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요약

이 프로토콜은 관심 유전자를 가진 일차 인간 T 세포를 형질도입하는 과정을 간략하게 설명하여 GMP(Good Manufacturing Practice) 표준과의 호환성을 보장합니다.

초록

입양 세포 치료(ACT) 분야는 유전자 변형 세포, 특히 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포의 개발로 혁명을 일으켰습니다. 이 변형된 세포는 혈액 악성 종양 환자에서 주목할 만한 임상 반응을 보였습니다. 그러나 이러한 치료법을 생산하고 광범위한 품질 관리 평가를 수행하는 데 드는 높은 비용으로 인해 더 광범위한 환자에 대한 접근성이 제한되었습니다. 이 문제를 해결하기 위해 많은 학술 기관에서 국내 및 국제 규제 기관에서 정한 지침을 준수하면서 유전자 변형 세포의 자체 제조의 타당성을 모색하고 있습니다.

유전자 변형 T 세포 제품을 대규모로 제조하는 것은 특히 기관의 생산 능력과 주입량 요구 사항을 충족해야 하는 필요성 측면에서 몇 가지 문제를 야기합니다. 한 가지 주요 과제는 GMP(Good Manufacturing Practice) 지침에 따라 대규모 바이러스 벡터를 생산하는 것인데, 이는 종종 외부 회사에 아웃소싱됩니다. 또한 T 세포 형질 주입 공정을 단순화하면 생산 배치 간의 변동성을 최소화하고 비용을 절감하며 직원 교육을 용이하게 할 수 있습니다. 이 연구에서는 관심 유전자인 형광 마커를 사용하여 일차 인간 T 세포의 렌티바이러스 transduction을 위한 간소화된 프로세스를 간략하게 설명합니다. 전체 프로세스는 GMP 준수 표준을 준수하며 교육 기관 내에서 구현됩니다.

서문

입양 세포 치료제(ACT)와 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포의 출현은 현대 임상 진료에 혁명적인 변화를 가져왔고 개인 맞춤형 의학의 새로운 패러다임을 확립했습니다. 특히 CD19를 표적으로 하는 CAR-T 세포는 B세포 악성종양 1,2,3,4,5에 대한 가장 진보된 T세포 치료제로서 탁월한 임상반응을 보였다. 그러나 현재 상용화된 유전자 변형 T 세포 치료제는 유전자 전달을 위해 바이러스 벡터에 크게 의존하고 있습니다. ACT에서 바이러스 벡터를 구현하는 것은, 특히 학술 환경 내의 GMP(Good Manufacturing Practice) 조건 하에서 확장성 제한, 특수 장비 요구 사항, 고도로 숙련된 인력의 필요성 및 플라스미드 매개 바이러스 입자 생산을 위한 GMP 준수 시약의 사용으로 인해 상당한 과제를 제시합니다 6,7,8.

결과적으로, 유전자 변형 T 세포 치료제의 제조 공정은 복잡하며 일반적으로 백혈구 분리술 산물에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하는 것으로 시작됩니다. T 세포는 종종 PBMC 풀에서 농축되고 항-CD3/CD28 미세 복합체를 사용하여 활성화됩니다 7,9. 그 후, T 세포는 바이러스 또는 비바이러스 벡터로 유전자 변형되며, 이는 현장에서 생산되거나 아웃소싱될 수 있습니다. 주입에 필요한 세포 수를 얻기 위해 최종 제형 및/또는 동결 보존 전에 유전자 변형 세포를 확장합니다. 마지막으로, 세포 제품은 여러 품질 관리 분석에 기반한 다양한 방출 기준을 충족해야 합니다9.

이 프로토콜은 GMP 준수 조건에서 유전자 변형 T 세포 제품을 제조하기 위해 건강한 PBMC의 생체 외 조작을 위한 간단한 기술을 활용하는 포괄적인 방법론을 제시합니다. 이 프로토콜은 필요한 모든 정량적/기능적, 순도 및 안전성 테스트(예: 바이러스 역가, 숙주 세포 DNA 복제 가능 렌티바이러스 검출)를 제공하는 바이러스 생산 회사에 아웃소싱할 수 있는 렌티바이러스 벡터의 사용을 통합합니다. 이 연구에서 사용된 벡터는 구성 발현에서 녹색 형광 단백질(GFP)을 관심 유전자로 하는 VSV-g(수포성 구내염 바이러스 G 단백질) 기반 2세대 렌티바이러스 벡터입니다.

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프로토콜

이 연구는 파트라스 대학의 윤리 위원회와 파트라스 대학 종합 병원의 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 생물학적 표본을 얻기 전에 건강한 개인으로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 참가자의 적격성 평가는 제도적 절차에 따라 백혈구 분리술에 대한 JACIE 표준에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜이 임상 ACT 환경에서 구현되려면 모든 절차가 GMP(Good Manufacturing Practice) 지침을 준수하고 GMP를 준수하는 클린룸에서 수행되어야 합니다. 바이러스 벡터로 작업할 때는 특별한 안전 예방 조치가 필요하며, 이러한 절차는 전용 생물 안전 캐비닛 내에서 수행해야 합니다. 이 연구에서 설명된 절차는 제어 및 모니터링되는 환경을 보장하기 위해 검증된 H35 HEPA Hypoxystation( 재료 표 참조) 내에서 수행되었습니다. 모든 유해 액체의 오염 제거는 10% 표백제 용액을 사용하여 수행해야 합니다.

1. PBMC 분리 및 T 세포 활성화(Day 0)

  1. 초기 부피에 따라 donor apheresis bag(leukopaks, 재료 표 참조)에서 세포를 50mL 튜브로 수집합니다.
  2. 15mL의 완전 조혈액(+5% HSA, 상업용 무혈청 조혈액, 재료 표 참조)을 주입하여 세포 백을 두 번 세척합니다.
  3. 다당류 기반 밀도 구배 원심분리를 1:2(시약:시료) 희석으로 수행합니다. 800 x g 에서 실온에서 30분 동안 원심분리기(A/D, 9/0).
  4. 마이크로피펫을 사용하여 PBMC를 깨끗한 50mL 튜브에 수집합니다.
  5. 1x PBS로 세포를 두 번 세척하고 세척할 때마다 최대 50mL를 채웁니다(400 x g, 10분, 실온). 세포를 5mL의 완전한 배지에 재현탁시킵니다.
  6. 표준 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 trypan blue를 사용하여 세포를 계수합니다( 재료 표 참조).
  7. 세포를 완전한 배지로 희석하여 2 x 106 cells/mL의 농도를 달성합니다.
  8. 2 x 106 시작 세포당 10μL의 T 세포 자극 시약(재료 표 참조)을 추가하여 20 x 106 PBMC를 활성화합니다.
    참고: 이 프로토콜은 20 x 106 PBMC의 활성화를 위해 설계되었지만 필요에 따라 더 큰 셀 수에 맞게 조정할 수 있습니다.
  9. rhIL-2(20U/mL)를 추가하고( 재료 표 참조) 부드럽게 혼합한 다음 혼합물을 적절한 용기(예: 6웰 플레이트)에 옮깁니다.
  10. 세포를 37°C, 5%CO2 에서 72시간 동안 배양합니다.

2. 렌티바이러스 T세포 형질도입(3일차)

  1. 세포 배양액을 50mL 코니컬 튜브와 같은 적절한 용기로 옮깁니다. 잘 섞고 실온(RT)에서 10분 동안 300 x g 으로 원심분리하여 활성화 시약을 제거합니다. 상층액을 조심스럽게 완전히 버리고 펠릿을 1mL의 완전한 배지에 재현탁시킵니다.
    알림: 이 단계에서 얼음 위에서 바이러스를 해동할 수 있습니다.
  2. trypan blue를 사용하여 셀 수를 셉니다.
  3. 24웰 플레이트에서 웰당 총 부피 400μL로 0.5 x 106 개 셀을 도금할 수 있는 농도를 얻기 위해 셀을 완전한 배지에 재현탁시킵니다. rhIL-7(155U/mL) 및 rhIL-15(290U/mL)를 추가합니다( 재료 표 참조).
    참고: 추가할 바이러스의 양을 고려해야 합니다. 2.4단계를 참조하십시오.
  4. 별도의 튜브에 Vectofusin-1( 재료 표 참조)을 사용할 바이러스 부피와 동일한 부피로 10μg/mL 농도의 Opti-MEM 배지에 추가합니다.
    참고: Vectofusin-1의 농도를 계산할 때 총 세포 배양 부피를 고려하십시오. 2.3단계를 참조하십시오. 또는 Vectofusin-1 GMP를 GMP 등급 시약으로 사용할 수 있습니다.
  5. MOI(Multiplicity of Infection) 40의 농축 바이러스를 Vectofusin-1/Opti-MEM 혼합물(1:1 비율)과 결합하고 완전히 혼합합니다. 이 혼합물을 세포 배양에 추가하고 필요한 경우 전체 배지를 사용하여 웰당 총 부피를 400μL로 조정합니다.
  6. 접시에 뚜껑을 놓고 파라핀 필름으로 밀봉한 다음 1000 x g 에서 32°C에서 2시간 동안 원심분리합니다. 그 후, 플레이트를 37 °C, 5 % CO2 에서 밤새 배양합니다.

3. 바이러스 제거 및 T 세포 증식(4일차)

  1. 세포를 수집하여 50mL 튜브와 같은 적절한 용기에 모습니다.
  2. 실온(RT)에서 400 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 완전히 제거하고 펠릿을 1mL의 완전한 배지에 다시 현탁시킵니다.
  3. trypan blue를 사용하여 셀 수를 셉니다. 세포를 1 x 106 cells/mL의 농도로 완전한 배지에 재현탁시킵니다. rhIL-7(155U/mL) 및 rhIL-15(290U/mL)를 추가합니다( 재료 표 참조).
  4. 세포를 0.3-0.5 x 106 cells/cm2 농도의 T25 플라스크와 같은 적절한 용기로 옮기고 37°C, 5%CO2에서 2일 동안 배양합니다.
    참고: 더 많은 세포 집단이 필요한 경우, 원하는 세포 수에 도달할 때까지 위에서 언급한 것과 동일한 배양 조건에 따라 2일마다 rhIL7 및 rhIL-15가 있는 상태에서 세포를 하위 배양(1:2)할 수 있습니다.

4. 냉동 보존(14일차)

알림: 이 단계에서 냉동 에너지를 보관 위치로 옮기려면 얼음이 필요합니다. 냉동 보존 시기는 원하는 세포 수에 따라 다릅니다. 이 프로토콜의 경우 25배 확장을 달성한 후 14일째에 냉동 보존을 수행합니다.

  1. 원하는 세포 수에 도달하면 세포를 수확하여 50mL 튜브로 옮깁니다(총 부피에 따라 튜브 수 조정).
  2. 실온(RT)에서 400 x g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 완전히 제거하고 펠릿을 10mL의 배지에 다시 현탁시킵니다. 필요한 경우 여러 튜브에서 세포를 합칩니다.
  3. trypan blue를 사용하여 셀 수를 셉니다. 벡터 복제 수와 형질도입 효율을 평가하기 위해 각 품질 관리(QC) 테스트(섹션 5 참조)에 대해 1 x 106 세포의 부분 표본을 유지합니다.
  4. RT에서 400 x g 에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다. 이 시점에서 그에 따라 냉동 장치에 레이블을 지정합니다.
  5. 상층액을 완전히 제거하고 펠릿을 50% HSA 및 40% HBSS로 구성된 동결 보존 용액에 재현탁시키며, 극저온 당 mL당 1 x 107 세포의 농도로 합니다. 셀 현탁액을 적절한 수의 극저온 증류액에 옮기고 각 극저온 복제본에 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가합니다.
  6. 극저온 보존을 얼음 위에 놓고 즉시 속도 조절이 가능한 냉동고로 옮깁니다. 냉동 보존 후 장기 보관을 위해 극저온을 모니터링되는 액체 질소 탱크로 옮깁니다.

5. 품질 관리(14일차)

알림: 방출 테스트를 위해 제품은 미생물 성장에 대한 무균 테스트 및 내독소 수준 평가를 포함한 여러 테스트를 거쳤습니다. 이 테스트는 파트라스 종합 병원과 파트라스 대학교의 인증된 실험실에서 수행되었습니다. 마이코플라스마 존재는 생화학적 검출 분석을 사용하여 사내에서 측정되었으며 제조업체의 지침에 따라 광도계에서 측정되었습니다(재료 표 참조). 세포 표현형(그림 1)과 세포 수 및 생존율은 각각 유세포 분석(섹션 5.1 참조) 및 자동 세포 카운터(재료 표 참조)를 통해 사내에서 평가되었습니다. 방출 기준은 GMP 생산 세포 제품에 대해 발표된 데이터 및 권장 사항10,11을 기반으로 설정되었습니다(표 1).

  1. transduction efficiency-flow cytometry staining 수행(14일차)
    참고: 형질도입 효율을 평가하기 위해 생존도(7-AAD) 및 CD3 마커2에 대해 1 x 106 세포의 부분 표본을 염색합니다(재료 표 참조). CAR T 세포의 경우와 같이 관심 유전자를 검출해야 하는 경우, 특정 항체는 보상을 피하기 위해 CD3 마커 및 7-AAD의 색상과 다른 색상이어야 합니다. 적절한 대조군 샘플을 고려해야 합니다.
    1. 샘플을 FACS 튜브에 넣고 500μL의 FACS 완충액을 추가합니다.
    2. 상온에서 400 x g 으로 튜브를 5분 동안 원심분리합니다.
    3. 피펫으로 상층액을 완전히 버리고 펠릿을 CD3:FACS 완충액의 1:5 희석 용액에 재현탁시킵니다( 재료 표 참조).
    4. 샘플을 소용돌이치게 하고 어둠 속에서 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
    5. 500μL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 400 x g 에서 5분(RT) 동안 원심분리기.
    6. 상층액을 완전히 버리고 펠릿을 1-AAD:FACS 완충액의 20:7 희석된 용액에 재현탁시킵니다( 재료 표 참조).
    7. 샘플을 소용돌이치고 어둠 속에서 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
    8. 200μL의 FACS 완충액을 추가하고 유세포 분석기를 사용하여 샘플을 분석합니다( 재료 표 참조).

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결과

형질 도입 효율 평가
형질도입된 세포는 유세포 분석을 사용하여 관심 유전자(GFP)의 발현에 대해 평가되었습니다. 대표적인 결과는 그림 1에 나와 있습니다. 14일째에는 세포의 95% 이상이 CD3+로 나타났으며, 이는 성공적인 T 세포 활성화 및 증식을 나타냅니다. CD3+ 집단 내의 형질도입 효율은 58.7%(TD, 그림 1C)로 측?...

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토론

유전자 전달 매개체로서의 렌티바이러스 벡터는 분열하는 세포와 분열하지 않는 세포를 모두 형질도입할 수 있기 때문에 세포 및 유전자 치료 분야에서 중요한 도구이다12. 그러나 GMP 호환 방법을 사용한 렌티바이러스 벡터의 대규모 생산은 transfection 방법 및 정제 단계와 같은 다양한 파라미터로 인해 렌티바이러스 배치에 변동성이 발생할 수 있기 때문에 여전히 어렵습니다. ?...

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공개

N.S.는 프로토콜을 개발하고 A.S.가 검토하고 감독한 원고를 썼습니다. K.S., G.A.는 추가 실험을 수행했습니다. D.K., M.L.은 실험에서 귀중한 지원을 제공했으며 검토 과정에서 V.Z., N.T.와 함께 귀중한 지원을 제공했습니다. N.T.는 ProtATonce Ltd.의 회원입니다. 다른 모든 저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 RESEARCH - CREATE - INNOVATE (프로젝트 코드 : T2EDK - 00474)라는 이름으로 운영 프로그램 경쟁력, 기업가 정신 및 혁신을 통해 유럽 연합과 그리스 국가 기금이 공동 자금을 지원했습니다. 또한 세포치료연구소의 GMP 연구소 "Dimitris Lois"에 지속적인 지원을 해주신 Choose Life Foundation에 감사의 말씀을 전합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well TC-treated plateCorning353047
5 mL FACS tube Corning352054
50 mL Falcon tubesGreiner biomedica227261
6-well TC-treated plateCorning353046
7-AADBD Biosciences559925
BD FACS CANTO IIBD BiosciencesV96300084
BSAApplichemA1391
Cell Counter Corning Cell CytosmartJ21E0081
CryovialsGreiner biomedica122263
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)Life Technologies14190
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)--
FlowJo Software v10.6.2 TreeStar Inc-
Gibco CTS Opti-MEM I MediumThermoFisher ScientificA4124801
GMP rhIL-15Miltenyi Biotec170-076-114
GMP rhIL-2Miltenyi Biotec170-076-146
GMP rhIL-7Miltenyi Biotec170-076-111
Hanks’s Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175
HEPA Whitley H35 HypoxystationDon Whitley ScientificHA0315172H
Human Serum Albumin (HSA)BaxterB05AA01
Junior LB 9509 Portable LuminometerBerthold Technologies6506
Lenti-X Provirus Quantitation KitTakara Bio631239
LymphoprepStemcell Technologies7811
MACS GMP T cell TransActMiltenyi Biotec170-076-156
Mouse Anti-Human  CD3 (Clone: UCHT-1)BD Biosciences557706
MycoAlert Plus Detection kitLonza BioscienceLT07-703
Parafilm ultra-expandable closing film tape 5 cm x 75 mD.Dutscher90261
PeriStem PS-650-DB (apheresis bag)Biomed DeviceSC00816
Planer Kryo10 Series IIIPlaner
T75 flasksGreiner biomedica658175
Trypan blue, 0.4% solutionInvitrogenT10282
Vectofusin-1 GMPMiltenyi Biotec170-076-165
X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza BioscienceA1048501

참고문헌

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