JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את תהליך התמרת תאי T אנושיים ראשוניים עם גן מעניין, ומבטיח תאימות לתקני תנאי ייצור נאותים (GMP).

Abstract

תחום הטיפול התא המאמץ (ACT) עבר מהפכה על ידי פיתוח תאים מהונדסים גנטית, במיוחד תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T. תאים מהונדסים אלה הראו תגובות קליניות יוצאות דופן בחולים עם ממאירויות המטולוגיות. עם זאת, העלות הגבוהה של ייצור טיפולים אלה וביצוע הערכות בקרת איכות נרחבות הגבילה את נגישותם למגוון רחב יותר של מטופלים. כדי להתמודד עם בעיה זו, מוסדות אקדמיים רבים בוחנים את ההיתכנות של ייצור פנימי של תאים מהונדסים גנטית, תוך שמירה על הנחיות שנקבעו על ידי סוכנויות רגולטוריות לאומיות ובינלאומיות.

ייצור מוצרי תאי T מהונדסים גנטית בקנה מידה גדול מציב מספר אתגרים, בעיקר מבחינת יכולות הייצור של המוסד והצורך לעמוד בדרישות כמות העירוי. אתגר מרכזי אחד כרוך בייצור וקטורים נגיפיים בקנה מידה גדול תחת הנחיות תנאי ייצור נאותים (GMP), אשר לעתים קרובות מועברים במיקור חוץ לחברות חיצוניות. בנוסף, פישוט תהליך ההתמרה של תאי T יכול לסייע במזעור השונות בין אצוות ייצור, להפחית עלויות ולהקל על הכשרת כוח אדם. במחקר זה, אנו מתארים תהליך יעיל להתמרה לנטיויראלית של תאי T אנושיים ראשוניים עם סמן פלואורסצנטי כגן המעניין. התהליך כולו עומד בתקנים תואמי GMP ומיושם בתוך המוסד האקדמי שלנו.

Introduction

הופעתם של טיפולים תאיים מאמצים (ACT) ותאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T הביאו לשינוי מהפכני בפרקטיקה הקלינית המודרנית, וביססו פרדיגמה חדשה של רפואה מותאמת אישית. בפרט, תאי CAR-T המכוונים ל- CD19 הוכיחו תגובות קליניות יוצאות דופן ומייצגים את הטיפול המתקדם ביותר בתאי T לממאירויותתאי B 1,2,3,4,5. עם זאת, הטיפולים הנוכחיים בתאי T מהונדסים גנטית מסתמכים במידה רבה על וקטורים נגיפיים להעברת גנים. היישום של וקטורים נגיפיים ב- ACT, במיוחד בתנאי תנאי ייצור נאותים (GMP) במסגרת אקדמית, מציב אתגרים משמעותיים עקב מגבלות מדרגיות, דרישות ציוד מיוחדות, הצורך בכוח אדם מיומן והשימוש בריאגנטים תואמי GMP לייצור חלקיקים נגיפיים בתיווך פלסמיד 6,7,8.

כתוצאה מכך, תהליך הייצור עבור טיפולים בתאי T מהונדסים גנטית הוא מורכב ומתחיל בדרך כלל עם בידוד של תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם (PBMCs) ממוצר leukapheresis. תאי T מועשרים לעתים קרובות ממאגר PBMC ומופעלים באמצעות מיקרו-קומפלקסים 7,9 נגד CD3/CD28. לאחר מכן, תאי T מהונדסים גנטית עם וקטורים נגיפיים או לא ויראליים, אשר ניתן לייצר באתרם או במיקור חוץ. כדי להשיג את מספרי התאים הדרושים לעירוי, תאים מהונדסים גנטית מורחבים לפני ניסוח סופי ו / או שימור בהקפאה. לבסוף, מוצר התא חייב לעמוד בקריטריוני שחרור שונים המבוססים על מבחני בקרת איכות מרובים9.

