JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, İyi Üretim Uygulamaları (GMP) standartlarıyla uyumluluğu sağlayarak, ilgilenilen bir gen ile birincil insan T hücrelerinin dönüştürülmesi sürecini ana hatlarıyla belirtir.

Özet

Evlat Edinen Hücre Terapisi (ACT) alanı, genetiği değiştirilmiş hücrelerin, özellikle Kimerik Antijen Reseptörü (CAR)-T hücrelerinin geliştirilmesiyle devrim yaratmıştır. Bu modifiye hücreler, hematolojik maligniteleri olan hastalarda dikkate değer klinik yanıtlar göstermiştir. Bununla birlikte, bu tedavileri üretmenin ve kapsamlı kalite kontrol değerlendirmeleri yapmanın yüksek maliyeti, daha geniş bir hasta yelpazesine erişilebilirliklerini sınırlamıştır. Bu sorunu ele almak için, birçok akademik kurum, ulusal ve uluslararası düzenleyici kurumlar tarafından belirlenen yönergelere bağlı kalırken, genetiği değiştirilmiş hücrelerin kurum içi üretiminin fizibilitesini araştırıyor.

Genetiği değiştirilmiş T hücresi ürünlerinin büyük ölçekte üretilmesi, özellikle kurumun üretim yetenekleri ve infüzyon miktarı gereksinimlerini karşılama ihtiyacı açısından çeşitli zorluklar ortaya koymaktadır. En büyük zorluklardan biri, genellikle dış şirketlere dış kaynaklı olan İyi Üretim Uygulamaları (GMP) yönergeleri kapsamında büyük ölçekli viral vektörlerin üretilmesini içerir. Ek olarak, T hücresi transdüksiyon sürecini basitleştirmek, üretim partileri arasındaki değişkenliği en aza indirmeye, maliyetleri düşürmeye ve personel eğitimini kolaylaştırmaya yardımcı olabilir. Bu çalışmada, ilgilenilen gen olarak bir floresan işaretleyici ile birincil insan T hücrelerinin lentiviral transdüksiyonu için kolaylaştırılmış bir süreci özetledik. Tüm süreç GMP uyumlu standartlara bağlıdır ve akademik kurumumuzda uygulanmaktadır.

Giriş

Evlat Edinen Hücre Tedavileri (ACT) ve Kimerik Antijen Reseptörü (CAR)-T hücrelerinin ortaya çıkışı, modern klinik uygulamada devrim niteliğinde bir değişime yol açarak yeni bir kişiselleştirilmiş tıp paradigması oluşturmuştur. Özellikle, CD19'u hedefleyen CAR-T hücreleri olağanüstü klinik yanıtlar göstermiştir ve B hücreli maligniteler için en gelişmiş T hücre tedavisini temsil etmektedir 1,2,3,4,5. Bununla birlikte, mevcut ticarileştirilmiş gen modifiye T hücresi tedavileri, gen transferi için büyük ölçüde viral vektörlere dayanmaktadır. Viral vektörlerin ACT'de, özellikle akademik bir ortamda İyi Üretim Uygulamaları (GMP) koşulları altında uygulanması, ölçeklenebilirlik sınırlamaları, özel ekipman gereksinimleri, yüksek vasıflı personel ihtiyacı ve plazmid aracılı viral partikül üretimi için GMP uyumlu reaktiflerin kullanımı nedeniyle önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır 6,7,8.

Sonuç olarak, geni değiştirilmiş T hücresi tedavileri için üretim süreci karmaşıktır ve tipik olarak bir lökoferez ürününden Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin (PBMC'ler) izolasyonu ile başlar. T hücreleri genellikle PBMC havuzundan zenginleştirilir ve anti-CD3/CD28 mikro kompleksleri kullanılarak aktive edilir 7,9. Daha sonra, T hücreleri, yerinde üretilebilen veya dışarıdan temin edilebilen viral veya viral olmayan vektörlerle genetik olarak değiştirilir. İnfüzyon için gerekli hücre sayılarını elde etmek için, geni değiştirilmiş hücreler son formülasyon ve/veya kriyoprezervasyondan önce genişletilir. Son olarak, hücre ürünü, çoklu kalite kontrol tahlillerine dayalı olarak çeşitli salım kriterlerini karşılamalıdır9.

Bu protokol, GMP uyumlu koşullar altında geni değiştirilmiş bir T hücresi ürünü üretmek için sağlıklı PBMC'lerin ex vivo manipülasyonu için basit teknikleri kullanan kapsamlı bir metodoloji sunar. Protokol, gerekli tüm kantitatif/işlevsel, saflık ve güvenlik testlerini (örneğin, viral titre, konakçı hücre DNA replikasyonuna yetkin lentivirüsün tespiti) sağlayan bir viral üretim şirketine dış kaynak sağlanabilen bir lentiviral vektörün kullanımını içerir. Bu çalışma için kullanılan vektör, yapısal ekspresyonda ilgilenilen gen olarak Yeşil Floresan Proteini (GFP) içeren VSV-g (Veziküler Stomatit Virüsü G Proteini) bazlı ikinci nesil lentiviral vektördür.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışma Patras Üniversitesi Etik Kurulu ve Patras Üniversitesi Genel Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Biyolojik örnekler alınmadan önce, sağlıklı bireylerden bilgilendirilmiş onam alındı. Katılımcıların uygunluk değerlendirmesi, kurumsal prosedürlere göre ve lökoferez için JACIE standartlarına uygun olarak yapıldı. Bu protokol klinik bir ACT ortamında uygulanacaksa, tüm prosedürler İyi Üretim Uygulamaları (GMP) yönergelerine uygun olmalı ve GMP uyumlu temiz odalarda gerçekleştirilmelidir. Viral vektörlerle çalışırken özel güvenlik önlemleri gereklidir ve bu prosedürler özel bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilmelidir. Bu çalışmada, açıklanan prosedürler, kontrollü ve izlenen bir ortam sağlamak için doğrulanmış bir H35 HEPA Hipoksiistasyonu (bkz. Malzeme Tablosu) içinde gerçekleştirilmiştir. Tüm tehlikeli sıvıların dekontaminasyonu% 10 ağartma çözeltisi kullanılarak yapılmalıdır.

1. PBMC izolasyonu ve T hücresi aktivasyonu (Gün 0)

  1. Donör aferez torbasından (lökopaklar, Malzeme Tablosuna bakınız) hücreleri, başlangıç hacmine bağlı olarak 50 mL'lik tüplere toplayın.
  2. 15 mL tam hematopoietik ortam (+% 5 HSA, ticari serumsuz hematopoietik ortam, Malzeme Tablosuna bakınız) infüze ederek hücre torbasını iki kez yıkayın.
  3. 1:2 (reaktif:numune) seyreltmede polisakkarit bazlı yoğunluk gradyan santrifüjlemesi gerçekleştirin. 800 x g'da oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ara vererek santrifüjleyin (A/D, 9/0).
  4. Bir mikropipet kullanarak PBMC'leri 50 mL'lik temiz bir tüpte toplayın.
  5. Hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın, her yıkama için 50 mL'ye kadar doldurun (400 x g, 10 dakika, oda sıcaklığı). Hücreleri 5 mL tam ortamda yeniden süspanse edin.
  6. Standart bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın (bkz.
  7. 2 x 106 hücre / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için hücreleri tam ortamla seyreltin.
  8. 20 x 106 başlangıç hücresi başına 10 μL T hücresi stimülasyon reaktifi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek 2 x 106 PBMC'yi etkinleştirin.
    NOT: Bu protokol, 20 x 106 PBMC'lerin etkinleştirilmesi için tasarlanmıştır, ancak gerektiğinde daha büyük hücre sayıları için ayarlanabilir.
  9. rhIL-2 (20 U/mL) ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın), hafifçe karıştırın ve karışımı uygun bir kaba (örneğin, 6 oyuklu plaka) aktarın.
  10. Hücreleri 37 °C'de, %5CO2'de 72 saat inkübe edin.

2. Lentiviral T hücre transdüksiyonu (3. Gün)

  1. Hücre kültürünü 50 mL'lik konik bir tüp gibi uygun bir kaba aktarın. İyice karıştırın ve aktivasyon reaktifini çıkarmak için oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice tamamen atın ve peleti 1 mL tam ortamda yeniden süspanse edin.
    NOT: Bu aşamada virüsü buz üzerinde çözdürmek mümkündür.
  2. Tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın.
  3. 24 oyuklu bir plakada oyuk başına toplam 400 μL hacimde 0.5 x 106 hücrenin kaplanmasına izin veren bir konsantrasyon elde etmek için hücreleri tam ortamda yeniden süspanse edin. rhIL-7 (155 U/mL) ve rhIL-15 (290 U/mL) ekleyin (bkz.
    NOT: Eklenecek virüslerin hacmini hesaba kattığınızdan emin olun. Adım 2.4'e bakın.
  4. Ayrı bir tüpte, kullanılacak viral hacme eşit bir hacimde 10 μg/mL konsantrasyonda Opti-MEM ortamına Vectofusin-1 (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
    NOT: Vectofusin-1 konsantrasyonunu hesaplarken toplam hücre kültürü hacmini göz önünde bulundurun. Adım 2.3'e bakın. Alternatif olarak, Vectofusin-1 GMP, GMP dereceli bir reaktif olarak kullanılabilir.
  5. Konsantre virüsü 40 ° C'lik bir Enfeksiyon Çokluğunda (MOI) Vectofusin-1/Opti-MEM karışımı (1:1 oranı) ile birleştirin ve iyice karıştırın. Bu karışımı hücre kültürüne ekleyin ve gerekirse tam ortam kullanarak toplam hacmi kuyu başına 400 μL'ye ayarlayın.
  6. Kapağı plakaya yerleştirin, parafin film ile kapatın ve 32 °C'de 2 saat boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin. Daha sonra, plakayı gece boyunca 37 °C,% 5 CO2'de inkübe edin.

3. Virüsün çıkarılması ve T hücresi genişlemesi (4. Gün)

  1. Hücreleri toplayın ve 50 mL'lik bir tüp gibi uygun bir kaba koyun.
  2. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice tamamen çıkarın ve peleti 1 mL tam ortamda yeniden süspanse edin.
  3. Tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri tam ortamda 1 x 106 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin. rhIL-7 (155 U/mL) ve rhIL-15 (290 U/mL) ekleyin (bkz.
  4. Hücreleri, 0.3-0.5 x 106 hücre /cm2 konsantrasyonda bir T25 şişesi gibi uygun bir kaba aktarın ve 2 gün boyunca 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin.
    NOT: Daha büyük bir hücre popülasyonu gerekiyorsa, hücreler, istenen hücre sayıları elde edilene kadar, yukarıda belirtilen aynı inkübasyon koşullarını takiben, her 2 günde bir rhIL7 ve rhIL-15 varlığında alt kültüre edilebilir (1:2).

4. Kriyoprezervasyon (14. Gün)

NOT: Bu adım sırasında kriyovialleri saklama yerine aktarmak için buz gerekecektir. Kriyoprezervasyonun zamanlaması, istenen hücre sayılarına bağlıdır. Bu protokol için, 25 kat genişleme sağlandıktan sonra 14. günde kriyoprezervasyon yapılır.

  1. İstenilen hücre sayısına ulaşıldığında, hücreleri toplayın ve 50 mL'lik tüplere aktarın (toplam hacme göre tüp sayısını ayarlayın).
  2. Tüpleri 400 x g'da oda sıcaklığında (RT) 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice tamamen çıkarın ve peleti 10 mL ortamda yeniden süspanse edin. Gerekirse, hücreleri birden fazla tüpten toplayın.
  3. Tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın. Vektör Kopya Sayısını ve İletim Verimliliğini değerlendirmek için her kalite kontrol (QC) testi için 1 x 106 hücreden oluşan bir alikot tutun (Bölüm 5'e bakın).
  4. Tüpleri RT'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Bu noktada, kriyoviyalleri buna göre etiketleyin.
  5. Süpernatanı tamamen çıkarın ve peleti, kriyoviyal başına mL başına 1 x 10 7 hücre konsantrasyonunda% 50 HSA ve%40 HBSS'den oluşan bir kriyoprezervasyon solüsyonunda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu uygun sayıda kriyoviyal içine aktarın ve her kriyoviyal için %10 dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin.
  6. Kriyovialleri buzun üzerine yerleştirin ve kriyoprezervasyon için derhal kontrollü oranlı bir dondurucuya aktarın. Kriyoprezervasyondan sonra, kriyoviyalleri uzun süreli depolama için izlenen bir sıvı nitrojen tankına aktarın.

5. Kalite kontrol (Gün 14)

NOT: Serbest bırakma testi için ürün, mikrobiyal büyüme için sterilite testleri ve endotoksin seviyesi değerlendirmesi dahil olmak üzere çeşitli testlere tabi tutulmuştur. Bu testler, Patras Üniversitesi Genel Hastanesi ve Patras Üniversitesi'ndeki sertifikalı laboratuvarlarda gerçekleştirildi. Mikoplazma varlığı, bir biyokimyasal tespit testi kullanılarak kurum içinde belirlendi ve üreticinin talimatlarına göre bir luminometrede ölçüldü (bkz. Malzeme Tablosu). Hücre fenotipi (Şekil 1), hücre sayısı ve canlılığı sırasıyla akış sitometrisi (bkz. bölüm 5.1) ve otomatik hücre sayacı (bkz. Malzeme Tablosu) ile kurum içinde değerlendirildi. Serbest bırakma kriterleri, GMP ile üretilen hücre ürünleri için yayınlanmış verilere ve tavsiyelere10,11 dayalı olarak oluşturulmuştur (Tablo 1).

  1. Transdüksiyon verimliliği-akış sitometrisi boyama gerçekleştirin (Gün 14)
    NOT: 1 x 106 hücreden oluşan bir alikot, canlılık (7-AAD) ve CD3 belirteci2 için transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için boyanacaktır (bkz. CAR T hücrelerinde olduğu gibi ilgilenilen genin tespit edilmesi gerekiyorsa, kompanzasyondan kaçınmak için spesifik antikor, CD3 markörü ve 7-AAD'den farklı bir renkte olmalıdır. Uygun kontrol numuneleri dikkate alınmalıdır.
    1. Numuneyi bir FACS tüpüne yerleştirin ve 500 μL FACS tamponu ekleyin.
    2. Tüpü RT'de 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    3. Süpernatanı bir pipetle tamamen atın ve peleti 1:5 seyreltilmiş CD3:FACS tamponu çözeltisinde yeniden süspanse edin (bkz.
    4. Numuneyi vorteksleyin ve karanlıkta buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
    5. 500 μL FACS tamponu ekleyin. 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin (RT).
    6. Süpernatanı tamamen atın ve peleti 1:20 seyreltilmiş 7-AAD: FACS tamponu çözeltisinde yeniden süspanse edin (bkz.
    7. Numuneyi vorteksleyin ve karanlıkta buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.
    8. 200 μL FACS tamponu ekleyin ve numuneyi bir akış sitometresi kullanarak analiz edin (bkz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Transdüksiyon verimliliğinin değerlendirilmesi
Transdüksiyon hücreleri, akış sitometrisi kullanılarak ilgilenilen genin (GFP) ekspresyonu açısından değerlendirildi. Temsili sonuçlar Şekil 1'de gösterilmektedir. 14. günde, hücrelerin %95'inden fazlası CD3 + idi, bu da başarılı T hücresi aktivasyonu ve genişlemesini gösteriyordu. CD3+ popülasyonundaki transdüksiyon verimliliği, %0.51'lik bir transdüksiyon verimlil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Gen dağıtım araçları olarak lentiviral vektörler, hem bölünen hem de bölünmeyen hücreleri dönüştürme yetenekleri nedeniyle hücre ve gen terapisi alanında önemli araçlardır12. Bununla birlikte, GMP uyumlu yöntemler kullanılarak lentiviral vektörlerin büyük ölçekli üretimi, lentivirüs partilerinde değişkenliğe neden olabilen transfeksiyon yöntemleri ve saflaştırma adımları gibi çeşitli parametreler nedeniyle hala zordur. Akademik merkezler genellikle viral üre...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

N.S. protokolü geliştirdi ve A.S. tarafından gözden geçirilen ve denetlenen makaleyi yazdı; K.S., G.A. ek deneyler yaptı; D.K., M.L. deneylerde ve V.Z., N.T. ile birlikte inceleme sürecinde değerli destek sağladılar. NT, ProtATonce Ltd.'nin bir üyesidir. Diğer tüm yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu araştırma, Avrupa Birliği ve Yunan ulusal fonları tarafından Rekabet Edebilirlik, Girişimcilik ve İnovasyon Operasyonel Programı aracılığıyla, ARAŞTIRMA - ÜRETİM - YENİLİKÇİLİK (proje kodu: T2EDK - 00474) çağrısı kapsamında ortaklaşa finanse edilmiştir. Ayrıca, Hücre Terapisi Enstitüsü'nün GMP Laboratuvarı "Dimitris Lois"e sürekli destek sağladığı için Choose Life Vakfı'na şükranlarımızı sunarız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well TC-treated plateCorning353047
5 mL FACS tube Corning352054
50 mL Falcon tubesGreiner biomedica227261
6-well TC-treated plateCorning353046
7-AADBD Biosciences559925
BD FACS CANTO IIBD BiosciencesV96300084
BSAApplichemA1391
Cell Counter Corning Cell CytosmartJ21E0081
CryovialsGreiner biomedica122263
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)Life Technologies14190
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)--
FlowJo Software v10.6.2 TreeStar Inc-
Gibco CTS Opti-MEM I MediumThermoFisher ScientificA4124801
GMP rhIL-15Miltenyi Biotec170-076-114
GMP rhIL-2Miltenyi Biotec170-076-146
GMP rhIL-7Miltenyi Biotec170-076-111
Hanks’s Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175
HEPA Whitley H35 HypoxystationDon Whitley ScientificHA0315172H
Human Serum Albumin (HSA)BaxterB05AA01
Junior LB 9509 Portable LuminometerBerthold Technologies6506
Lenti-X Provirus Quantitation KitTakara Bio631239
LymphoprepStemcell Technologies7811
MACS GMP T cell TransActMiltenyi Biotec170-076-156
Mouse Anti-Human  CD3 (Clone: UCHT-1)BD Biosciences557706
MycoAlert Plus Detection kitLonza BioscienceLT07-703
Parafilm ultra-expandable closing film tape 5 cm x 75 mD.Dutscher90261
PeriStem PS-650-DB (apheresis bag)Biomed DeviceSC00816
Planer Kryo10 Series IIIPlaner
T75 flasksGreiner biomedica658175
Trypan blue, 0.4% solutionInvitrogenT10282
Vectofusin-1 GMPMiltenyi Biotec170-076-165
X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza BioscienceA1048501

Referanslar

  1. Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
  2. Brentjens, R., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38(2013).
  3. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  4. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  5. Schuster, S. J., et al. Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas. Blood. 126 (23), 183(2015).
  6. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  7. Wang, X., Rivière, I. Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy. Molecular Therapy - Oncolytics. 3, 16015(2016).
  8. Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting. Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).
  9. Kaiser, A. D., et al. Towards a commercial process for the manufacture of genetically modified T cells for therapy. Cancer Gene Therapy. 22 (2), 72-78 (2015).
  10. Guidelines on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells. European Medicines Agency. , EMA/CAT/GTWP/671639/2008 Rev. 1 - corr., Committee for Advanced Therapies (CAT) (2020).
  11. Castella, M., et al. Point-of-care CAR T-Cell production (ARI-0001) using a closed semi-automatic bioreactor: experience from an academic phase I clinical trial. Frontiers in Immunology. 11, 482(2020).
  12. Naldini, L. Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells. Current Opinion in Biotechnology. 9 (5), 457-463 (1998).
  13. Ausubel, L. J., et al. Production of CGMP-grade lentiviral vectors. Bioprocess International. 10 (2), 32-43 (2012).
  14. Van der Loo, J. C. M., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R42-R52 (2016).
  15. Rad, S. M. A. H., Poudel, A., Tan, G. M. Y., McLellan, A. D. Promoter choice: Who should drive the CAR in T cells. PLoS One. 15 (7), e0232915(2020).
  16. Sandrin, V., et al. Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RD114 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ cells derived from human and nonhuman primates. Blood. 100 (3), 823-832 (2002).
  17. Costello, E., et al. Gene transfer into stimulated and unstimulated T lymphocytes by HIV-1-derived lentiviral vectors. Gene Therapy. 7 (7), 596-604 (2000).
  18. Radek, C., et al. Vectofusin-1 improves transduction of primary human cells with diverse retroviral and lentiviral pseudotypes, enabling robust, automated closed-system manufacturing. Hum Gene Therapy. 30 (12), 1477-1493 (2019).
  19. Hanenberg, H., et al. Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells. Nature Medicine. 2 (8), 876-882 (1996).
  20. Lamers, C. H. J., et al. Retronectin-assisted retroviral transduction of primary human T lymphocytes under good manufacturing practice conditions: tissue culture bag critically determines cell yield. Cytotherapy. 10 (4), 406-416 (2008).
  21. O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).
  22. Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
  23. Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
  24. Ghassemi, S., et al. Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells. Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).
  25. Wang, R. -N., et al. Optimized protocols for γδ T cell expansion and lentiviral transduction. Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1471-1480 (2019).
  26. Yuan, W., et al. Comparative analysis and optimization of protocols for producing recombinant lentivirus carrying the anti-Her2 chimeric antigen receptor gene. The Journal of Gene Medicine. 20 (7-8), e3027(2018).
  27. Zhu, F., et al. Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T cells using the CliniMACS Prodigy device at an academic medical center. Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).
  28. Mock, U., et al. Automated manufacturing of chimeric antigen receptor T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy. Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GMP Uyumlu Prosed rGen Modifiye Edilmi T H creleriEvlat Edinen H cre TedavisiGeneti i De i tirilmi H crelerCAR T H creleriHematolojik MalignitelerKurum i retimKalite Kontrol De erlendirmeleriUlusal ve Uluslararas D zenleyici KurumlarB y k l ekli Viral Vekt rlerT H cresi Transd ksiyon S reciLentiviral Transd ksiyonPrimer nsan T H creleriFloresan Markerlgilenilen Gen

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır