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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit le processus de transduction des lymphocytes T humains primaires avec un gène d’intérêt, garantissant la compatibilité avec les normes des bonnes pratiques de fabrication (BPF).

Résumé

Le domaine de la thérapie cellulaire adoptive (ACT) a été révolutionné par le développement de cellules génétiquement modifiées, en particulier les cellules CAR-T à récepteur antigénique chimérique (CAR). Ces cellules modifiées ont montré des réponses cliniques remarquables chez les patients atteints d’hémopathies malignes. Cependant, le coût élevé de la production de ces thérapies et de la réalisation d’évaluations approfondies du contrôle de la qualité a limité leur accessibilité à un plus large éventail de patients. Pour résoudre ce problème, de nombreuses institutions universitaires étudient la faisabilité de la fabrication interne de cellules génétiquement modifiées, tout en respectant les directives établies par les organismes de réglementation nationaux et internationaux.

La fabrication à grande échelle de produits à base de lymphocytes T génétiquement modifiés présente plusieurs défis, notamment en termes de capacités de production de l’institution et de nécessité de répondre aux exigences en matière de quantité de perfusion. L’un des principaux défis consiste à produire des vecteurs viraux à grande échelle selon les directives des bonnes pratiques de fabrication (BPF), qui sont souvent sous-traitées à des sociétés externes. De plus, la simplification du processus de transduction des lymphocytes T peut aider à minimiser la variabilité entre les lots de production, à réduire les coûts et à faciliter la formation du personnel. Dans cette étude, nous décrivons un processus simplifié de transduction lentivirale des lymphocytes T humains primaires avec un marqueur fluorescent comme gène d’intérêt. L’ensemble du processus respecte les normes conformes aux BPF et est mis en œuvre au sein de notre établissement d’enseignement.

Introduction

L’émergence des thérapies cellulaires adoptives (ACT) et des cellules CAR-T à récepteur antigénique chimérique (CAR) a entraîné un changement révolutionnaire dans la pratique clinique moderne, établissant un nouveau paradigme de médecine personnalisée. En particulier, les cellules CAR-T ciblant CD19 ont démontré des réponses cliniques exceptionnelles et représentent la thérapie par cellules T la plus avancée pour les tumeurs malignes à cellules B 1,2,3,4,5. Cependant, les thérapies à base de lymphocytes T génétiquement modifiés actuellement commercialisées reposent fortement sur des vecteurs viraux pour le transfert de gènes. La mise en œuvre de vecteurs viraux dans l’ACT, en particulier dans des conditions de bonnes pratiques de fabrication (BPF) dans un cadre universitaire, présente des défis importants en raison des limites d’évolutivité, des exigences en matière d’équipement spécialisé, du besoin de personnel hautement qualifié et de l’utilisation de réactifs conformes aux BPF pour la production de particules virales médiées par des plasmides 6,7,8.

Par conséquent, le processus de fabrication des thérapies à base de lymphocytes T génétiquement modifiés est complexe et commence généralement par l’isolement des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir d’un produit de leucaphérèse. Les lymphocytes T sont souvent enrichis à partir du pool PBMC et activés à l’aide de micro-complexes anti-CD3/CD28 7,9. Par la suite, les lymphocytes T sont génétiquement modifiés avec des vecteurs viraux ou non viraux, qui peuvent être produits in situ ou externalisés. Pour atteindre le nombre de cellules requis pour la perfusion, les cellules génétiquement modifiées sont développées avant la formulation finale et/ou la cryoconservation. Enfin, le produit cellulaire doit satisfaire à divers critères de libération basés sur plusieurs tests de contrôle de la qualité9.

Ce protocole présente une méthodologie complète utilisant des techniques simples pour la manipulation ex vivo de PBMC sains afin de fabriquer un produit de lymphocytes T génétiquement modifiés dans des conditions conformes aux BPF. Le protocole comprend l’utilisation d’un vecteur lentiviral, qui peut être sous-traité à une société de production virale fournissant tous les tests quantitatifs/fonctionnels, de pureté et d’innocuité nécessaires (p. ex., titre viral, détection du lentivirus compétent pour la réplication de l’ADN de la cellule hôte). Pour cette étude, le vecteur utilisé est un vecteur lentiviral de deuxième génération basé sur VSV-g (Vésiculeuse Stomatitis Virus G Protein) avec la protéine fluorescente verte (GFP), comme gène d’intérêt, en expression constitutive.

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Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Université de Patras et le Comité d’examen institutionnel de l’Hôpital général universitaire de Patras. Avant d’obtenir des échantillons biologiques, le consentement éclairé a été obtenu auprès d’individus en bonne santé. L’évaluation de l’éligibilité des participants a été menée selon les procédures institutionnelles et conformément aux normes JACIE pour la leucaphérèse. Si ce protocole doit être mis en œuvre dans un cadre clinique ACT, toutes les procédures doivent respecter les directives des bonnes pratiques de fabrication (BPF) et être effectuées dans des salles blanches conformes aux BPF. Des précautions de sécurité spéciales sont nécessaires lorsque l’on travaille avec des vecteurs viraux, et ces procédures doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité dédiée. Dans cette étude, les procédures décrites ont été menées dans une hypoxystation HEPA H35 validée (voir le tableau des matériaux) pour assurer un environnement contrôlé et surveillé. La décontamination de tous les liquides dangereux doit être effectuée à l’aide d’une solution d’eau de Javel à 10 %.

1. Isolement des PBMC et activation des lymphocytes T (Jour 0)

  1. Prélever les cellules du sac d’aphérèse du donneur (leukopaks, voir le tableau des matières) dans des tubes de 50 mL, selon le volume initial.
  2. Effectuer deux lavages du sac cellulaire en perfusant 15 mL de milieu hématopoïétique complet (+5 % HSA, milieu hématopoïétique commercial sans sérum, voir le tableau des matières).
  3. Effectuer une centrifugation à gradient de densité à base de polysaccharides à une dilution 1:2 (réactif :échantillon). Centrifuger à 800 x g pendant 30 min à température ambiante avec pauses (A/D, 9/0).
  4. À l’aide d’une micropipette, prélever les PBMC dans un tube propre de 50 ml.
  5. Lavez les cellules deux fois avec 1x PBS, en remplissant jusqu’à 50 mL pour chaque lavage (400 x g, 10 min, température ambiante). Remettre les cellules en suspension dans 5 mL de milieu complet.
  6. Comptez les cellules à l’aide du bleu trypan à l’aide d’un hémocytomètre standard ou d’un compteur de cellules automatisé (voir le tableau des matériaux).
  7. Diluer les cellules avec un milieu complet pour obtenir une concentration de 2 x 106 cellules/mL.
  8. Activer 20 x 106 PBMC en ajoutant 10 μL de réactif de stimulation des lymphocytes T (voir le tableau des matériaux) par 2 x 106 cellules de départ.
    REMARQUE : Ce protocole est conçu pour l’activation de 20 x 106 PBMC, mais peut être ajusté pour un plus grand nombre de cellules si nécessaire.
  9. Ajouter rhIL-2 (20 U/mL) (voir le tableau des matériaux), mélanger doucement et transférer le mélange dans un récipient approprié (par exemple, une plaque à 6 puits).
  10. Incuber les cellules à 37 °C, 5% CO2 pendant 72 h.

2. Transduction des lymphocytes T lentiviraux (jour 3)

  1. Transférez la culture cellulaire dans un récipient approprié, tel qu’un tube conique de 50 ml. Bien mélanger et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à température ambiante (RT) pour éliminer le réactif d’activation. Jeter soigneusement le surnageant complètement et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu complet.
    REMARQUE : À ce stade, il est possible de décongeler le virus sur de la glace.
  2. Comptez les cellules en utilisant le bleu trypan.
  3. Remettre les cellules en suspension dans un milieu complet pour obtenir une concentration permettant de plaquer 0,5 x 106 cellules dans un volume total de 400 μL par puits dans une plaque de 24 puits. Ajouter rhIL-7 (155 U/mL) et rhIL-15 (290 U/mL) (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : Assurez-vous de tenir compte du volume de virus à ajouter. Reportez-vous à l’étape 2.4.
  4. Dans un tube séparé, ajouter la vectofusine-1 (voir le tableau des matières) au milieu Opti-MEM à une concentration de 10 μg/mL, avec un volume égal au volume viral à utiliser.
    REMARQUE : Tenez compte du volume total de la culture cellulaire lors du calcul de la concentration de Vectofusine-1. Voir étape 2.3. Alternativement, la Vectofusine-1 GMP peut être utilisée comme réactif de qualité GMP.
  5. Combinez le virus concentré à une multiplicité d’infection (MOI) de 40 avec le mélange Vectofusine-1/Opti-MEM (rapport 1:1) et mélangez bien. Ajouter ce mélange à la culture cellulaire et ajuster le volume total à 400 μL par puits en utilisant un milieu complet, si nécessaire.
  6. Placez le couvercle sur la plaque, fermez-la avec un film de paraffine et centrifugez à 1000 x g pendant 2 h à 32 °C. Ensuite, incuber la plaque à 37 °C, 5 % de CO2 pendant la nuit.

3. Élimination du virus et expansion des lymphocytes T (jour 4)

  1. Prélevez les cellules et regroupez-les dans un récipient approprié, tel qu’un tube de 50 ml.
  2. Centrifuger les cellules à 400 x g à température ambiante (RT) pendant 5 min. Retirer soigneusement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu complet.
  3. Comptez les cellules en utilisant le bleu trypan. Remettre les cellules en suspension dans un milieu complet à une concentration de 1 x 106 cellules/mL. Ajouter rhIL-7 (155 U/mL) et rhIL-15 (290 U/mL) (voir le tableau des matériaux).
  4. Transvaser les cellules dans un récipient approprié, tel qu’une fiole T25, à une concentration de 0,3-0,5 x 106 cellules/cm2 et les incuber à 37 °C, 5 % de CO2, pendant 2 jours.
    REMARQUE : Si une population cellulaire plus importante est nécessaire, les cellules peuvent être sous-cultivées (1:2) en présence de rhIL7 et rhIL-15 tous les 2 jours, en suivant les mêmes conditions d’incubation mentionnées ci-dessus, jusqu’à ce que le nombre de cellules souhaité soit atteint.

4. Cryoconservation (Jour 14)

REMARQUE : De la glace sera nécessaire pour transférer les cryoviaux vers le lieu d’entreposage au cours de cette étape. Le moment de la cryoconservation dépend du nombre de cellules souhaité. Pour ce protocole, la cryoconservation est effectuée le jour 14 après avoir atteint une expansion de 25 fois.

  1. Une fois le nombre de cellules désiré atteint, récoltez les cellules et transférez-les dans des tubes de 50 ml (ajustez le nombre de tubes en fonction du volume total).
  2. Centrifuger les tubes à 400 x g à température ambiante (RT) pendant 5 min. Retirer soigneusement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 10 mL de milieu. Si nécessaire, regroupez les cellules de plusieurs tubes.
  3. Comptez les cellules en utilisant le bleu trypan. Conservez une aliquote de 1 x 106 cellules pour chaque test de contrôle de la qualité (voir la section 5) afin d’évaluer le nombre de copies vectorielles et l’efficacité de la transduction.
  4. Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 10 min à RT. À ce stade, étiquetez les cryoflacons en conséquence.
  5. Retirer complètement le surnageant et remettre en suspension la pastille dans une solution de cryoconservation composée de 50 % de HSA et de 40 % de HBSS à une concentration de 1 x 107 cellules par mL par cryoflacon. Transférez la suspension cellulaire dans le nombre approprié de cryoflacons et ajoutez 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) à chaque cryoflacon.
  6. Placez les cryoflacons sur de la glace et transférez-les rapidement dans un congélateur à débit contrôlé pour la cryoconservation. Après la cryoconservation, transférez les cryoflacons dans un réservoir d’azote liquide surveillé pour un stockage à long terme.

5. Contrôle de la qualité (Jour 14)

REMARQUE : Pour les tests de libération, le produit a subi plusieurs tests, notamment des tests de stérilité pour la croissance microbienne et une évaluation du niveau d’endotoxines. Ces tests ont été effectués dans des laboratoires certifiés de l’hôpital général universitaire de Patras et de l’université de Patras. La présence de mycoplasmes a été déterminée à l’interne à l’aide d’un test de détection biochimique et mesurée sur un luminomètre en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Le phénotype cellulaire (Figure 1) ainsi que le nombre et la viabilité des cellules ont été évalués en interne par cytométrie en flux (voir rubrique 5.1) et un compteur de cellules automatisé (voir Tableau des matériaux), respectivement. Les critères de rejet ont été établis en fonction des données publiées et des recommandations10,11 pour les produits cellulaires fabriqués selon les BPF (tableau 1).

  1. Effectuer une coloration par cytométrie en flux avec efficacité de transduction (jour 14)
    REMARQUE : Une aliquote de 1 x 106 cellules sera colorée pour la viabilité (7-AAD) et le marqueur CD32 pour évaluer l’efficacité de la transduction (voir le tableau des matériaux). Si le gène d’intérêt, comme dans le cas des cellules CAR-T, doit être détecté, l’anticorps spécifique doit être d’une couleur différente de celle du marqueur CD3 et du 7-AAD pour éviter toute compensation. Des échantillons de contrôle appropriés doivent être pris en compte.
    1. Placez l’échantillon dans un tube FACS et ajoutez 500 μL de tampon FACS.
    2. Centrifuger le tube à 400 x g à RT pendant 5 min.
    3. Jeter complètement le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre la pastille en suspension dans une solution diluée 1:5 de tampon CD3 :FACS (voir le tableau des matériaux).
    4. Vortex l’échantillon et incuber pendant 30 min sur de la glace dans le noir.
    5. Ajouter 500 μL de tampon FACS. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min (RT).
    6. Jeter complètement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans une solution diluée à 1:20 de tampon 7-AAD :FACS (voir le tableau des matériaux).
    7. Vortex l’échantillon et incuber pendant 10 min sur de la glace dans le noir.
    8. Ajouter 200 μL de tampon FACS et analyser l’échantillon à l’aide d’un cytomètre en flux (voir Tableau des matériaux).

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Résultats

Évaluation de l’efficacité de la transduction
Les cellules transduites ont été évaluées pour l’expression du gène d’intérêt (GFP) à l’aide de la cytométrie en flux. Des résultats représentatifs sont illustrés à la figure 1. Au jour 14, plus de 95 % des cellules étaient CD3+, ce qui indique une activation et une expansion réussies des lymphocytes T. L’efficacité de la transduction dans la population CD3+ a été ...

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Discussion

Les vecteurs lentiviraux en tant que vecteurs d’administration de gènes sont des outils importants dans le domaine de la thérapie cellulaire et génique en raison de leur capacité à transduire à la fois des cellules diviseuses et non divisées12. Cependant, la production à grande échelle de vecteurs lentiviraux à l’aide de méthodes compatibles avec les BPF reste difficile en raison de divers paramètres, tels que les méthodes de transfection et les étapes de purification, qui peuven...

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Déclarations de divulgation

N.S. a élaboré le protocole et rédigé le manuscrit qui a été révisé et supervisé par A.S. ; K.S., G.A. a effectué des expériences supplémentaires ; D.K., M.L. a apporté un soutien précieux dans les expériences et avec V.Z., N.T. dans le processus d’examen. N.T. est membre de ProtATonce Ltd. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Cette recherche a été cofinancée par l’Union européenne et des fonds nationaux grecs par le biais du programme opérationnel Compétitivité, entrepreneuriat et innovation, dans le cadre de l’appel RECHERCHE - CRÉER - INNOVER (code de projet : T2EDK - 00474). Nous tenons également à exprimer notre gratitude à la Fondation Choose Life pour son soutien continu au laboratoire GMP « Dimitris Lois » de l’Institut de thérapie cellulaire.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well TC-treated plateCorning353047
5 mL FACS tube Corning352054
50 mL Falcon tubesGreiner biomedica227261
6-well TC-treated plateCorning353046
7-AADBD Biosciences559925
BD FACS CANTO IIBD BiosciencesV96300084
BSAApplichemA1391
Cell Counter Corning Cell CytosmartJ21E0081
CryovialsGreiner biomedica122263
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)Life Technologies14190
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)--
FlowJo Software v10.6.2 TreeStar Inc-
Gibco CTS Opti-MEM I MediumThermoFisher ScientificA4124801
GMP rhIL-15Miltenyi Biotec170-076-114
GMP rhIL-2Miltenyi Biotec170-076-146
GMP rhIL-7Miltenyi Biotec170-076-111
Hanks’s Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175
HEPA Whitley H35 HypoxystationDon Whitley ScientificHA0315172H
Human Serum Albumin (HSA)BaxterB05AA01
Junior LB 9509 Portable LuminometerBerthold Technologies6506
Lenti-X Provirus Quantitation KitTakara Bio631239
LymphoprepStemcell Technologies7811
MACS GMP T cell TransActMiltenyi Biotec170-076-156
Mouse Anti-Human  CD3 (Clone: UCHT-1)BD Biosciences557706
MycoAlert Plus Detection kitLonza BioscienceLT07-703
Parafilm ultra-expandable closing film tape 5 cm x 75 mD.Dutscher90261
PeriStem PS-650-DB (apheresis bag)Biomed DeviceSC00816
Planer Kryo10 Series IIIPlaner
T75 flasksGreiner biomedica658175
Trypan blue, 0.4% solutionInvitrogenT10282
Vectofusin-1 GMPMiltenyi Biotec170-076-165
X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza BioscienceA1048501

Références

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