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Resumo

Este protocolo descreve o processo de transdução de células T humanas primárias com um gene de interesse, garantindo a compatibilidade com as normas de Boas Práticas de Fabricação (BPF).

Resumo

O campo da Terapia Celular Adotiva (TCA) foi revolucionado pelo desenvolvimento de células geneticamente modificadas, especificamente células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR). Essas células modificadas têm mostrado respostas clínicas notáveis em pacientes com neoplasias hematológicas. No entanto, o alto custo de produção dessas terapias e a realização de extensas avaliações de controle de qualidade limitaram seu acesso a uma gama mais ampla de pacientes. Para abordar essa questão, muitas instituições acadêmicas estão explorando a viabilidade da fabricação interna de células geneticamente modificadas, ao mesmo tempo em que seguem diretrizes estabelecidas por agências reguladoras nacionais e internacionais.

A fabricação de produtos de células T geneticamente modificadas em larga escala apresenta vários desafios, particularmente em termos da capacidade de produção da instituição e da necessidade de atender às necessidades de quantidade de infusão. Um grande desafio envolve a produção de vetores virais em larga escala sob as diretrizes de Boas Práticas de Fabricação (BPF), que muitas vezes são terceirizados para empresas externas. Além disso, a simplificação do processo de transdução de células T pode ajudar a minimizar a variabilidade entre os lotes de produção, reduzir custos e facilitar o treinamento de pessoal. Neste estudo, descrevemos um processo simplificado para transdução lentiviral de células T humanas primárias com um marcador fluorescente como gene de interesse. Todo o processo segue os padrões em conformidade com as BPF e é implementado dentro da nossa instituição acadêmica.

Introdução

O surgimento das Terapias Celulares Adotivas (ACT) e das células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) trouxe uma mudança revolucionária na prática clínica moderna, estabelecendo um novo paradigma de medicina personalizada. Particularmente, as células CAR-T direcionadas para CD19 têm demonstrado respostas clínicas excepcionais e representam a terapia de células T mais avançada para neoplasias malignas de células B 1,2,3,4,5. No entanto, as atuais terapias de células T modificadas por genes comercializadas dependem fortemente de vetores virais para a transferência de genes. A implementação de vetores virais em TCA, especialmente em condições de Boas Práticas de Fabricação (BPF) em um ambiente acadêmico, apresenta desafios significativos devido a limitações de escalabilidade, requisitos de equipamentos especializados, necessidade de pessoal altamente qualificado e uso de reagentes compatíveis com GMP para produção de partículas virais mediadas por plasmídeos 6,7,8.

Consequentemente, o processo de fabricação de terapias de células T modificadas por genes é intrincado e tipicamente começa com o isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de um produto de leuceferese. As células T são frequentemente enriquecidas a partir do pool de CMSP e ativadas por microcomplexos anti-CD3/CD28 7,9. Posteriormente, as células T são geneticamente modificadas com vetores virais ou não virais, que podem ser produzidos in situ ou terceirizados. Para atingir o número de células necessário para infusão, as células modificadas por genes são expandidas antes da formulação final e/ou criopreservação. Finalmente, o produto celular deve satisfazer vários critérios de liberação baseados em múltiplos ensaios de controle de qualidade9.

Este protocolo apresenta uma metodologia abrangente utilizando técnicas simples para a manipulação ex vivo de CMSP saudáveis para a fabricação de um produto de células T modificado por genes sob condições compatíveis com GMP. O protocolo incorpora o uso de um vetor lentiviral, que pode ser terceirizado para uma empresa de produção viral fornecendo todos os testes quantitativos/funcionais, de pureza e segurança necessários (por exemplo, título viral, detecção de lentivírus competente para replicação de DNA da célula hospedeira). Para este estudo, o vetor empregado é um vetor lentiviral de segunda geração baseado em VSV-g (Vesicular Stomatitis Virus G Protein) com proteína verde fluorescente (GFP), como gene de interesse, em expressão constitutiva.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Patras e pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Geral Universitário de Patras. Antes da obtenção dos espécimes biológicos, o consentimento informado foi obtido de indivíduos saudáveis. A avaliação da elegibilidade dos participantes foi conduzida de acordo com os procedimentos institucionais e em conformidade com as normas JACIE para leucaférese. Se este protocolo deve ser implementado em um ambiente clínico de ACT, todos os procedimentos devem seguir as diretrizes de Boas Práticas de Fabricação (BPF) e ser realizados em salas limpas compatíveis com BPF. Precauções especiais de segurança são necessárias ao trabalhar com vetores virais, e esses procedimentos devem ser conduzidos dentro de um gabinete de biossegurança dedicado. Neste estudo, os procedimentos descritos foram conduzidos dentro de uma hipoxiestação HEPA H35 validada (ver Tabela de Materiais) para garantir um ambiente controlado e monitorado. A descontaminação de todos os líquidos perigosos deve ser realizada usando solução de água sanitária a 10%.