פרוטוקול זה מציג מתודולוגיה מקיפה המשתמשת בטכניקות פשוטות למניפולציה ex vivo של PBMCs בריאים לייצור מוצר תאי T מהונדסים גנטית בתנאים תואמי GMP. הפרוטוקול משלב שימוש בווקטור לנטי-ויראלי, אשר ניתן למיקור חוץ לחברת ייצור נגיפים המספקת את כל הבדיקות הכמותיות/פונקציונליות, הטוהר והבטיחות הדרושות (למשל, טיטר נגיפי, זיהוי של לנטיוירוס בעל יכולת שכפול DNA של התא המארח). עבור מחקר זה, הווקטור המשמש הוא VSV-g (Vesicular Stomatitis Virus G Protein) מבוסס וקטור לנטיויראלי מהדור השני עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כגן המעניין, בביטוי מכונן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת פטרס ומועצת הביקורת המוסדית של בית החולים הכללי האוניברסיטאי של פטרס. לפני קבלת דגימות ביולוגיות, התקבלה הסכמה מדעת מאנשים בריאים. הערכת הזכאות של המשתתפים נערכה על פי נהלים מוסדיים ובהתאם לתקני JACIE ללוקפרזיס. אם יש ליישם פרוטוקול זה במסגרת ACT קליני, כל ההליכים חייבים לעמוד בהנחיות תנאי ייצור נאותים (GMP) ולהתבצע בחדרים נקיים תואמי GMP. אמצעי בטיחות מיוחדים נחוצים בעת עבודה עם וקטורים נגיפיים, ונהלים אלה צריכים להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית ייעודי. במחקר זה, ההליכים המתוארים נערכו במסגרת היפוקסיסטיישן H35 HEPA מאומת (ראה טבלת חומרים) כדי להבטיח סביבה מבוקרת ומנוטרת. טיהור כל הנוזלים המסוכנים צריך להתבצע באמצעות תמיסת אקונומיקה 10%.

1. בידוד PBMC והפעלת תאי T (יום 0)

  1. אספו תאים משקית האפרזיס של התורם (leukopaks, ראו טבלת חומרים) לתוך צינורות של 50 מ"ל, בהתאם לנפח הראשוני.
  2. בצע שתי שטיפות של שקית התא על ידי עירוי 15 מ"ל של מדיה hematopoietic מלאה (+5% HSA, מדיה hematopoietic מסחרי ללא סרום, ראה טבלה של חומרים).
  3. בצע צנטריפוגת שיפוע צפיפות מבוססת פוליסכריד בדילול של 1:2 (מגיב:מדגם). צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הפסקות (A/D, 9/0).
  4. באמצעות מיקרופיפטה, לאסוף PBMCs לתוך צינור נקי 50 מ"ל.
  5. שטפו את התאים פעמיים עם 1x PBS, מילוי עד 50 מ"ל עבור כל כביסה (400 x גרם, 10 דקות, טמפרטורת החדר). להשעות מחדש את התאים ב 5 מ"ל של מדיה מלאה.
  6. ספור את התאים באמצעות כחול טריפאן באמצעות המוציטומטר רגיל או מונה תאים אוטומטי (ראה טבלת חומרים).
  7. לדלל את התאים עם מדיה מלאה כדי להשיג ריכוז של 2 x 106 תאים / מ"ל.
  8. הפעל 20 x 106 PBMCs על ידי הוספת 10 μL של מגיב גירוי תאי T (ראה טבלת חומרים) לכל 2 x 106 תאים התחלתיים.
    הערה: פרוטוקול זה מיועד להפעלה של 20 x 106 PBMCs אך ניתן לכוונן אותו למספרי תאים גדולים יותר לפי הצורך.
  9. מוסיפים rhIL-2 (20 U/mL) (ראו טבלת חומרים), מערבבים בעדינות ומעבירים את התערובת לכלי מתאים (למשל, צלחת עם 6 בארות).
  10. לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 72 שעות.

2. התמרה של תאי T Lentiviral (יום 3)

  1. מעבירים את תרבית התאים לכלי מתאים, כגון צינור חרוטי בנפח 50 מ"ל. ערבב היטב וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי להסיר את מגיב ההפעלה. בזהירות להשליך את supernatant לחלוטין להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום שלם.
    הערה: בשלב זה ניתן להפשיר את הנגיף על קרח.
  2. ספור את התאים באמצעות כחול טריפאן.
  3. להשהות מחדש את התאים בתווך מלא כדי להשיג ריכוז המאפשר ציפוי 0.5 x 106 תאים בנפח כולל של 400 μL לכל באר בצלחת 24 באר. הוסף rhIL-7 (155 U/mL) ו- rhIL-15 (290 U/mL) (ראה טבלת חומרים).
    הערה: הקפד לקחת בחשבון את נפח הווירוסים שיש להוסיף. עיין בשלב 2.4.
  4. בצינור נפרד, הוסף Vectofusin-1 (ראה טבלת חומרים) למדיום Opti-MEM בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל, עם נפח שווה לנפח הנגיפי שיש להשתמש בו.
    הערה: שקול את נפח תרבית התאים הכולל בעת חישוב הריכוז של Vectofusin-1. ראה שלב 2.3. לחלופין, Vectofusin-1 GMP יכול לשמש כמגיב בדרגת GMP.
  5. ערבבו את הנגיף המרוכז ב-MOI (Multiplicity of Infection) של 40 עם תערובת Vectofusin-1/Opti-MEM (יחס של 1:1) וערבבו היטב. מוסיפים תערובת זו לתרבית התאים ומתאימים את הנפח הכולל ל 400 μL לכל באר באמצעות מדיום מלא, במידת הצורך.
  6. מניחים את המכסה על הצלחת, אוטמים אותה עם סרט פרפין וצנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 2 שעות ב 32 ° C. לאחר מכן, לדגור את הצלחת ב 37 ° C, 5% CO2 לילה.

3. הסרת וירוסים והרחבת תאי T (יום 4)

  1. לאסוף את התאים ולאגד אותם לתוך כלי מתאים, כגון צינור 50 מ"ל.
  2. צנטריפוגה את התאים ב 400 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות. בזהירות להסיר את supernatant לחלוטין להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיה מלאה.
  3. ספור את התאים באמצעות כחול טריפאן. להשהות מחדש את התאים במדיה מלאה בריכוז של 1 x 106 תאים / מ"ל. הוסף rhIL-7 (155 U/mL) ו- rhIL-15 (290 U/mL) (ראה טבלת חומרים).
  4. מעבירים את התאים לכלי מתאים, כגון צלוחיות T25, בריכוז של 0.3-0.5 x 106 תאים לסמ"ק2 ודגרים עליהם ב 37 ° C, 5% CO2, במשך יומיים.
    הערה: אם נדרשת אוכלוסיית תאים גדולה יותר, ניתן לתרבית תאים (1:2) בנוכחות rhIL7 ו-rhIL-15 כל יומיים, בהתאם לאותם תנאי דגירה שהוזכרו לעיל, עד להשגת מספרי התאים הרצויים.

4. שימור בהקפאה (יום 14)

הערה: קרח יידרש להעביר קריובלים למקום האחסון במהלך שלב זה. העיתוי של שימור בהקפאה תלוי במספרי התאים הרצויים. עבור פרוטוקול זה, שימור בהקפאה מתבצע ביום ה -14 לאחר השגת הרחבה פי 25.

  1. לאחר שמגיעים למספר התא הרצוי, קצרו את התאים והעבירו אותם לצינורות של 50 מ"ל (התאימו את מספר הצינורות בהתבסס על הנפח הכולל).
  2. צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות. בזהירות להסיר את supernatant לחלוטין להשעות את הגלולה ב 10 מ"ל של מדיה. במידת הצורך, אחסן את התאים מצינורות מרובים.
  3. ספור את התאים באמצעות כחול טריפאן. שמור aliquot של 1 x 106 תאים עבור כל בדיקת בקרת איכות (QC) (עיין בסעיף 5) כדי להעריך מספר העתקה וקטורית ויעילות התמירה.
  4. צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב RT. בשלב זה, תייגו את הקריובלים בהתאם.
  5. הסר לחלוטין את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה בתמיסת שימור קריוגנית המורכבת מ- 50% HSA ו- 40% HBSS בריכוז של 1 x 107 תאים למ"ל לכל קריוביאלי. העבר את תרחיף התא למספר המתאים של קריוביאליים והוסף 10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לכל קריוביאלי.
  6. הניחו את הקריובלים על קרח והעבירו אותם מיד למקפיא בקצב מבוקר לשימור בהקפאה. לאחר ההקפאה, העבירו את הקריביאלים למיכל חנקן נוזלי מנוטר לאחסון לטווח ארוך.

5. בקרת איכות (יום 14)

הערה: לצורך בדיקות שחרור, המוצר עבר מספר בדיקות, כולל בדיקות סטריליות לגדילה מיקרוביאלית, והערכת רמת אנדוטוקסין. בדיקות אלה נערכו במעבדות מוסמכות בבית החולים הכללי האוניברסיטאי של פטרס ובאוניברסיטת פטרס. נוכחות מיקופלסמה נקבעה בתוך החברה באמצעות בדיקת זיהוי ביוכימי ונמדדה על לומנומטר בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). פנוטיפ התא (איור 1), כמו גם מספר התא והכדאיות שלו הוערכו בתוך החברה על-ידי ציטומטריית זרימה (ראו סעיף 5.1) ומונה תאים אוטומטי (ראו טבלת חומרים), בהתאמה. קריטריוני שחרור נקבעו בהתבסס על נתונים שפורסמו והמלצות 10,11 עבור מוצרי תאים המיוצרים בתקן GMP (טבלה 1).

  1. ביצוע צביעת ציטומטריה של יעילות התמרה - זרימה (יום 14)
    הערה: aliquot של 1 x 106 תאים יוכתם עבור כדאיות (7-AAD) וסמן CD32 כדי להעריך את יעילות ההמרה (ראה טבלת חומרים). אם הגן המעניין, כמו במקרה של תאי CAR T, צריך להיות מזוהה, הנוגדן הספציפי צריך להיות בצבע שונה מזה של סמן CD3 ו 7-AAD כדי למנוע פיצוי. יש לקחת בחשבון דגימות בקרה מתאימות.
    1. מקם את הדגימה בשפופרת FACS והוסף 500 μL של מאגר FACS.
    2. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם ב RT במשך 5 דקות.
    3. יש להשליך לחלוטין את הסופרנאטנט עם פיפטה ולהשהות מחדש את הגלולה בתמיסה מדוללת ביחס 1:5 של חיץ CD3:FACS (ראה טבלת חומרים).
    4. מערבבים את הדגימה ודגרים במשך 30 דקות על קרח בחושך.
    5. הוסף 500 μL של מאגר FACS. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות (RT).
    6. השליכו לחלוטין את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה בתמיסה מדוללת ביחס 1:20 של חיץ 7-AAD:FACS (ראו טבלת חומרים).
    7. מערבבים את הדגימה ודגרים במשך 10 דקות על קרח בחושך.
    8. הוסף 200 μL של מאגר FACS ונתח את הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה (ראה טבלת חומרים).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הערכת יעילות התמרה
התאים המומרים הוערכו לביטוי גן העניין (GFP) באמצעות ציטומטריית זרימה. תוצאות מייצגות מתוארות באיור 1. ביום ה-14, יותר מ-95% מהתאים היו CD3+, מה שמצביע על הפעלה מוצלחת של תאי T והתרחבותם. יעילות ההולכה באוכלוסיית +CD3 נמדדה ב-58.7% (TD,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

וקטורים לנטי-ויראליים ככלי להעברת גנים הם כלים חשובים בתחום התרפיה התאית והגנטית בשל יכולתם להתמיר תאים מתחלקים ובלתי מתחלקים12. עם זאת, ייצור בקנה מידה גדול של וקטורים לנטי-ויראליים בשיטות תואמות GMP עדיין מאתגר בשל פרמטרים שונים, כגון שיטות טרנספקציה ושלבי טיהור, אשר יכולים ל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

נ.ש. פיתח את הפרוטוקול וכתב את כתב היד שנבדק ופוקח על ידי א.ש.; ק"ש, ג.א. ביצעו ניסויים נוספים; D.K., M.L. סיפקו תמיכה רבת ערך בניסויים ויחד עם V.Z., N.T. בתהליך הסקירה. נ.ט. חברה בחברת פרוטאונס בע"מ. כל שאר המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה מומן במשותף על ידי האיחוד האירופי וקרנות לאומיות יווניות באמצעות התוכנית האופרטיבית תחרותיות, יזמות וחדשנות, תחת הקריאה RESEARCH - CREATE - INNOVATE (קוד פרויקט: T2EDK - 00474). ברצוננו גם להביע את תודתנו לקרן Choose Life על מתן תמיכה מתמשכת למעבדת GMP "דימיטריס לויס" של המכון לתרפיה תאית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well TC-treated plateCorning353047
5 mL FACS tube Corning352054
50 mL Falcon tubesGreiner biomedica227261
6-well TC-treated plateCorning353046
7-AADBD Biosciences559925
BD FACS CANTO IIBD BiosciencesV96300084
BSAApplichemA1391
Cell Counter Corning Cell CytosmartJ21E0081
CryovialsGreiner biomedica122263
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)Life Technologies14190
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)--
FlowJo Software v10.6.2 TreeStar Inc-
Gibco CTS Opti-MEM I MediumThermoFisher ScientificA4124801
GMP rhIL-15Miltenyi Biotec170-076-114
GMP rhIL-2Miltenyi Biotec170-076-146
GMP rhIL-7Miltenyi Biotec170-076-111
Hanks’s Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175
HEPA Whitley H35 HypoxystationDon Whitley ScientificHA0315172H
Human Serum Albumin (HSA)BaxterB05AA01
Junior LB 9509 Portable LuminometerBerthold Technologies6506
Lenti-X Provirus Quantitation KitTakara Bio631239
LymphoprepStemcell Technologies7811
MACS GMP T cell TransActMiltenyi Biotec170-076-156
Mouse Anti-Human  CD3 (Clone: UCHT-1)BD Biosciences557706
MycoAlert Plus Detection kitLonza BioscienceLT07-703
Parafilm ultra-expandable closing film tape 5 cm x 75 mD.Dutscher90261
PeriStem PS-650-DB (apheresis bag)Biomed DeviceSC00816
Planer Kryo10 Series IIIPlaner
T75 flasksGreiner biomedica658175
Trypan blue, 0.4% solutionInvitrogenT10282
Vectofusin-1 GMPMiltenyi Biotec170-076-165
X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza BioscienceA1048501

References

  1. Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
  2. Brentjens, R., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra38(2013).
  3. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  4. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  5. Schuster, S. J., et al. Sustained remissions following chimeric antigen receptor modified T cells directed against CD19 (CTL019) in patients with relapsed or refractory CD19+ lymphomas. Blood. 126 (23), 183(2015).
  6. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  7. Wang, X., Rivière, I. Clinical manufacturing of CAR T cells: foundation of a promising therapy. Molecular Therapy - Oncolytics. 3, 16015(2016).
  8. Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting. Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).
  9. Kaiser, A. D., et al. Towards a commercial process for the manufacture of genetically modified T cells for therapy. Cancer Gene Therapy. 22 (2), 72-78 (2015).
  10. Guidelines on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells. European Medicines Agency. , EMA/CAT/GTWP/671639/2008 Rev. 1 - corr., Committee for Advanced Therapies (CAT) (2020).
  11. Castella, M., et al. Point-of-care CAR T-Cell production (ARI-0001) using a closed semi-automatic bioreactor: experience from an academic phase I clinical trial. Frontiers in Immunology. 11, 482(2020).
  12. Naldini, L. Lentiviruses as gene transfer agents for delivery to non-dividing cells. Current Opinion in Biotechnology. 9 (5), 457-463 (1998).
  13. Ausubel, L. J., et al. Production of CGMP-grade lentiviral vectors. Bioprocess International. 10 (2), 32-43 (2012).
  14. Van der Loo, J. C. M., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R42-R52 (2016).
  15. Rad, S. M. A. H., Poudel, A., Tan, G. M. Y., McLellan, A. D. Promoter choice: Who should drive the CAR in T cells. PLoS One. 15 (7), e0232915(2020).
  16. Sandrin, V., et al. Lentiviral vectors pseudotyped with a modified RD114 envelope glycoprotein show increased stability in sera and augmented transduction of primary lymphocytes and CD34+ cells derived from human and nonhuman primates. Blood. 100 (3), 823-832 (2002).
  17. Costello, E., et al. Gene transfer into stimulated and unstimulated T lymphocytes by HIV-1-derived lentiviral vectors. Gene Therapy. 7 (7), 596-604 (2000).
  18. Radek, C., et al. Vectofusin-1 improves transduction of primary human cells with diverse retroviral and lentiviral pseudotypes, enabling robust, automated closed-system manufacturing. Hum Gene Therapy. 30 (12), 1477-1493 (2019).
  19. Hanenberg, H., et al. Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells. Nature Medicine. 2 (8), 876-882 (1996).
  20. Lamers, C. H. J., et al. Retronectin-assisted retroviral transduction of primary human T lymphocytes under good manufacturing practice conditions: tissue culture bag critically determines cell yield. Cytotherapy. 10 (4), 406-416 (2008).
  21. O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).
  22. Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
  23. Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
  24. Ghassemi, S., et al. Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells. Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).
  25. Wang, R. -N., et al. Optimized protocols for γδ T cell expansion and lentiviral transduction. Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1471-1480 (2019).
  26. Yuan, W., et al. Comparative analysis and optimization of protocols for producing recombinant lentivirus carrying the anti-Her2 chimeric antigen receptor gene. The Journal of Gene Medicine. 20 (7-8), e3027(2018).
  27. Zhu, F., et al. Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T cells using the CliniMACS Prodigy device at an academic medical center. Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).
  28. Mock, U., et al. Automated manufacturing of chimeric antigen receptor T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy. Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

GMPTCAR TTT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved