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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe el proceso de transducción de células T humanas primarias con un gen de interés, lo que garantiza la compatibilidad con los estándares de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP).

Resumen

El campo de la Terapia Celular Adoptiva (ACT) se ha visto revolucionado por el desarrollo de células modificadas genéticamente, concretamente las células T con receptor de antígeno quimérico (CAR). Estas células modificadas han mostrado respuestas clínicas notables en pacientes con neoplasias malignas hematológicas. Sin embargo, el alto costo de producir estas terapias y realizar evaluaciones exhaustivas de control de calidad ha limitado su accesibilidad a una gama más amplia de pacientes. Para abordar este problema, muchas instituciones académicas están explorando la viabilidad de la fabricación interna de células modificadas genéticamente, al tiempo que se adhieren a las directrices establecidas por las agencias reguladoras nacionales e internacionales.

La fabricación de productos de células T modificadas genéticamente a gran escala presenta varios desafíos, particularmente en términos de las capacidades de producción de la institución y la necesidad de cumplir con los requisitos de cantidad de infusión. Uno de los principales desafíos consiste en producir vectores virales a gran escala bajo las pautas de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP), que a menudo se subcontratan a empresas externas. Además, la simplificación del proceso de transducción de células T puede ayudar a minimizar la variabilidad entre los lotes de producción, reducir los costos y facilitar la capacitación del personal. En este estudio, describimos un proceso simplificado para la transducción lentiviral de células T humanas primarias con un marcador fluorescente como gen de interés. Todo el proceso se adhiere a los estándares que cumplen con las GMP y se implementa dentro de nuestra institución académica.

Introducción

La aparición de las terapias celulares adoptivas (ACT) y las células T receptoras de antígenos quiméricos (CAR) han provocado un cambio revolucionario en la práctica clínica moderna, estableciendo un nuevo paradigma de medicina personalizada. En particular, las células CAR-T dirigidas a CD19 han demostrado respuestas clínicas excepcionales y representan la terapia de células T más avanzada para las neoplasias malignas de células B 1,2,3,4,5. Sin embargo, las terapias de células T modificadas genéticamente comercializadas actualmente dependen en gran medida de los vectores virales para la transferencia de genes. La implementación de vectores virales en ACT, especialmente en condiciones de Buenas Prácticas de Manufactura (GMP) dentro de un entorno académico, presenta desafíos significativos debido a las limitaciones de escalabilidad, los requisitos de equipos especializados, la necesidad de personal altamente calificado y el uso de reactivos que cumplen con GMP para la producción de partículas virales mediadas por plásmidos 6,7,8.

En consecuencia, el proceso de fabricación de las terapias de células T modificadas genéticamente es intrincado y, por lo general, comienza con el aislamiento de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un producto de leucoféresis. Las células T a menudo se enriquecen a partir del grupo de PBMC y se activan mediante microcomplejos anti-CD3/CD28 7,9. Posteriormente, las células T se modifican genéticamente con vectores virales o no virales, que pueden producirse in situ o subcontratarse. Para alcanzar el número de células requerido para la infusión, las células modificadas genéticamente se expanden antes de la formulación final y/o la criopreservación. Por último, el producto celular debe satisfacer varios criterios de liberación basados en múltiples ensayos de control de calidad9.

Este protocolo presenta una metodología integral que utiliza técnicas simples para la manipulación ex vivo de PBMC sanos para fabricar un producto de células T modificadas genéticamente en condiciones que cumplen con las GMP. El protocolo incorpora el uso de un vector lentiviral, que puede ser subcontratado a una empresa de producción viral que proporcione todas las pruebas cuantitativas/funcionales, de pureza y de seguridad necesarias (por ejemplo, título viral, detección de lentivirus competente para la replicación del ADN de la célula huésped). Para este estudio, el vector empleado es un vector lentiviral de segunda generación basado en VSV-g (Proteína G del Virus de la Estomatitis Vesicular) con Proteína Verde Fluorescente (GFP), como gen de interés, en expresión constitutiva.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Patras y por el Comité de Revisión Institucional del Hospital General Universitario de Patras. Antes de obtener especímenes biológicos, se obtuvo el consentimiento informado de individuos sanos. La evaluación de elegibilidad de los participantes se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos institucionales y de acuerdo con los estándares JACIE para leucoféresis. Si este protocolo se va a implementar en un entorno clínico de ACT, todos los procedimientos deben cumplir con las pautas de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) y realizarse en salas limpias que cumplan con las GMP. Es necesario tomar precauciones especiales de seguridad cuando se trabaja con vectores virales, y estos procedimientos deben llevarse a cabo dentro de un gabinete de bioseguridad dedicado. En este estudio, los procedimientos descritos se llevaron a cabo dentro de una hipoxiestación HEPA H35 validada (ver Tabla de Materiales) para garantizar un entorno controlado y monitoreado. La descontaminación de todos los líquidos peligrosos debe llevarse a cabo con una solución de lejía al 10%.

1. Aislamiento de PBMC y activación de células T (Día 0)

  1. Recoja las células de la bolsa de aféresis del donante (leucopakos, consulte la tabla de materiales) en tubos de 50 ml, según el volumen inicial.
  2. Realice dos lavados de la bolsa celular mediante la infusión de 15 ml de medio hematopoyético completo (+5% HSA, medios hematopoyéticos comerciales sin suero, consulte la Tabla de materiales).
  3. Realice una centrifugación en gradiente de densidad a base de polisacáridos a una dilución de 1:2 (reactivo:muestra). Centrifugar a 800 x g durante 30 min a temperatura ambiente con pausas (A/D, 9/0).
  4. Con una micropipeta, recoja las PBMC en un tubo limpio de 50 ml.
  5. Lave las celdas dos veces con 1x PBS, llenando hasta 50 ml por cada lavado (400 x g, 10 min, temperatura ambiente). Resuspender las células en 5 mL de medio completo.
  6. Cuente las células usando azul de tripano usando un hemocitómetro estándar o un contador de células automatizado (ver Tabla de Materiales).
  7. Diluir las células con medios completos para lograr una concentración de 2 x 106 células/mL.
  8. Active 20 x 106 PBMC añadiendo 10 μL de reactivo de estimulación de células T (consulte la Tabla de materiales) por cada 2 x 106 células iniciales.
    NOTA: Este protocolo está diseñado para la activación de 20 x 106 PBMC, pero se puede ajustar para números de celdas más grandes según sea necesario.
  9. Agregue rhIL-2 (20 U/mL) (consulte la Tabla de materiales), mezcle suavemente y transfiera la mezcla a un recipiente apropiado (p. ej., una placa de 6 pocillos).
  10. Incubar las células a 37 °C, 5% CO2 durante 72 h.

2. Transducción de lentivirus de células T (Día 3)

  1. Transfiera el cultivo celular a un recipiente adecuado, como un tubo cónico de 50 ml. Mezclar bien y centrifugar a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT) para eliminar el reactivo de activación. Deseche cuidadosamente el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de medio completo.
    NOTA: En esta etapa, es posible descongelar el virus en hielo.
  2. Cuente las celdas usando azul de tripano.
  3. Resuspender las células en medio completo para lograr una concentración que permita sembrar0,5 x 10 6 células en un volumen total de 400 μL por pocillo en una placa de 24 pocillos. Agregue rhIL-7 (155 U/mL) y rhIL-15 (290 U/mL) (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: Asegúrese de tener en cuenta el volumen de virus que se agregarán. Consulte el paso 2.4.
  4. En un tubo aparte, añadir vectofusina-1 (ver Tabla de Materiales) al medio Opti-MEM a una concentración de 10 μg/mL, con un volumen igual al volumen viral que se va a utilizar.
    NOTA: Tenga en cuenta el volumen total de cultivo celular al calcular la concentración de vectofusina-1. Consulte el paso 2.3. Alternativamente, Vectofusin-1 GMP se puede utilizar como reactivo de grado GMP.
  5. Combine el virus concentrado a una multiplicidad de infección (MOI) de 40 con la mezcla de Vectofusina-1/Opti-MEM (proporción 1:1) y mezcle bien. Agregue esta mezcla al cultivo celular y ajuste el volumen total a 400 μL por pocillo utilizando medio completo, si es necesario.
  6. Coloque la tapa en la placa, séllela con una película de parafina y centrifuga a 1000 x g durante 2 h a 32 °C. Posteriormente, incubar la placa a 37 °C, 5% de CO2 durante la noche.

3. Eliminación del virus y expansión de las células T (Día 4)

  1. Recoja las células y acompájelas en un recipiente adecuado, como un tubo de 50 ml.
  2. Centrifugar las celdas a 400 x g a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Retire con cuidado el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de medio completo.
  3. Cuente las celdas usando azul de tripano. Resuspender las células en medios completos a una concentración de 1 x 106 células/mL. Agregue rhIL-7 (155 U/mL) y rhIL-15 (290 U/mL) (consulte la Tabla de materiales).
  4. Transferir las células a un recipiente apropiado, como un matraz T25, a una concentración de 0,3-0,5 x 106 células/cm2 e incubarlas a 37 °C, 5% CO2, durante 2 días.
    NOTA: Si se requiere una población celular más grande, las células se pueden subcultivar (1:2) en presencia de rhIL7 y rhIL-15 cada 2 días, siguiendo las mismas condiciones de incubación mencionadas anteriormente, hasta lograr el número de células deseado.

4. Criopreservación (Día 14)

NOTA: Se requerirá hielo para transferir los crioviales al lugar de almacenamiento durante este paso. El momento de la criopreservación depende del número de células deseado. Para este protocolo, la criopreservación se realiza en el día 14 después de lograr una expansión de 25 veces.

  1. Una vez que se alcance el número de células deseado, recoja las células y transfiéralas a tubos de 50 ml (ajuste el número de tubos en función del volumen total).
  2. Centrifugar los tubos a 400 x g a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. Retire con cuidado el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el gránulo en 10 ml de medio. Si es necesario, agrupe las células de varios tubos.
  3. Cuente las celdas usando azul de tripano. Mantenga una alícuota de 1 x 106 celdas para cada prueba de control de calidad (QC) (consulte la Sección 5) para evaluar el número de copias vectoriales y la eficiencia de transducción.
  4. Centrifugar los tubos a 400 x g durante 10 min a RT. En este punto, etiquete los crioviales en consecuencia.
  5. Retire completamente el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en una solución de criopreservación que consista en 50% de HSA y 40% de HBSS a una concentración de 1 x 107 células por ml por criovial. Transfiera la suspensión celular al número adecuado de crioviales y agregue un 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada criovial.
  6. Coloque los crioviales en hielo y transfiéralos rápidamente a un congelador de velocidad controlada para su criopreservación. Después de la criopreservación, transfiera los crioviales a un tanque de nitrógeno líquido monitoreado para su almacenamiento a largo plazo.

5. Control de calidad (Día 14)

NOTA: Para las pruebas de liberación, el producto se sometió a varias pruebas, incluidas pruebas de esterilidad para el crecimiento microbiano y la evaluación del nivel de endotoxinas. Estas pruebas se llevaron a cabo en laboratorios certificados del Hospital General Universitario de Patras y de la Universidad de Patras. La presencia de micoplasma se determinó internamente mediante un ensayo de detección bioquímica y se midió en un luminómetro siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). El fenotipo celular (Figura 1), así como el número de células y la viabilidad, se evaluaron internamente mediante citometría de flujo (ver sección 5.1) y un contador celular automatizado (ver Tabla de materiales), respectivamente. Los criterios de liberación se establecieron sobre la base de los datos publicados y las recomendaciones10,11 para los productos celulares producidos por GMP (Tabla 1).

  1. Realizar la tinción de citometría de flujo de eficiencia de transducción (día 14)
    NOTA: Se teñirá una alícuota de 1 x 106 células para determinar su viabilidad (7-AAD) y el marcador CD32 para evaluar la eficiencia de la transducción (ver Tabla de Materiales). Si es necesario detectar el gen de interés, como en el caso de las células CAR-T, el anticuerpo específico debe ser de un color diferente al del marcador CD3 y 7-AAD para evitar la compensación. Deben tenerse en cuenta las muestras de control adecuadas.
    1. Coloque la muestra en un tubo FACS y agregue 500 μL de tampón FACS.
    2. Centrifugar el tubo a 400 x g a RT durante 5 min.
    3. Deseche completamente el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el gránulo en una solución diluida 1:5 de tampón CD3:FACS (consulte la Tabla de materiales).
    4. Agitar la muestra e incubar durante 30 minutos en hielo en la oscuridad.
    5. Añadir 500 μL de tampón FACS. Centrifugar a 400 x g durante 5 min (RT).
    6. Deseche completamente el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en una solución diluida 1:20 de tampón 7-AAD:FACS (consulte la Tabla de materiales).
    7. Agitar la muestra e incubar durante 10 minutos en hielo en la oscuridad.
    8. Añadir 200 μL de tampón FACS y analizar la muestra con un citómetro de flujo (ver Tabla de Materiales).

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Resultados

Evaluación de la eficiencia de la transducción
Las células transducidas se evaluaron para determinar la expresión del gen de interés (GFP) mediante citometría de flujo. Los resultados representativos se muestran en la Figura 1. En el día 14, más del 95% de las células eran CD3+, lo que indica una activación y expansión exitosa de las células T. La eficiencia de transducción dentro de la población CD3+ se midió en un 58,7% (T...

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Discusión

Los vectores lentivirales como vehículos de administración de genes son herramientas importantes en el campo de la terapia celular y génica debido a su capacidad para transducir células que se dividen y no se dividen12. Sin embargo, la producción a gran escala de vectores lentivirales utilizando métodos compatibles con GMP sigue siendo un desafío debido a varios parámetros, como los métodos de transfección y los pasos de purificación, que pueden dar lugar a variabilidad en los lotes de ...

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Divulgaciones

N.S. desarrolló el protocolo y escribió el manuscrito que fue revisado y supervisado por A.S.; K.S., G.A. realizó experimentos adicionales; D.K., M.L. proporcionó un valioso apoyo en los experimentos y, junto con V.Z., N.T. en el proceso de revisión. N.T. es miembro de ProtATonce Ltd. Todos los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Esta investigación ha sido cofinanciada por la Unión Europea y fondos nacionales griegos a través del Programa Operativo Competitividad, Emprendimiento e Innovación, bajo la convocatoria RESEARCH - CREATE - INNOVATE (código del proyecto: T2EDK - 00474). También nos gustaría expresar nuestro agradecimiento a la Fundación Choose Life por brindar apoyo continuo al Laboratorio GMP "Dimitris Lois" del Instituto de Terapia Celular.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well TC-treated plateCorning353047
5 mL FACS tube Corning352054
50 mL Falcon tubesGreiner biomedica227261
6-well TC-treated plateCorning353046
7-AADBD Biosciences559925
BD FACS CANTO IIBD BiosciencesV96300084
BSAApplichemA1391
Cell Counter Corning Cell CytosmartJ21E0081
CryovialsGreiner biomedica122263
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)Life Technologies14190
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)--
FlowJo Software v10.6.2 TreeStar Inc-
Gibco CTS Opti-MEM I MediumThermoFisher ScientificA4124801
GMP rhIL-15Miltenyi Biotec170-076-114
GMP rhIL-2Miltenyi Biotec170-076-146
GMP rhIL-7Miltenyi Biotec170-076-111
Hanks’s Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175
HEPA Whitley H35 HypoxystationDon Whitley ScientificHA0315172H
Human Serum Albumin (HSA)BaxterB05AA01
Junior LB 9509 Portable LuminometerBerthold Technologies6506
Lenti-X Provirus Quantitation KitTakara Bio631239
LymphoprepStemcell Technologies7811
MACS GMP T cell TransActMiltenyi Biotec170-076-156
Mouse Anti-Human  CD3 (Clone: UCHT-1)BD Biosciences557706
MycoAlert Plus Detection kitLonza BioscienceLT07-703
Parafilm ultra-expandable closing film tape 5 cm x 75 mD.Dutscher90261
PeriStem PS-650-DB (apheresis bag)Biomed DeviceSC00816
Planer Kryo10 Series IIIPlaner
T75 flasksGreiner biomedica658175
Trypan blue, 0.4% solutionInvitrogenT10282
Vectofusin-1 GMPMiltenyi Biotec170-076-165
X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza BioscienceA1048501

Referencias

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