1. Isolamento de CMSP e ativação de células T (Dia 0)

  1. Coletar células da bolsa de aférese do doador (leucopaks, ver Tabela de Materiais) em tubos de 50 mL, dependendo do volume inicial.
  2. Realizar duas lavagens da bolsa celular infundindo 15 mL de meio hematopoiético completo (+5% HSA, meio hematopoiético comercial sem soro, ver Tabela de Materiais).
  3. Conduzir centrifugação por gradiente de densidade baseada em polissacarídeo em uma diluição de 1:2 (reagente:amostra). Centrifugar a 800 x g por 30 min à temperatura ambiente com pausas (A/D, 9/0).
  4. Usando uma micropipeta, colete PBMCs em um tubo limpo de 50 mL.
  5. Lavar as células duas vezes com 1x PBS, enchendo até 50 mL para cada lavagem (400 x g, 10 min, temperatura ambiente). Ressuspender as células em 5 mL de meio completo.
  6. Conte as células usando azul de tripano usando um hemocitômetro padrão ou um contador de células automatizado (consulte a Tabela de Materiais).
  7. Diluir as células com meios completos para atingir uma concentração de 2 x 106 células/mL.
  8. Ativar 20 x 106 PBMCs adicionando 10 μL de reagente de estimulação de células T (ver Tabela de Materiais) por 2 x 106 células iniciais.
    Observação : este protocolo é projetado para a ativação de 20 x 106 PBMCs, mas pode ser ajustado para números de célula maiores, conforme necessário.
  9. Adicione rhIL-2 (20 U/mL) (ver Tabela de Materiais), misture delicadamente e transfira a mistura para um recipiente apropriado (por exemplo, placa de 6 poços).
  10. Incubar as células a 37 °C, 5% CO2 durante 72 h.

2. Transdução de células T lentivirais (Dia 3)

  1. Transfira a cultura celular para um recipiente adequado, como um tubo cônico de 50 mL. Misture bem e centrifuja a 300 x g por 10 min à temperatura ambiente (TR) para remover o reagente de ativação. Descarte cuidadosamente o sobrenadante completamente e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio completo.
    NOTA: Nesta fase, é possível descongelar o vírus no gelo.
  2. Conte as células usando azul de tripano.
  3. Ressuspender as células em meio completo para atingir uma concentração que permita plaquear 0,5 x 106 células em um volume total de 400 μL por poço em uma placa de 24 poços. Adicionar rhIL-7 (155 U/mL) e rhIL-15 (290 U/mL) (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Certifique-se de levar em conta o volume de vírus a ser adicionado. Consulte a etapa 2.4.
  4. Num tubo separado, adicionar Vectofusina-1 (ver Tabela de Materiais) ao meio Opti-MEM a uma concentração de 10 μg/ml, com um volume igual ao volume viral a utilizar.
    NOTA: Considere o volume total de cultura celular ao calcular a concentração de Vectofusina-1. Consulte a etapa 2.3. Alternativamente, Vectofusin-1 GMP pode ser usado como um reagente de grau GMP.
  5. Combinar o vírus concentrado a uma Multiplicidade de Infecção (MOI) de 40 com a mistura Vectofusina-1/Opti-MEM (proporção 1:1) e misturar completamente. Adicionar esta mistura à cultura celular e ajustar o volume total para 400 μL por poço usando meio completo, se necessário.
  6. Coloque a tampa sobre a placa, sele com filme de parafina e centrifugue a 1000 x g por 2 h a 32 °C. Em seguida, incubar a placa a 37 °C, 5% CO2 durante a noite.

3. Remoção de vírus e expansão de células T (Dia 4)

  1. Colete as células e agrupe-as em um recipiente adequado, como um tubo de 50 mL.
  2. Centrifugar as células a 400 x g à temperatura ambiente (TR) durante 5 min. Remover cuidadosamente o sobrenadante completamente e ressuspender o pellet em 1 mL de meio completo.
  3. Conte as células usando azul de tripano. Ressuspender as células em meio completo na concentração de 1 x 106 células/mL. Adicionar rhIL-7 (155 U/mL) e rhIL-15 (290 U/mL) (ver Tabela de Materiais).
  4. Transferir as células para um recipiente apropriado, como um frasco T25, na concentração de 0,3-0,5 x10 6 células/cm2 e incubá-las a 37 °C, 5% CO2, por 2 dias.
    NOTA: Se uma população celular maior for necessária, as células podem ser subcultivadas (1:2) na presença de rhIL7 e rhIL-15 a cada 2 dias, seguindo as mesmas condições de incubação mencionadas acima, até que os números de células desejados sejam alcançados.

4. Criopreservação (Dia 14)

NOTA: O gelo será necessário para transferir criovials para o local de armazenamento durante esta etapa. O momento da criopreservação depende do número de células desejadas. Para este protocolo, a criopreservação é realizada no dia 14 após a obtenção de uma expansão de 25 vezes.

  1. Uma vez atingido o número de células desejado, colete as células e transfira-as para tubos de 50 mL (ajuste o número de tubos com base no volume total).
  2. Centrifugar os tubos a 400 x g à temperatura ambiente (TR) durante 5 min. Remover cuidadosamente o sobrenadante completamente e ressuspender o pellet em 10 mL de meio. Se necessário, agrupe as células de vários tubos.
  3. Conte as células usando azul de tripano. Mantenha uma alíquota de 1 x 106 células para cada teste de controle de qualidade (CQ) (consulte a Seção 5) para avaliar o número de cópia vetorial e a eficiência da transdução.
  4. Centrifugar os tubos a 400 x g por 10 min em RT. Neste ponto, rotule os criósicos de acordo.
  5. Remover completamente o sobrenadante e ressuspender o pellet em uma solução de criopreservação composta por 50% de HSA e 40% de HBSS na concentração de 1 x 107 células por mL por criovial. Transfira a suspensão celular para o número adequado de crióscos e adicione 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada criovial.
  6. Coloque os criósicos no gelo e transfira-os imediatamente para um congelador de taxa controlada para criopreservação. Após a criopreservação, transfira os criofrascos para um tanque de nitrogênio líquido monitorado para armazenamento a longo prazo.

5. Controle de qualidade (Dia 14)

NOTA: Para os testes de liberação, o produto passou por vários testes, incluindo testes de esterilidade para crescimento microbiano e avaliação do nível de endotoxina. Estes testes foram realizados em laboratórios certificados no Hospital Geral Universitário de Patras e na Universidade de Patras. A presença de micoplasma foi determinada internamente usando um ensaio de detecção bioquímica e medida em um luminômetro seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). O fenótipo celular (Figura 1), bem como o número e a viabilidade celular, foram avaliados internamente por citometria de fluxo (ver secção 5.1) e por um contador automático de células (ver Tabela de Materiais), respetivamente. Os critérios de liberação foram estabelecidos com base em dados publicados e recomendações10,11 para produtos celulares produzidos com GMP (Tabela 1).

  1. Realizar a coloração de eficiência de transdução por citometria de fluxo (Dia 14)
    NOTA: Uma alíquota de 1 x 106 células será corada para viabilidade (7-AAD) e marcadorCD3 2 para avaliar a eficiência da transdução (ver Tabela de Materiais). Se o gene de interesse, como no caso das células CAR T, precisar ser detectado, o anticorpo específico deve estar em uma cor diferente da do marcador CD3 e 7-AAD para evitar compensação. Devem ser tidas em conta amostras de controlo adequadas.
    1. Colocar a amostra num tubo FACS e adicionar 500 μL de tampão FACS.
    2. Centrifugar o tubo a 400 x g em RT por 5 min.
    3. Eliminar completamente o sobrenadante com uma pipeta e voltar a suspender o pellet numa solução diluída 1:5 de tampão CD3:FACS (ver Tabela de Materiais).
    4. Vórtice a amostra e incube por 30 min no gelo no escuro.
    5. Adicionar 500 μL de tampão FACS. Centrifugar a 400 x g por 5 min (RT).
    6. Eliminar completamente o sobrenadante e voltar a suspender o pellet numa solução diluída 1:20 de tampão 7-AAD:FACS (ver Tabela de Materiais).
    7. Vórtice a amostra e incube por 10 min no gelo no escuro.
    8. Adicionar 200 μL de tampão FACS e analisar a amostra usando um citômetro de fluxo (ver Tabela de Materiais).

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Resultados

Avaliação da eficiência de transdução
As células transduzidas foram avaliadas quanto à expressão do gene de interesse (GFP) por citometria de fluxo. Resultados representativos estão representados na Figura 1. No Dia 14, mais de 95% das células estavam CD3+, indicando ativação e expansão bem-sucedidas de células T. A eficiência de transdução dentro da população CD3+ foi medida em 58,7% (DT, Figura 1C<...

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Discussão

Os vetores lentivirais como veículos de liberação gênica são ferramentas importantes no campo da terapia celular e gênica devido à sua capacidade de transduzir células em divisão e não em divisão12. No entanto, a produção em larga escala de vetores lentivirais usando métodos compatíveis com GMP ainda é um desafio devido a vários parâmetros, como métodos de transfecção e etapas de purificação, que podem resultar em variabilidade nos lotes de lentivírus. Os centros acadêmico...

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Divulgações

N.S. elaborou o protocolo e escreveu o manuscrito que foi revisado e supervisionado por A.S.; K.S., G.A. realizou experimentos adicionais; D.K., M.L. forneceu valioso apoio nos experimentos e junto com V.Z., N.T. no processo de revisão. N.T. é membro da ProtATonce Ltd. Todos os outros autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Esta investigação foi co-financiada pela União Europeia e fundos nacionais gregos através do Programa Operacional Competitividade, Empreendedorismo e Inovação, no âmbito da chamada RESEARCH - CREATE - INNOVATE (código do projeto: T2EDK - 00474). Também gostaríamos de expressar nossa gratidão à Choose Life Foundation por fornecer apoio contínuo ao GMP Lab "Dimitris Lois" do Instituto de Terapia Celular.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well TC-treated plateCorning353047
5 mL FACS tube Corning352054
50 mL Falcon tubesGreiner biomedica227261
6-well TC-treated plateCorning353046
7-AADBD Biosciences559925
BD FACS CANTO IIBD BiosciencesV96300084
BSAApplichemA1391
Cell Counter Corning Cell CytosmartJ21E0081
CryovialsGreiner biomedica122263
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)Life Technologies14190
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)--
FlowJo Software v10.6.2 TreeStar Inc-
Gibco CTS Opti-MEM I MediumThermoFisher ScientificA4124801
GMP rhIL-15Miltenyi Biotec170-076-114
GMP rhIL-2Miltenyi Biotec170-076-146
GMP rhIL-7Miltenyi Biotec170-076-111
Hanks’s Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175
HEPA Whitley H35 HypoxystationDon Whitley ScientificHA0315172H
Human Serum Albumin (HSA)BaxterB05AA01
Junior LB 9509 Portable LuminometerBerthold Technologies6506
Lenti-X Provirus Quantitation KitTakara Bio631239
LymphoprepStemcell Technologies7811
MACS GMP T cell TransActMiltenyi Biotec170-076-156
Mouse Anti-Human  CD3 (Clone: UCHT-1)BD Biosciences557706
MycoAlert Plus Detection kitLonza BioscienceLT07-703
Parafilm ultra-expandable closing film tape 5 cm x 75 mD.Dutscher90261
PeriStem PS-650-DB (apheresis bag)Biomed DeviceSC00816
Planer Kryo10 Series IIIPlaner
T75 flasksGreiner biomedica658175
Trypan blue, 0.4% solutionInvitrogenT10282
Vectofusin-1 GMPMiltenyi Biotec170-076-165
X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza BioscienceA1048501

Referências

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