を使用する

1. サイトメーターAのソフトウェアで新しい構成を作成します。 [サイトメーター ]ボタンをクリックし、[構成 の表示]を選択して構成 ウィンドウを表示します。
2. 構成リストで、 基本構成フォルダーを右クリックし、「 新規フォルダー」を選択して名前を変更します。
3. 基本コンフィギュレーションを右クリックし、[コピー] を選択します。
4. 新しいフォルダーを右クリックし、基本構成を貼り付けて 新しい 構成を作成します。新しい構成の名前を「標準化メソッド転送」に変更します。
5. 「FITC」などのパラメータ名を「パラメータ」リストから適切な検出器(530/30)にドラッグします。
6. 追加のパラメータ(PE、BB700、PE-CY7、APC、R718、APC-H7、BV421、V500、およびBV605)を新しい設定に編集します。
7. このメソッドに従って、同じ名前の「標準化メソッド転送」を使用して、別のフローサイトメーターモデルに新しい構成を作成します。構成に各ディテクタに同じパラメータが含まれていることを確認します。
   注: 2つの異なるフローサイトメーターモデルで実験テンプレートを正しく識別するには、名前が一致していることを確認してください。
8. サイトメーター構成では、サイトメーターセットアップアンドトラッキング(CST)ビーズを使用して、サイトメーターのベースラインを定義し、サイトメーターの性能を追跡します。サイトメーターボタンをクリックし、CSTを選択して、サイトメーターのセットアップとトラッキングのワークスペースを表示します。
9. 5 mLの丸底ポリスチレン試験管に0.5 mLの1x PBSに3滴(150 μL)のセットアップビーズを加えます。ビーズチューブをサイトメーターの上に置きます。
10. 「 セットアップコントロール 」ウィンドウで、「 ベースラインの定義」を選択し、「 実行」をクリックします。

4. 移入ラボにおけるサイトメーターAを用いた実験の標準化

1. サイトメーターのセットアップとトラッキングビーズを使用してパフォーマンスチェックを実行し、サイトメーターが正常に機能していることを確認します。
2. ソフトウェアブラウザウィンドウで、サイトメーター設定を右クリックし、[アプリケーション設定]を選択してワークシートを作成します。
3. 染色されていないサンプルを使用して、FSC、SSC、およびすべての蛍光パラメータの光電子増倍管(PMT)電圧を調整します。FSC: 260;SSC: 460;フィット:490;PE: 575;BB700:620;PE-CY7: 640;取得価額: 600;R718: 620;APC-H7: 620;BV421: 466;V500: 420;およびBV605:505。
4. 実験サイトメーターの設定を右クリックし、アプリケーションの設定を選択して保存します。
5. 実験ボタンをクリックし、報酬設定メニューを選択します。次に、[報酬コントロールの作成] を選択して、報酬コントロールを自動的に追加します。
6. すべての補正制御ビーズのデータを記録します。
7. 実験をクリックし、補正設定を選択します。次に、補正を自動的に計算します。
8. 細胞単一染色コントロールのデータを記録する。
9. CD45RA APCを使用して、R718の補正値を15%APCに変更します。CD19 BB700を使用して、APC-H7の補償値を14%BB700に変更します。CD8 R718を使用して、APC-H7の補償値を60%R718に変更します。
10. CSTビーズのデータを記録します。
11. CSTブライトビーズのターゲット値テンプレートのグローバルワークシートを作成します。
12. FSC/SSCプロットを使用して、CSTブライトビーズのポリゴンゲートを描画します。CSTブライトビーズの10個の蛍光チャンネル(FITC、PE、BB700、PE-Cy7、APC、R718、APC-H7、BV421、V500、およびBV605)のヒストグラムプロットを取得します。ヒストグラムプロットにインターバルゲートを作成します。インターバルゲートの中央値を表示して統計ビューを作成します。
13. サンプルをフローサイトメーターで実行します。合計25,000個のリンパ球を収集します。
14. サンプルの分析テンプレートのグローバルワークシートを作成します。
15. 次のサンプル ゲーティング戦略を使用します。
    1. CD45 /側方散乱領域(SSC-A)ドットプロットを使用して、ポリゴンゲートを描画し、破片を除外しながら無傷のリンパ球集団を特定します。
    2. CD3 / CD19ドットプロットを使用して、長方形のゲートを描画し、CD3⁺ T細胞とCD19 ⁺ B細胞を選択します。
    3. CD4/CD8ドットプロットを使用して、クワッドゲートを描画して、CD4⁺ またはCD8⁺ T細胞(それぞれこれらのマーカーに対して蛍光が高い細胞)を選択します。
    4. CD45RA/CD27ドットプロットを使用して、クワッドゲートを描画し、CD8⁺またはCD4+ T細胞をナイーブ(CD27⁺CD45RA+)、T_CM(CD27⁺ CD45RA-)、T_EM(CD27-CD45RA^-)、およびT_EMRA(CD27-CD45RA⁺)細胞に細分化します。
    5. CD25 / CD127ドットプロットを使用して、CD4 + T細胞をTreg細胞に細分化するためのクワッドゲートを描画します(CD4 ⁺ CD25 ⁺⁺ CD127^低)。
    6. CD27 / IgDドットプロットを使用して、クワッドゲートを描画して、CD19⁺ B細胞をナイーブB細胞(CD27-IgD +)とメモリーB細胞(CD27 ⁺ IgD^-)に細分化します。
16. 実験テンプレートを サイトメーターAに保存します。
17. CD-ROM を使用して実験用テンプレートをエクスポートします。

