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要約

このプロトコルは、適正製造基準(GMP)規格との互換性を確保し、関心のある遺伝子を持つ初代ヒトT細胞を形質導入するプロセスを概説します。

要約

養子細胞療法(ACT)の分野は、遺伝子組み換え細胞、特にキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の開発によって革命を起こしました。これらの改変細胞は、血液悪性腫瘍の患者において顕著な臨床反応を示しています。しかし、これらの治療法を製造し、広範な品質管理評価を実施するには高いコストがかかるため、より幅広い患者がアクセスできるように制限されています。この問題に対処するために、多くの学術機関は、国内外の規制当局によって設定されたガイドラインを遵守しながら、遺伝子組み換え細胞の内製化の実現可能性を模索しています。

遺伝子組み換えT細胞製品を大規模に製造するには、特に施設の生産能力と輸液量の要件を満たす必要性の点で、いくつかの課題があります。大きな課題の1つは、GMP(Good Manufacturing Practice)ガイドラインの下で大規模なウイルスベクターを製造することであり、外部企業に委託することがよくあります。さらに、T細胞形質導入プロセスを簡素化することで、生産バッチ間のばらつきを最小限に抑え、コストを削減し、人材育成を促進することができます。この研究では、蛍光マーカーを目的の遺伝子として用いた初代ヒトT細胞のレンチウイルス形質導入の合理化されたプロセスの概要を説明します。プロセス全体はGMP準拠の基準に準拠しており、当社の学術機関内で実施されています。

概要

養子細胞療法(ACT)とキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の出現は、現代の臨床診療に革命的な変化をもたらし、個別化医療の新しいパラダイムを確立しました。特に、CD19を標的とするCAR-T細胞は、優れた臨床反応を示しており、B細胞悪性腫瘍に対する最先端のT細胞療法を表しています1,2,3,4,5。しかし、現在市販されている遺伝子改変T細胞治療は、遺伝子導入をウイルスベクターに大きく依存しています。ACTにおけるウイルスベクターの実装は、特に学術環境における適正製造基準(GMP)条件下では、スケーラビリティの制限、特殊な機器要件、高度なスキルを持つ人材の必要性、およびプラスミドを介したウイルス粒子生産のためのGMP準拠の試薬の使用により、大きな課題を提示します6,7,8。

その結果、遺伝子改変T細胞治療の製造プロセスは複雑であり、通常、白血球アフェレーシス製品から末梢血単核細胞(PBMC)を分離することから始まります。T細胞はしばしばPBMCプールから濃縮され、抗CD3/CD28マイクロ複合体を用いて活性化される7,9。その後、T細胞はウイルスまたは非ウイルスベクターのいずれかで遺伝子改変され、その場で生産することも、外部委託することもできます。注入に必要な細胞数を達成するために、遺伝子改変細胞は、最終的な製剤化および/または凍結保存の前に増殖されます。最後に、細胞産物は、複数の品質管理アッセイに基づく様々な放出基準を満たさなければならない9。

このプロトコルはGMP迎合的な条件の下で遺伝子変更されたT細胞プロダクトを製造するのに健康なPBMCsの 生体外で の処理のための簡単な技術を利用する広範囲の方法論を示す。このプロトコルにはレンチウイルスベクターの使用が組み込まれており、必要なすべての定量的/機能的、純度、および安全性試験(ウイルス力価、宿主細胞DNA複製適格レンチウイルスの検出など)を提供するウイルス製造会社に委託できます。本研究では、VSV-g(水疱性口内炎ウイルスGタンパク質)ベースの第2世代レンチウイルスベクターに、目的遺伝子として緑色蛍光タンパク質(GFP)を構成的に発現させたベクターを採用しました。

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プロトコル

この研究は、パトラス大学の倫理委員会とパトラス大学総合病院の治験審査委員会によって承認されました。生物学的標本を取得する前に、健康な個人からインフォームドコンセントが得られました。参加者の適格性評価は、施設の手順に従って、白血球アフェレーシスのJACIE基準に準拠して実施されました。このプロトコルを臨床ACT設定で実施する場合、すべての手順は適正製造基準(GMP)ガイドラインに準拠し、GMP準拠のクリーンルームで実施する必要があります。ウイルスベクターを扱う際には特別な安全対策が必要であり、これらの手順は専用のバイオセーフティキャビネット内で実施する必要があります。この研究では、説明されている手順は、制御および監視された環境を確保するために、検証済みのH35 HEPA催眠( 材料表を参照)内で実施されました。すべての危険な液体の除染は、10%漂白剤溶液を使用して行う必要があります。

1. PBMC単離とT細胞活性化(0日目)

  1. ドナーアフェレーシスバッグ(ロイコパック、 材料表を参照)から細胞を初期容量に応じて50 mLチューブに集めます。
  2. 15 mLの完全な造血培地(+5% HSA、市販の無血清造血培地、 材料表を参照)を注入して、セルバッグを2回洗浄します。
  3. 多糖類ベースの密度勾配遠心分離を1:2(試薬:サンプル)の希釈で実施します。800 x g で室温で30分間遠心分離し、ブレークオフします(A/D、9/0)。
  4. マイクロピペットを使用して、PBMCを清潔な50 mLチューブに回収します。
  5. 細胞を1x PBSで2回洗浄し、洗浄ごとに最大50 mLを充填します(400 x g、10分、室温)。細胞を5 mLの完全培地に再懸濁します。
  6. 標準的な血球計算盤または自動セルカウンターのいずれかを使用して、トリパンブルーを使用して細胞をカウントします( 材料表を参照)。
  7. 細胞を完全培地で希釈し、濃度が 2 x 106 cells/mL になるようにします。
  8. 2 x 10 6開始細胞あたり10 μLのT細胞刺激試薬(材料表を参照)を添加して、20 x 106 PBMCを活性化します。
    注:このプロトコルは、20 x 106 PBMC の活性化用に設計されていますが、必要に応じてより大きなセル数に調整できます。
  9. rhIL-2(20 U/mL)( 材料表を参照)を添加し、穏やかに混合し、適切な容器(6ウェルプレートなど)に移します。
  10. 細胞を37°C、5%CO2 で72時間インキュベートします。

2.レンチウイルスT細胞形質導入(3日目)

  1. 細胞培養液を50 mLのコニカルチューブなどの適切な容器に移します。よく混合し、室温(RT)で300 x g で10分間遠心分離し、活性化試薬を除去します。上清を完全に慎重に廃棄し、ペレットを1 mLの完全な培地に再懸濁します。
    注:この段階では、氷の上でウイルスを解凍することが可能です。
  2. トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。
  3. 細胞を完全培地に再懸濁し、24ウェルプレートにウェルあたり総容量400 μLの0.5 x 106 細胞を播種できる濃度にします。rhIL-7(155 U/mL)およびrhIL-15(290 U/mL)を添加します( 材料表を参照)。
    注: 追加するウイルスの量を考慮してください。ステップ2.4を参照してください。
  4. 別のチューブで、ベクトフシン-1( 材料表を参照)をOpti-MEM培地に10 μg/mLの濃度で添加し、使用するウイルス量と同量の量にします。
    注:ベクトフシン-1の濃度を計算する際には、細胞培養の総量を考慮してください。ステップ 2.3 を参照してください。あるいは、ベクトフシン-1 GMPをGMPグレードの試薬として使用することもできます。
  5. 感染多重度(MOI)40の濃縮ウイルスとベクトフシン-1/Opti-MEM混合物(1:1の比率)を混合し、完全に混合します。この混合物を細胞培養物に加え、必要に応じて、完全培地を使用してウェルあたり総容量を400μLに調整します。
  6. プレートに蓋をしてパラフィンフィルムで密封し、1000 x g で32°Cで2時間遠心分離します。 続いて、プレートを37°C、5%CO2 で一晩インキュベートします。

3.ウイルス除去とT細胞増殖(4日目)

  1. 細胞を回収し、50 mLチューブなどの適切な容器にプールします。
  2. 細胞を室温(RT)で400 x g で5分間遠心分離します。上清を慎重に完全に除去し、ペレットを1 mLの完全培地に再懸濁します。
  3. トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。細胞を完全培地に1 x 106 細胞/mLの濃度で再懸濁します。rhIL-7(155 U/mL)およびrhIL-15(290 U/mL)を添加します( 材料表を参照)。
  4. 細胞を0.3-0.5 x 106 細胞/cm2 の濃度でT25フラスコなどの適切な容器に移し、37°C、5%CO2で2日間インキュベートします。
    注:より大きな細胞集団が必要な場合は、rhIL7およびrhIL-15の存在下で、上記と同じインキュベーション条件に従って、目的の細胞数が得られるまで、2日ごとに細胞を継代培養(1:2)することができます。

4.凍結保存(14日目)

注:このステップでは、クライオバイアルを保管場所に移すには氷が必要です。凍結保存のタイミングは、目的の細胞数によって異なります。このプロトコルでは、凍結保存は 25 倍の拡大を達成した後、14 日目に実施されます。

  1. 目的の細胞数に達したら、細胞を回収し、50 mLチューブに移します(総容量に基づいてチューブの数を調整します)。
  2. チューブを室温(RT)で400 x g で5分間遠心分離します。上清を慎重に完全に除去し、ペレットを10 mLの培地に再懸濁します。必要に応じて、複数のチューブから細胞をプールします。
  3. トリパンブルーを使用して細胞をカウントします。ベクターコピー数と形質導入効率を評価するために、各品質管理(QC)テスト(セクション5を参照)ごとに1 x 106 細胞のアリコートを保持します。
  4. チューブを 400 x g で 10 分間遠心分離します。この時点で、それに応じてクライオバイアルにラベルを付けます。
  5. 上清を完全に除去し、50%HSAおよび40%HBSSからなる凍結保存液に、クライオバイアルあたり1 mLあたり1 x 107 細胞の濃度でペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を適切な数のクライオバイアルに移し、各クライオバイアルに10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加します。
  6. クライオバイアルを氷上に置き、速やかに制御された速度の冷凍庫に移して凍結保存します。凍結保存後、クライオバイアルを監視対象の液体窒素タンクに移し、長期保存します。

5.品質管理(14日目)

注:リリーステストでは、微生物の増殖に関する無菌試験やエンドトキシンレベルの評価など、いくつかのテストを受けました。これらの検査は、パトラス大学総合病院とパトラス大学の認定検査室で実施されました。マイコプラズマの存在は、生化学的検出アッセイを用いて社内で測定し、メーカーの指示に従ってルミノメーターで測定しました(材料表を参照)。細胞表現型(図1)、細胞数および生存率は、それぞれフローサイトメトリー(セクション5.1を参照)および自動セルカウンター(材料表を参照)によって社内で評価しました。GMPで製造された細胞製品について、公表されたデータおよび推奨事項10,11に基づいてリリース基準が確立されました(表1)。

  1. 形質導入効率-フローサイトメトリー染色の実施(14日目)
    注:1 x 106 細胞のアリコートを生存率(7-AAD)およびCD3マーカー2 について染色して、形質導入効率を評価します( 材料表を参照)。CAR-T細胞の場合など、目的の遺伝子を検出する必要がある場合は、代償を避けるために、特異的抗体をCD3マーカーおよび7-AADとは異なる色にする必要があります。適切な対照サンプルを考慮する必要があります。
    1. サンプルをFACSチューブに入れ、500μLのFACSバッファーを加えます。
    2. チューブを室温で400 x g で5分間遠心分離します。
    3. 上清をピペットで完全に廃棄し、ペレットをCD3:FACSバッファーの1:5希釈溶液に再懸濁します( 材料表を参照)。
    4. サンプルをボルテックスし、暗所の氷上で30分間インキュベートします。
    5. 500 μLのFACSバッファーを添加します。400 x g で5分間遠心分離します(往復)。
    6. 上清を完全に廃棄し、7-AAD:FACS緩衝液の1:20希釈溶液にペレットを再懸濁します( 材料表を参照)。
    7. サンプルをボルテックスし、暗所の氷上で10分間インキュベートします。
    8. 200 μLのFACSバッファーを添加し、フローサイトメーターを使用してサンプルを分析します( 材料表を参照)。

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結果

形質導入効率の評価
形質導入した細胞は、フローサイトメトリーを用いて目的遺伝子(GFP)の発現を評価しました。代表的な結果を 図1に示します。14日目には、細胞の95%以上がCD3+であり、T細胞の活性化と増殖が成功したことが示されました。CD3+集団内の形質導入効率は58.7%(TD、 図1C)で測定され、形質導入さ?...

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ディスカッション

遺伝子送達担体としてのレンチウイルスベクターは、分裂細胞と非分裂細胞の両方を形質導入する能力があるため、細胞および遺伝子治療の分野で重要なツールです12。しかし、GMP適合法を用いたレンチウイルスベクターの大量生産は、トランスフェクション法や精製ステップなどのさまざまなパラメータにより、レンチウイルスバッチにばらつきが生じる可能性があるた?...

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開示事項

N.S.はプロトコルを開発し、A.S.によって査読され、監督された原稿を書きました。K.S.、G.A.は追加の実験を行いました。D.K., M.L. は、実験と V.Z., N.T. と共に、レビュープロセスにおいて貴重なサポートを提供してくれました。N.T.はProtATonce Ltd.のメンバーです。他のすべての著者は、競合する利害関係がないことを宣言します。

謝辞

この研究は、RESEARCH - CREATE - INNOVATE(プロジェクトコード:T2EDK-00474)の呼びかけの下、Operational Program Competitiveness, Entrepreneurship, and Innovationを通じて、欧州連合とギリシャの国家基金から共同出資されています。また、細胞治療研究所のGMPラボ「Dimitris Lois」に継続的にご支援を賜り、誠にありがとうございます。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well TC-treated plateCorning353047
5 mL FACS tube Corning352054
50 mL Falcon tubesGreiner biomedica227261
6-well TC-treated plateCorning353046
7-AADBD Biosciences559925
BD FACS CANTO IIBD BiosciencesV96300084
BSAApplichemA1391
Cell Counter Corning Cell CytosmartJ21E0081
CryovialsGreiner biomedica122263
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)Life Technologies14190
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)--
FlowJo Software v10.6.2 TreeStar Inc-
Gibco CTS Opti-MEM I MediumThermoFisher ScientificA4124801
GMP rhIL-15Miltenyi Biotec170-076-114
GMP rhIL-2Miltenyi Biotec170-076-146
GMP rhIL-7Miltenyi Biotec170-076-111
Hanks’s Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175
HEPA Whitley H35 HypoxystationDon Whitley ScientificHA0315172H
Human Serum Albumin (HSA)BaxterB05AA01
Junior LB 9509 Portable LuminometerBerthold Technologies6506
Lenti-X Provirus Quantitation KitTakara Bio631239
LymphoprepStemcell Technologies7811
MACS GMP T cell TransActMiltenyi Biotec170-076-156
Mouse Anti-Human  CD3 (Clone: UCHT-1)BD Biosciences557706
MycoAlert Plus Detection kitLonza BioscienceLT07-703
Parafilm ultra-expandable closing film tape 5 cm x 75 mD.Dutscher90261
PeriStem PS-650-DB (apheresis bag)Biomed DeviceSC00816
Planer Kryo10 Series IIIPlaner
T75 flasksGreiner biomedica658175
Trypan blue, 0.4% solutionInvitrogenT10282
Vectofusin-1 GMPMiltenyi Biotec170-076-165
X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza BioscienceA1048501

参考文献

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  2. Brentjens, R., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38(2013).
  3. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  4. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
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