符合GMP的基因修饰T细胞生成程序

摘要

该协议概述了用目标基因转导原代人T细胞的过程，确保与良好生产规范（GMP）标准兼容。

摘要

转基因细胞，特别是嵌合抗原受体 （CAR）-T 细胞的发展彻底改变了过继细胞疗法 （ACT） 领域。这些修饰的细胞在血液系统恶性肿瘤患者中显示出显着的临床反应。然而，生产这些疗法和进行广泛的质量控制评估的高成本限制了它们对更广泛患者的可及性。为了解决这个问题，许多学术机构正在探索内部生产转基因细胞的可行性，同时遵守国家和国际监管机构制定的指导方针。

大规模生产转基因T细胞产品面临一些挑战，特别是在机构的生产能力和满足输液量要求方面。一个主要挑战是根据良好生产规范（GMP）指南生产大规模病毒载体，这通常外包给外部公司。此外，简化 T 细胞转导过程有助于最大限度地减少生产批次之间的差异、降低成本并促进人员培训。在这项研究中，我们概述了以荧光标记物作为目的基因的原代人类 T 细胞慢病毒转导的简化过程。整个过程遵循符合GMP的标准，并在我们的学术机构内实施。

引言

过继细胞疗法（ACT）和嵌合抗原受体（CAR）-T细胞的出现，为现代临床实践带来了革命性的转变，建立了个性化医疗的新范式。特别是，靶向 CD19 的 CAR-T 细胞已显示出卓越的临床反应，代表了 B 细胞恶性肿瘤最先进的 T 细胞疗法 1,2,3,4,5。然而，目前商业化的基因修饰T细胞疗法严重依赖病毒载体进行基因转移。由于可扩展性限制、专业设备要求、对高技能人员的需求以及使用符合 GMP 标准的试剂进行质粒介导的病毒^{颗粒生产，}在 ACT 中实施病毒载体，尤其是在学术环境中的良好生产规范 （GMP） 条件下，存在重大挑战^6,7,8。

因此，基因修饰 T 细胞疗法的制造过程错综复杂，通常从从白细胞分离产品中分离外周血单核细胞 （PBMC） 开始。T 细胞通常从 PBMC 池中富集，并使用抗 CD3/CD28 微复合物激活 ^7,9。随后，用病毒或非病毒载体对T细胞进行基因改造，这些载体可以原位生产或外包生产。为了获得输注所需的细胞数量，在最终配制和/或冷冻保存之前扩增基因修饰细胞。最后，细胞产物必须满足基于多种质量控制测定的各种放行标准⁹。

该协议提出了一种综合方法，利用简单的技术对健康的PBMC进行 体外 操作，以在符合GMP的条件下生产基因修饰的T细胞产品。该协议包括使用慢病毒载体，该载体可以外包给病毒生产公司，提供所有必要的定量/功能、纯度和安全性测试（例如，病毒滴度、宿主细胞 DNA 复制能力慢病毒的检测）。在这项研究中，采用的载体是基于 VSV-g（水泡性口炎病毒 G 蛋白）的第二代慢病毒载体，以绿色荧光蛋白 （GFP） 作为目标基因，组成型表达。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

这项研究得到了帕特雷大学伦理委员会和帕特雷大学总医院机构审查委员会的批准。在获得生物标本之前，应获得健康个体的知情同意。参与者的资格评估是根据机构程序并符合 JACIE 白细胞分离术标准进行的。如果要在临床 ACT 环境中实施该协议，则所有程序都必须遵守良好生产规范 （GMP） 指南，并在符合 GMP 标准的洁净室中执行。在处理病毒载体时，必须采取特殊的安全预防措施，这些程序应在专用的生物安全柜内进行。在这项研究中，所描述的程序是在经过验证的H35 HEPA催眠站（见 材料表）内进行的，以确保受控和监测的环境。所有危险液体的去污应使用10%漂白剂溶液进行。

1. PBMC 分离和 T 细胞活化（第 0 天）

1. 根据初始体积，将供体单采袋（白细胞，见 材料表）中的细胞收集到 50 mL 管中。
2. 通过输注 15 mL 完全造血培养基（+5% HSA，商业无血清造血培养基，参见 材料表）对细胞袋进行两次洗涤。
3. 以1:2（试剂:样品）稀释度进行基于多糖的密度梯度离心。在室温下以800× g 离心30分钟，并中断（A / D，9 / 0）。
4. 使用微量移液器将PBMC收集到干净的50mL管中。
5. 用 1x PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤最多填充 50 mL（400 x g，10 分钟，室温）。将细胞重悬于 5 mL 完全培养基中。
6. 使用标准血细胞计数器或自动细胞计数器使用台盼蓝对细胞进行计数（参见 材料表）。
7. 用完全培养基稀释细胞，以达到 2 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度。
8. 通过每 2 x 10 6 个起始细胞加入 10 μL T 细胞刺激试剂（参见材料表）来激活 20 x^{10 6} 个 PBMC。
   注意:该协议设计用于激活 20 x 10⁶ PBMC，但可以根据需要调整为更大的细胞数量。
9. 加入rhIL-2（20U / mL）（参见 材料表），轻轻混合，并将混合物转移到适当的容器（例如，6孔板）中。
10. 将细胞在37°C，5%CO₂ 下孵育72小时。

2. 慢病毒T细胞转导（第3天）

1. 将细胞培养物转移到合适的容器中，例如 50 mL 锥形管。充分混合并在室温（RT）下以300× g 离心10分钟以除去活化试剂。小心地完全弃去上清液，并将沉淀重悬于1mL完全培养基中。
   注意:在这个阶段，可以在冰上解冻病毒。
2. 使用台盼蓝对细胞进行计数。
3. 将细胞重悬于完全培养基中，以达到允许在 24 孔板中每孔总体积为 400 μL 的 0.5 x^{10 6} 个细胞的浓度。加入rhIL-7（155 U/mL）和rhIL-15（290 U/mL）（参见 材料表）。
   注意:确保考虑要添加的病毒量。请参阅步骤 2.4。
4. 在单独的试管中，将Vectofusin-1（参见 材料表）以10μg/ mL的浓度加入Opti-MEM培养基中，体积等于要使用的病毒体积。
   注意:在计算Vectofusin-1的浓度时，请考虑总细胞培养体积。请参阅步骤 2.3。或者，Vectofusin-1 GMP 可用作 GMP 级试剂。
5. 将感染多重性 （MOI） 为 40 的浓缩病毒与 Vectofusin-1/Opti-MEM 混合物（1:1 比例）混合并充分混合。将该混合物加入细胞培养物中，必要时使用完全培养基将总体积调节至每孔 400 μL。
6. 将盖子放在板上，用石蜡膜密封，并在32°C下以1000× g 离心2小时。 随后，将板在37°C，5%CO₂ 下孵育过夜。

3. 病毒去除和 T 细胞扩增（第 4 天）

1. 收集细胞并将它们集中到合适的容器中，例如 50 mL 试管。
2. 在室温（RT）下以400× g 离心细胞5分钟。小心地完全除去上清液，并将沉淀重悬于1mL完全培养基中。
3. 使用台盼蓝对细胞进行计数。将细胞重悬于浓度为 1 x 10⁶ 个细胞/mL 的完全培养基中。加入rhIL-7（155 U/mL）和rhIL-15（290 U/mL）（参见 材料表）。
4. 将细胞转移到适当的容器中，例如T25烧瓶，浓度为0.3-0.5×10⁶ 个细胞/ cm² ，并在37°C，5%CO₂下孵育2天。
   注意:如果需要更大的细胞群，可以在 rhIL7 和 rhIL-15 存在下每 2 天按照上述相同的孵育条件对细胞进行传代培养 （1:2），直到达到所需的细胞数量。

4. 冷冻保存（第 14 天）

注意:在此步骤中，需要冰块才能将冷冻管转移到存储位置。冷冻保存的时间取决于所需的细胞数量。对于该协议，在实现 25 倍扩增后在第 14 天进行冷冻保存。

1. 达到所需的细胞数量后，收获细胞并将其转移到 50 mL 试管中（根据总体积调整试管数量）。
2. 在室温（RT）下以400× g 离心管5分钟。小心地完全除去上清液，并将沉淀重悬于10mL培养基中。如有必要，将来自多个试管的细胞集中起来。
3. 使用台盼蓝对细胞进行计数。每次质量控制 （QC） 测试（参见第 5 节）保留 1 x 10⁶ 个细胞的等分试样，以评估载体拷贝数和转导效率。
4. 在室温下以400× g 离心管10分钟。此时，相应地标记冷冻管。
5. 完全除去上清液，并将沉淀重悬于由50%HSA和40%HBSS组成的冻存溶液中，浓度为1×10 7^个细胞/ mL/冷冻管。将细胞悬液转移到适当数量的冷冻管中，并向每个冷冻管中加入10%二甲基亚砜（DMSO）。
6. 将冻存管放在冰上，并立即将它们转移到控制速率的冰箱中进行冷冻保存。冷冻保存后，将冷冻管转移到受监测的液氮罐中进行长期储存。

5. 质量控制（第14天）

注意:对于释放测试，该产品经过了多项测试，包括微生物生长的无菌测试和内毒素水平评估。这些测试是在帕特雷大学总医院和帕特雷大学的认证实验室进行的。支原体的存在是在内部使用生化检测法确定的，并按照制造商的说明在光度计上测量（见材料表）。细胞表型（图1）以及细胞数量和活力分别通过流式细胞术（见第5.1节）和自动细胞计数仪（见材料表）在内部进行评估。根据已公布的数据和建议^10,11为GMP生产的细胞产品制定了放行标准（表1）。

1. 进行转导效率-流式细胞术染色（第 14 天）
   注意:将对 1 x 10⁶ 个细胞的等分试样进行活力 （7-AAD） 和 CD3 标记物² 染色以评估转导效率（参见 材料表）。如果需要检测目的基因，例如CAR T细胞，则特异性抗体应与CD3标记物和7-AAD的颜色不同，以避免代偿。应考虑适当的对照样品。
   1. 将样品放入 FACS 管中并加入 500 μL FACS 缓冲液。
   2. 在室温下以400× g 离心管5分钟。
   3. 用移液管完全弃去上清液，并将沉淀重悬于CD3:FACS缓冲液的1:5稀释溶液中（参见 材料表）。
   4. 涡旋样品并在黑暗中在冰上孵育30分钟。
   5. 加入 500 μL FACS 缓冲液。以400× g 离心5分钟（RT）。
   6. 完全弃去上清液，并将沉淀重悬于1:20稀释的7-AAD:FACS缓冲液中（参见 材料表）。
   7. 涡旋样品并在黑暗中在冰上孵育10分钟。
   8. 加入200μL FACS缓冲液，使用流式细胞仪分析样品（参见 材料表）。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

转导效率评估
使用流式细胞术评估转导细胞的目的基因 （GFP） 的表达。代表性结果如 图 1 所示。在第 14 天，超过 95% 的细胞是 CD3+，表明 T 细胞活化和扩增成功。CD3+群体中的转导效率为58.7%（TD， 图1C），而非转导细胞（UNTD， 图1B）的转导效率为0.51%。活力分析显示，在排除7-AAD +细胞后?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

慢病毒载体作为基因递送载体是细胞和基因治疗领域的重要工具，因为它们能够转导分裂和非分裂细胞¹²。然而，由于转染方法和纯化步骤等各种参数，使用GMP兼容方法大规模生产慢病毒载体仍然具有挑战性，这可能导致慢病毒批次的变异性。学术中心通常从病毒生产生物技术公司获得病毒库存，这些公司提供有关病毒功能和安全性的文件，以满足释放标准^13,14...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well TC-treated plate	Corning	353047
5 mL FACS tube	Corning	352054
50 mL Falcon tubes	Greiner biomedica	227261
6-well TC-treated plate	Corning	353046
7-AAD	BD Biosciences	559925
BD FACS CANTO II	BD Biosciences	V96300084
BSA	Applichem	A1391
Cell Counter	Corning Cell Cytosmart	J21E0081
Cryovials	Greiner biomedica	122263
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Life Technologies	14190
EDTA	Invitrogen	15575-038
FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)	-	-
FlowJo Software v10.6.2	TreeStar Inc	-
Gibco CTS Opti-MEM I Medium	ThermoFisher Scientific	A4124801
GMP rhIL-15	Miltenyi Biotec	170-076-114
GMP rhIL-2	Miltenyi Biotec	170-076-146
GMP rhIL-7	Miltenyi Biotec	170-076-111
Hanks’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Life Technologies	14175
HEPA Whitley H35 Hypoxystation	Don Whitley Scientific	HA0315172H
Human Serum Albumin (HSA)	Baxter	B05AA01
Junior LB 9509 Portable Luminometer	Berthold Technologies	6506
Lenti-X Provirus Quantitation Kit	Takara Bio	631239
Lymphoprep	Stemcell Technologies	7811
MACS GMP T cell TransAct	Miltenyi Biotec	170-076-156
Mouse Anti-Human  CD3 (Clone: UCHT-1)	BD Biosciences	557706
MycoAlert Plus Detection kit	Lonza Bioscience	LT07-703
Parafilm ultra-expandable closing film tape 5 cm x 75 m	D.Dutscher	90261
PeriStem PS-650-DB (apheresis bag)	Biomed Device	SC00816
Planer Kryo10 Series III	Planer
T75 flasks	Greiner biomedica	658175
Trypan blue, 0.4% solution	Invitrogen	T10282
Vectofusin-1 GMP	Miltenyi Biotec	170-076-165
X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium	Lonza Bioscience	A1048501