5.実験テンプレートをテストメソッドラボのサイトメーターBに転送する

注:実験テンプレートには、機器設定、分析テンプレート、および蛍光強度中央値(MFI)の目標値テンプレートが含まれています。

1. CSTビーズを使用して性能チェックを行い、サイトメーターが良好に機能していることを確認します。
2. 実験テンプレートをインポートし、テンプレートを使用してサイトメーターBの実験を作成します。
3. 同じロットのCSTビーズを使用して、各蛍光チャンネルの蛍光パラメータ電圧を以前のMFI装置と一致するように調整します。
   注:MFI値は±5%以内で変化します(転写前後の明るいビーズのMFIを 表2に示します)。
4. 必要に応じて、染色されていないサンプルを使用してFSCの電圧を調整します。
5. 実験サイトメーターの設定を右クリックし、アプリケーション設定を選択してアプリケーション設定を保存します。
6. CD45RA APCを使用して、R718の補正値を15%APCに変更します。CD19 BB700を使用して、APC-H7の補償値を24%BB700に変更します。CD8 R718を使用して、APC-H7の補償値を60%R718に変更します。
7. サンプルをフローサイトメーターで実行します。合計25,000個のリンパ球を収集します。

6. 2つのサイトメーターで得られた実験結果の一貫性

1. 一元配置分散分析を使用して、器具間のリンパ球サブセットの違いを評価します(p < 0.05)。

結果

図1は、CSTブライトビーズの目標値テンプレートのグローバルワークシートを示しています。FSC/SSCプロットを使用して、CST明るいビーズを選択するためにポリゴンゲートが描画されます。CST明るいビーズ(FITC、PE、BB700、PE-Cy7、APC、R718、APC-H7、BV421、V500、およびBV605)の10個の蛍光チャンネルのヒストグラムプロットが得られました。各パラメータの目標値は、 表2

ディスカッション

末梢血リンパ球サブセットのイムノフェノタイピングは、小児のワクチン接種後の細胞媒介性適応免疫の変化を理解するのに役立ちます。臨床アプリケーションでは、サンプルをタイムリーに検出できなかったり、フローサイトメーターを交換したりするなど、予期しない状況が発生します。したがって、異なるラボのフローサイトメーター間の移動を容易にする迅速な標準化された方法が?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	compensation
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD	655051	define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Fluorescent antibody
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27	BD	562656	Fluorescent antibody
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45	BD	560777	Fluorescent antibody
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Fluorescent antibody
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8	BD	751953	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA	BD	550855	Fluorescent antibody
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3	BD	560176	Fluorescent antibody
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4	BD	566320	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25	BD	555432	Fluorescent antibody
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD	BD	561314	Fluorescent antibody
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Staining Buffer
Centrifuge	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads	BD	662414	standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate	BD	349202	lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube