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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo delinea il processo di trasduzione delle cellule T umane primarie con un gene di interesse, garantendo la compatibilità con gli standard delle buone pratiche di fabbricazione (GMP).

Abstract

Il campo della terapia cellulare adottiva (ACT) è stato rivoluzionato dallo sviluppo di cellule geneticamente modificate, in particolare cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR). Queste cellule modificate hanno mostrato notevoli risposte cliniche in pazienti con neoplasie ematologiche. Tuttavia, l'elevato costo di produzione di queste terapie e la conduzione di approfondite valutazioni di controllo della qualità ne hanno limitato l'accessibilità a una gamma più ampia di pazienti. Per affrontare questo problema, molte istituzioni accademiche stanno esplorando la fattibilità della produzione interna di cellule geneticamente modificate, aderendo alle linee guida stabilite dalle agenzie di regolamentazione nazionali e internazionali.

La produzione di prodotti a base di cellule T geneticamente modificate su larga scala presenta diverse sfide, in particolare in termini di capacità produttive dell'istituzione e della necessità di soddisfare i requisiti di quantità di infusione. Una delle principali sfide riguarda la produzione di vettori virali su larga scala secondo le linee guida delle buone pratiche di fabbricazione (GMP), che spesso vengono esternalizzate a società esterne. Inoltre, la semplificazione del processo di trasduzione delle cellule T può aiutare a ridurre al minimo la variabilità tra i lotti di produzione, ridurre i costi e facilitare la formazione del personale. In questo studio, delineiamo un processo semplificato per la trasduzione lentivirale di cellule T umane primarie con un marcatore fluorescente come gene di interesse. L'intero processo aderisce agli standard conformi alle GMP ed è implementato all'interno della nostra istituzione accademica.

Introduzione

L'emergere delle terapie cellulari adottive (ACT) e delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) ha portato a un cambiamento rivoluzionario nella pratica clinica moderna, stabilendo un nuovo paradigma di medicina personalizzata. In particolare, le cellule CAR-T che hanno come bersaglio CD19 hanno dimostrato risposte cliniche eccezionali e rappresentano la terapia con cellule T più avanzata per le neoplasie maligne delle cellule B 1,2,3,4,5. Tuttavia, le attuali terapie a base di cellule T geneticamente modificate commercializzate si basano fortemente su vettori virali per il trasferimento genico. L'implementazione di vettori virali in ACT, in particolare in condizioni di buone pratiche di fabbricazione (GMP) all'interno di un ambiente accademico, presenta sfide significative a causa dei limiti di scalabilità, dei requisiti di apparecchiature specializzate, della necessità di personale altamente qualificato e dell'uso di reagenti conformi alle GMP per la produzione di particelle virali mediate da plasmidi 6,7,8.

Di conseguenza, il processo di produzione per le terapie con cellule T geneticamente modificate è complesso e in genere inizia con l'isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da un prodotto per la leucoaferesi. Le cellule T sono spesso arricchite dal pool PBMC e attivate utilizzando microcomplessi anti-CD3/CD28 7,9. Successivamente, le cellule T vengono geneticamente modificate con vettori virali o non virali, che possono essere prodotti in situ o in outsourcing. Per ottenere il numero di cellule richiesto per l'infusione, le cellule geneticamente modificate vengono espanse prima della formulazione finale e/o della crioconservazione. Infine, il prodotto cellulare deve soddisfare vari criteri di rilascio basati su più saggi di controllo della qualità9.

Questo protocollo presenta una metodologia completa che utilizza tecniche semplici per la manipolazione ex vivo di PBMC sane per produrre un prodotto a base di cellule T geneticamente modificate in condizioni conformi alle GMP. Il protocollo prevede l'uso di un vettore lentivirale, che può essere esternalizzato a un'azienda di produzione virale che fornisce tutti i necessari test quantitativi/funzionali, di purezza e di sicurezza (ad esempio, titolo virale, rilevamento di lentivirus competenti per la replicazione del DNA della cellula ospite). Per questo studio, il vettore utilizzato è un vettore lentivirale di seconda generazione basato su VSV-g (Vesicular Stomatitis Virus G Protein) con Green Fluorescent Protein (GFP), come gene di interesse, in espressione costitutiva.

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Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Patrasso e dal Comitato di Revisione Istituzionale dell'Ospedale Generale Universitario di Patrasso. Prima di ottenere campioni biologici, è stato ottenuto il consenso informato da individui sani. La valutazione dell'idoneità dei partecipanti è stata condotta secondo le procedure istituzionali e in conformità con gli standard JACIE per la leucoaferesi. Se questo protocollo deve essere implementato in un contesto clinico ACT, tutte le procedure devono rispettare le linee guida delle buone pratiche di fabbricazione (GMP) ed essere eseguite in camere bianche conformi alle GMP. Quando si lavora con vettori virali, sono necessarie speciali precauzioni di sicurezza e queste procedure devono essere condotte all'interno di un armadio di biosicurezza dedicato. In questo studio, le procedure descritte sono state condotte all'interno di una Hypoxystation HEPA H35 convalidata (vedi Tabella dei Materiali) per garantire un ambiente controllato e monitorato. La decontaminazione di tutti i liquidi pericolosi deve essere effettuata utilizzando una soluzione di candeggina al 10%.

1. Isolamento PBMC e attivazione delle cellule T (Giorno 0)

  1. Raccogliere le cellule dalla sacca per aferesi del donatore (leucopati, vedere Tabella dei materiali) in provette da 50 ml, a seconda del volume iniziale.
  2. Eseguire due lavaggi della sacca cellulare infondendo 15 mL di terreno ematopoietico completo (+5% HSA, terreno ematopoietico commerciale senza siero, vedere la tabella dei materiali).
  3. Eseguire la centrifugazione in gradiente di densità a base di polisaccaridi a una diluizione 1:2 (reagente:campione). Centrifugare a 800 x g per 30 min a temperatura ambiente con pause (A/D, 9/0).
  4. Utilizzando una micropipetta, raccogliere le PBMC in una provetta pulita da 50 ml.
  5. Lavare le celle due volte con 1x PBS, riempiendo fino a 50 ml per ogni lavaggio (400 x g, 10 min, temperatura ambiente). Risospendere le cellule in 5 mL di terreno completo.
  6. Contare le cellule utilizzando il blu di tripano utilizzando un emocitometro standard o un contatore di cellule automatizzato (vedere Tabella dei materiali).
  7. Diluire le cellule con terreno completo per ottenere una concentrazione di 2 x 106 cellule/mL.
  8. Attivare 20 x 106 PBMC aggiungendo 10 μL di reagente di stimolazione delle cellule T (vedere la tabella dei materiali) per 2 x 106 cellule di partenza.
    NOTA: Questo protocollo è progettato per l'attivazione di 20 x 106 PBMC, ma può essere regolato per numeri di celle maggiori in base alle esigenze.
  9. Aggiungere rhIL-2 (20 U/mL) (vedere la tabella dei materiali), mescolare delicatamente e trasferire la miscela in un recipiente appropriato (ad es. piastra a 6 pozzetti).
  10. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 per 72 ore.

2. Trasduzione lentivirale delle cellule T (Giorno 3)

  1. Trasferire la coltura cellulare in un recipiente adatto, ad esempio una provetta conica da 50 ml. Mescolare bene e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (RT) per rimuovere il reagente di attivazione. Scartare con cura completamente il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno completo.
    NOTA: In questa fase, è possibile scongelare il virus sul ghiaccio.
  2. Conta le cellule usando il blu di tripano.
  3. Risospendere le cellule in un terreno completo per ottenere una concentrazione che consenta di placcare 0,5 x 106 cellule in un volume totale di 400 μL per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere rhIL-7 (155 U/mL) e rhIL-15 (290 U/mL) (vedi Tabella dei materiali).
    NOTA: Assicurarsi di tenere conto del volume di virus da aggiungere. Fare riferimento al punto 2.4.
  4. In una provetta separata, aggiungere Vectofusin-1 (vedere Tabella dei materiali) al terreno Opti-MEM ad una concentrazione di 10 μg/mL, con un volume pari al volume virale da utilizzare.
    NOTA: Considerare il volume totale della coltura cellulare quando si calcola la concentrazione di Vectofusin-1. Vedere il passaggio 2.3. In alternativa, Vectofusin-1 GMP può essere utilizzato come reagente di grado GMP.
  5. Combinare il virus concentrato a una molteplicità di infezione (MOI) di 40 con la miscela Vectofusin-1/Opti-MEM (rapporto 1:1) e mescolare accuratamente. Aggiungere questa miscela alla coltura cellulare e regolare il volume totale a 400 μL per pozzetto utilizzando un terreno completo, se necessario.
  6. Mettere il coperchio sul piatto, sigillarlo con pellicola di paraffina e centrifugare a 1000 x g per 2 h a 32 °C. Successivamente, incubare la piastra a 37 °C, 5% CO2 per una notte.

3. Rimozione del virus ed espansione delle cellule T (Giorno 4)

  1. Raccogliere le cellule e raggrupparle in un recipiente adatto, come una provetta da 50 ml.
  2. Centrifugare le cellule a 400 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 min. Rimuovere con cautela completamente il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno completo.
  3. Conta le cellule usando il blu di tripano. Risospendere le cellule in terreno completo ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL. Aggiungere rhIL-7 (155 U/mL) e rhIL-15 (290 U/mL) (vedi Tabella dei materiali).
  4. Trasferire le cellule in un recipiente appropriato, ad esempio un matraccio T25, ad una concentrazione di 0,3-0,5 x 106 cellule/cm2 e incubarle a 37 °C, 5% CO2 , per 2 giorni.
    NOTA: Se è necessaria una popolazione cellulare più ampia, le cellule possono essere sottocoltivate (1:2) in presenza di rhIL7 e rhIL-15 ogni 2 giorni, seguendo le stesse condizioni di incubazione sopra menzionate, fino al raggiungimento del numero di cellule desiderato.

4. Crioconservazione (giorno 14)

NOTA: Durante questa fase, sarà necessario del ghiaccio per trasferire i crioviali nel luogo di conservazione. La tempistica della crioconservazione dipende dal numero di cellule desiderate. Per questo protocollo, la crioconservazione viene eseguita il giorno 14 dopo aver raggiunto un'espansione di 25 volte.

  1. Una volta raggiunto il numero di cellule desiderato, prelevare le cellule e trasferirle in provette da 50 mL (regolare il numero di provette in base al volume totale).
  2. Centrifugare le provette a 400 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 min. Rimuovere con cautela completamente il surnatante e risospendere il pellet in 10 mL di terreno. Se necessario, raggruppare le cellule da più provette.
  3. Conta le cellule usando il blu di tripano. Mantenere un'aliquota di 1 x 106 celle per ogni test di controllo qualità (QC) (fare riferimento alla Sezione 5) per valutare il numero di copie vettoriali e l'efficienza di trasduzione.
  4. Centrifugare le provette a 400 x g per 10 minuti a RT. A questo punto, etichettare i crioviali di conseguenza.
  5. Rimuovere completamente il surnatante e risospendere il pellet in una soluzione di crioconservazione composta dal 50% di HSA e dal 40% di HBSS a una concentrazione di 1 x 107 cellule per mL per crioviale. Trasferire la sospensione cellulare nel numero appropriato di crioviali e aggiungere il 10% di dimetilsolfossido (DMSO) a ciascun crioviale.
  6. Mettere i crioviali sul ghiaccio e trasferirli prontamente in un congelatore a velocità controllata per la crioconservazione. Dopo la crioconservazione, trasferire i crioviali in un serbatoio di azoto liquido monitorato per la conservazione a lungo termine.

5. Controllo qualità (giorno 14)

NOTA: Per i test di rilascio, il prodotto è stato sottoposto a diversi test, inclusi test di sterilità per la crescita microbica e valutazione del livello di endotossine. Questi test sono stati condotti in laboratori certificati presso l'Ospedale Generale Universitario di Patrasso e l'Università di Patrasso. La presenza di micoplasmi è stata determinata internamente utilizzando un test di rilevamento biochimico e misurata su un luminometro seguendo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali). Il fenotipo cellulare (Figura 1), il numero di cellule e la vitalità sono stati valutati internamente mediante citometria a flusso (vedere paragrafo 5.1) e un contatore automatico di cellule (vedere la tabella dei materiali), rispettivamente. I criteri di rilascio sono stati stabiliti sulla base dei dati pubblicati e delle raccomandazioni10,11 per i prodotti cellulari prodotti secondo GMP (Tabella 1).

  1. Eseguire la colorazione citometrica a flusso di efficienza di trasduzione (Giorno 14)
    NOTA: Un'aliquota di 1 x 106 cellule sarà colorata per la vitalità (7-AAD) e il marcatore CD32 per valutare l'efficienza di trasduzione (vedi Tabella dei materiali). Se il gene di interesse, come nel caso delle cellule CAR-T, deve essere rilevato, l'anticorpo specifico deve essere di un colore diverso da quello del marcatore CD3 e 7-AAD per evitare la compensazione. Devono essere presi in considerazione campioni di controllo appropriati.
    1. Mettere il campione in una provetta FACS e aggiungere 500 μL di tampone FACS.
    2. Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min.
    3. Scartare completamente il surnatante con una pipetta e risospendere il pellet in una soluzione diluita 1:5 di tampone CD3:FACS (vedere Tabella dei materiali).
    4. Agitare il campione e incubare per 30 minuti su ghiaccio al buio.
    5. Aggiungere 500 μL di tampone FACS. Centrifugare a 400 x g per 5 min (RT).
    6. Scartare completamente il surnatante e risospendere il pellet in una soluzione diluita 1:20 di tampone 7-AAD:FACS (vedere Tabella dei materiali).
    7. Vorticare il campione e incubare per 10 minuti su ghiaccio al buio.
    8. Aggiungere 200 μL di tampone FACS e analizzare il campione utilizzando un citometro a flusso (vedere la tabella dei materiali).

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Risultati

Valutazione dell'efficienza di trasduzione
Le cellule trasdotte sono state valutate per l'espressione del gene di interesse (GFP) utilizzando la citometria a flusso. I risultati rappresentativi sono illustrati nella Figura 1. Il giorno 14, oltre il 95% delle cellule era CD3+, indicando un'attivazione e un'espansione delle cellule T di successo. L'efficienza di trasduzione all'interno della popolazione CD3+ è stata misurata al 58,7% (TD, <...

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Discussione

I vettori lentivirali come veicoli di veicolazione genica sono strumenti importanti nel campo della terapia cellulare e genica a causa della loro capacità di trasdurre sia cellule in divisione che in divisione12. Tuttavia, la produzione su larga scala di vettori lentivirali utilizzando metodi compatibili con le GMP è ancora impegnativa a causa di vari parametri, come i metodi di trasfezione e le fasi di purificazione, che possono comportare variabilità nei lotti di lentivirus. I centri accademi...

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Divulgazioni

N.S. ha sviluppato il protocollo e scritto il manoscritto che è stato revisionato e supervisionato da A.S.; K.S., G.A. eseguì ulteriori esperimenti; D.K., M.L. ha fornito un valido supporto negli esperimenti e insieme a V.Z., N.T. nel processo di revisione. N.T. è membro di ProtATonce Ltd. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata co-finanziata dall'Unione Europea e dai fondi nazionali greci attraverso il Programma Operativo Competitività, Imprenditorialità e Innovazione, nell'ambito del bando RESEARCH - CREATE - INNOVATE (codice progetto: T2EDK - 00474). Vorremmo anche esprimere la nostra gratitudine alla Fondazione Choose Life per aver fornito un supporto continuo al GMP Lab "Dimitris Lois" dell'Istituto di Terapia Cellulare.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well TC-treated plateCorning353047
5 mL FACS tube Corning352054
50 mL Falcon tubesGreiner biomedica227261
6-well TC-treated plateCorning353046
7-AADBD Biosciences559925
BD FACS CANTO IIBD BiosciencesV96300084
BSAApplichemA1391
Cell Counter Corning Cell CytosmartJ21E0081
CryovialsGreiner biomedica122263
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)Life Technologies14190
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)--
FlowJo Software v10.6.2 TreeStar Inc-
Gibco CTS Opti-MEM I MediumThermoFisher ScientificA4124801
GMP rhIL-15Miltenyi Biotec170-076-114
GMP rhIL-2Miltenyi Biotec170-076-146
GMP rhIL-7Miltenyi Biotec170-076-111
Hanks’s Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175
HEPA Whitley H35 HypoxystationDon Whitley ScientificHA0315172H
Human Serum Albumin (HSA)BaxterB05AA01
Junior LB 9509 Portable LuminometerBerthold Technologies6506
Lenti-X Provirus Quantitation KitTakara Bio631239
LymphoprepStemcell Technologies7811
MACS GMP T cell TransActMiltenyi Biotec170-076-156
Mouse Anti-Human  CD3 (Clone: UCHT-1)BD Biosciences557706
MycoAlert Plus Detection kitLonza BioscienceLT07-703
Parafilm ultra-expandable closing film tape 5 cm x 75 mD.Dutscher90261
PeriStem PS-650-DB (apheresis bag)Biomed DeviceSC00816
Planer Kryo10 Series IIIPlaner
T75 flasksGreiner biomedica658175
Trypan blue, 0.4% solutionInvitrogenT10282
Vectofusin-1 GMPMiltenyi Biotec170-076-165
X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza BioscienceA1048501

Riferimenti

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