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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Transduktion primärer menschlicher T-Zellen mit einem Gen von Interesse, um die Kompatibilität mit den GMP-Standards (Good Manufacturing Practice) sicherzustellen.

Zusammenfassung

Das Gebiet der adoptiven Zelltherapie (ACT) wurde durch die Entwicklung genetisch veränderter Zellen, insbesondere chimärer Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen, revolutioniert. Diese modifizierten Zellen haben bei Patienten mit hämatologischen Malignomen bemerkenswerte klinische Reaktionen gezeigt. Die hohen Kosten für die Herstellung dieser Therapien und die Durchführung umfangreicher Qualitätskontrollbewertungen haben jedoch ihren Zugang zu einem breiteren Spektrum von Patienten eingeschränkt. Um dieses Problem anzugehen, untersuchen viele akademische Einrichtungen die Machbarkeit der eigenen Herstellung gentechnisch veränderter Zellen unter Einhaltung der Richtlinien nationaler und internationaler Regulierungsbehörden.

Die Herstellung gentechnisch veränderter T-Zell-Produkte in großem Maßstab stellt mehrere Herausforderungen dar, insbesondere im Hinblick auf die Produktionskapazitäten der Institution und die Notwendigkeit, die Anforderungen an die Infusionsmenge zu erfüllen. Eine große Herausforderung besteht darin, großflächige virale Vektoren nach den Richtlinien der Good Manufacturing Practice (GMP) herzustellen, die oft an externe Unternehmen ausgelagert werden. Darüber hinaus kann die Vereinfachung des T-Zell-Transduktionsprozesses dazu beitragen, die Variabilität zwischen den Produktionschargen zu minimieren, die Kosten zu senken und die Schulung des Personals zu erleichtern. In dieser Studie skizzieren wir einen optimierten Prozess für die lentivirale Transduktion von primären menschlichen T-Zellen mit einem fluoreszierenden Marker als interessierendem Gen. Der gesamte Prozess entspricht GMP-konformen Standards und wird in unserer akademischen Einrichtung implementiert.

Einleitung

Das Aufkommen von adoptiven Zelltherapien (ACT) und chimären Antigenrezeptoren (CAR)-T-Zellen hat zu einem revolutionären Wandel in der modernen klinischen Praxis geführt und ein neues Paradigma der personalisierten Medizin etabliert. Insbesondere CAR-T-Zellen, die auf CD19 abzielen, haben außergewöhnliche klinische Reaktionen gezeigt und stellen die fortschrittlichste T-Zelltherapie für B-Zell-Malignomedar 1,2,3,4,5. Die derzeit kommerzialisierten genmodifizierten T-Zelltherapien sind jedoch stark auf virale Vektoren für den Gentransfer angewiesen. Die Implementierung viraler Vektoren in ACT, insbesondere unter GMP-Bedingungen (Good Manufacturing Practice) in einem akademischen Umfeld, stellt aufgrund von Skalierbarkeitsbeschränkungen, speziellen Ausrüstungsanforderungen, dem Bedarf an hochqualifiziertem Personal und der Verwendung von GMP-konformen Reagenzien für die Plasmid-vermittelte Produktion von Viruspartikeln erhebliche Herausforderungendar 6,7,8.

Folglich ist der Herstellungsprozess für genmodifizierte T-Zelltherapien kompliziert und beginnt typischerweise mit der Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus einem Leukaphereseprodukt. T-Zellen werden häufig aus dem PBMC-Pool angereichert und mit Anti-CD3/CD28-Mikrokomplexen aktiviert 7,9. Anschließend werden T-Zellen entweder mit viralen oder nicht-viralen Vektoren genetisch verändert, die in situ hergestellt oder ausgelagert werden können. Um die erforderliche Zellzahl für die Infusion zu erreichen, werden genmodifizierte Zellen vor der endgültigen Formulierung und/oder Kryokonservierung expandiert. Schließlich muss das Zellprodukt verschiedene Freigabekriterien erfüllen, die auf mehreren Qualitätskontrollassays basieren9.

Dieses Protokoll stellt eine umfassende Methodik dar, die einfache Techniken für die Ex-vivo-Manipulation gesunder PBMCs verwendet, um ein genmodifiziertes T-Zellprodukt unter GMP-konformen Bedingungen herzustellen. Das Protokoll beinhaltet die Verwendung eines lentiviralen Vektors, der an ein virales Produktionsunternehmen ausgelagert werden kann, das alle erforderlichen quantitativen/funktionellen, Reinheits- und Sicherheitstests (z. B. Virustiter, Nachweis von Lentivirus, DNA-Replikations-kompetentem Lentivirus der Wirtszelle) anbietet. Für diese Studie ist der verwendete Vektor ein auf VSV-g (Vesicular Stomatitis Virus G Protein) basierender lentiviraler Vektor der zweiten Generation mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) als interessierendem Gen in konstitutiver Expression.

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Protokoll

Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Universität Patras und dem Institutional Review Board des Universitätskrankenhauses Patras genehmigt. Vor der Entnahme biologischer Proben wurde die Einverständniserklärung gesunder Personen eingeholt. Die Bewertung der Eignung der Teilnehmer wurde nach institutionellen Verfahren und in Übereinstimmung mit den JACIE-Standards für Leukapherese durchgeführt. Wenn dieses Protokoll in einer klinischen ACT-Umgebung implementiert werden soll, müssen alle Verfahren den Richtlinien der Good Manufacturing Practice (GMP) entsprechen und in GMP-konformen Reinräumen durchgeführt werden. Bei der Arbeit mit viralen Vektoren sind besondere Sicherheitsvorkehrungen erforderlich, und diese Verfahren sollten in einer speziellen Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden. In dieser Studie wurden die beschriebenen Verfahren in einer validierten H35-HEPA-Hypoxystation (siehe Materialtabelle) durchgeführt, um eine kontrollierte und überwachte Umgebung zu gewährleisten. Die Dekontamination aller gefährlichen Flüssigkeiten sollte mit 10% iger Bleichlösung durchgeführt werden.

1. PBMC-Isolierung und T-Zell-Aktivierung (Tag 0)

  1. Sammeln Sie Zellen aus dem Spenderapheresebeutel (Leukopaken, siehe Materialtabelle) in 50-ml-Röhrchen, abhängig vom Ausgangsvolumen.
  2. Führen Sie zwei Wäschen des Zellbeutels durch, indem Sie 15 ml vollständiges hämatopoetisches Medium infundieren (+5% HSA, handelsübliches serumfreies hämatopoetisches Medium, siehe Materialtabelle).
  3. Führen Sie eine Dichtegradientenzentrifugation auf Polysaccharidbasis in einer Verdünnung von 1:2 (Reagenz:Probe) durch. Bei 800 x g 30 min bei Raumtemperatur mit Abbruch zentrifugieren (A/D, 9/0).
  4. Sammeln Sie PBMCs mit einer Mikropipette in einem sauberen 50-ml-Röhrchen.
  5. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS und füllen Sie sie bei jeder Wäsche bis zu 50 ml (400 x g, 10 min, Raumtemperatur). Resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml vollständigem Medium.
  6. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau entweder mit einem Standard-Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler (siehe Materialtabelle).
  7. Verdünnen Sie die Zellen mit vollständigen Medien, um eine Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml zu erreichen.
  8. Aktivieren Sie 20 x 106 PBMCs durch Zugabe von 10 μl T-Zell-Stimulationsreagenz (siehe Materialtabelle) pro 2 x 106 Startzellen.
    HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Aktivierung von 20 x 106 PBMCs ausgelegt, kann aber bei Bedarf für größere Zellenzahlen angepasst werden.
  9. Fügen Sie rhIL-2 (20 U/ml) hinzu (siehe Materialtabelle), mischen Sie vorsichtig und geben Sie die Mischung in ein geeignetes Gefäß (z. B. 6-Well-Platte).
  10. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 für 72 h.

2. Lentivirale T-Zell-Transduktion (Tag 3)

  1. Übertragen Sie die Zellkultur in ein geeignetes Gefäß, z. B. ein konisches 50-ml-Röhrchen. Gut mischen und bei 300 x g 10 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren, um das Aktivierungsreagenz zu entfernen. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig vollständig und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml vollständigem Medium.
    HINWEIS: In diesem Stadium ist es möglich, das Virus auf Eis aufzutauen.
  2. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau.
  3. Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigem Medium, um eine Konzentration zu erreichen, die eine Beschichtung von 0,5 x 106 Zellen in einem Gesamtvolumen von 400 μl pro Well in einer 24-Well-Platte ermöglicht. Fügen Sie rhIL-7 (155 U/ml) und rhIL-15 (290 U/ml) hinzu (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Menge der hinzuzufügenden Viren berücksichtigen. Siehe Schritt 2.4.
  4. Geben Sie in einem separaten Röhrchen Vectofusin-1 (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 10 μg/ml in Opti-MEM-Medium mit einem Volumen, das dem zu verwendenden Virusvolumen entspricht.
    HINWEIS: Berücksichtigen Sie das Gesamtvolumen der Zellkultur, wenn Sie die Konzentration von Vectofusin-1 berechnen. Siehe Schritt 2.3. Alternativ kann Vectofusin-1 GMP als Reagenz in GMP-Qualität verwendet werden.
  5. Kombinieren Sie das konzentrierte Virus bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 40 mit der Vectofusin-1/Opti-MEM-Mischung (Verhältnis 1:1) und mischen Sie es gründlich. Geben Sie diese Mischung in die Zellkultur und stellen Sie das Gesamtvolumen bei Bedarf auf 400 μl pro Vertiefung mit vollständigem Medium ein.
  6. Den Deckel auf die Platte legen, mit Paraffinfolie verschließen und bei 1000 x g 2 h bei 32 °C zentrifugieren. Anschließend die Platte bei 37 °C, 5 % CO2 über Nacht inkubieren.

3. Virusentfernung und T-Zell-Expansion (Tag 4)

  1. Sammeln Sie die Zellen und poolen Sie sie in einem geeigneten Gefäß, z. B. einem 50-ml-Röhrchen.
  2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 x g bei Raumtemperatur (RT) für 5 min. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig vollständig und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml vollständigem Medium.
  3. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau. Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigen Medien in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml. Fügen Sie rhIL-7 (155 U/ml) und rhIL-15 (290 U/ml) hinzu (siehe Materialtabelle).
  4. Die Zellen werden in ein geeignetes Gefäß, z. B. einen T25-Kolben, in einer Konzentration von 0,3-0,5 x 106 Zellen/cm2 überführt und 2 Tage lang bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert.
    HINWEIS: Wenn eine größere Zellpopulation erforderlich ist, können die Zellen alle 2 Tage unter den gleichen Inkubationsbedingungen subkultiviert werden (1:2) in Gegenwart von rhIL7 und rhIL-15, bis die gewünschte Zellzahl erreicht ist.

4. Kryokonservierung (Tag 14)

HINWEIS: Während dieses Schritts wird Eis benötigt, um Kryofläschchen an den Lagerort zu bringen. Der Zeitpunkt der Kryokonservierung hängt von der gewünschten Zellzahl ab. Für dieses Protokoll wird die Kryokonservierung am Tag 14 durchgeführt, nachdem eine 25-fache Expansion erreicht wurde.

  1. Sobald die gewünschte Zellzahl erreicht ist, ernten Sie die Zellen und überführen Sie sie in 50-ml-Röhrchen (passen Sie die Anzahl der Röhrchen basierend auf dem Gesamtvolumen an).
  2. Die Röhrchen bei 400 x g bei Raumtemperatur (RT) 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig vollständig und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml Medien. Bei Bedarf werden die Zellen aus mehreren Röhrchen gepoolt.
  3. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau. Halten Sie ein Aliquot von 1 x 106 Zellen für jeden Qualitätskontrolltest (QK) (siehe Abschnitt 5) bereit, um die Vektorkopienzahl und die Transduktionseffizienz zu beurteilen.
  4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 x g für 10 min bei RT. Beschriften Sie die Kryofläschchen an dieser Stelle entsprechend.
  5. Entfernen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie das Pellet in einer Kryokonservierungslösung, die aus 50 % HSA und 40 % HBSS besteht, in einer Konzentration von 1 x 107 Zellen pro ml pro Kryofläschchen. Übertragen Sie die Zellsuspension in die entsprechende Anzahl von Kryofläschchen und fügen Sie jedem Kryoröhrchen 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzu.
  6. Legen Sie die Kryofläschchen auf Eis und geben Sie sie sofort zur Kryokonservierung in einen Gefrierschrank mit kontrollierter Geschwindigkeit. Nach der Kryokonservierung werden die Kryofläschchen zur Langzeitlagerung in einen überwachten Flüssigstickstofftank überführt.

5. Qualitätskontrolle (Tag 14)

HINWEIS: Für Freigabetests wurde das Produkt mehreren Tests unterzogen, darunter Sterilitätstests auf mikrobielles Wachstum und die Bewertung des Endotoxingehalts. Diese Tests wurden in zertifizierten Labors des Universitätskrankenhauses Patras und der Universität Patras durchgeführt. Das Vorhandensein von Mykoplasmen wurde intern mit einem biochemischen Nachweisassay bestimmt und gemäß den Anweisungen des Herstellers auf einem Luminometer gemessen (siehe Materialtabelle). Der Zellphänotyp (Abbildung 1) sowie die Zellzahl und -viabilität wurden intern durch Durchflusszytometrie (siehe Abschnitt 5.1) bzw. einen automatisierten Zellzähler (siehe Materialtabelle) bewertet. Freigabekriterien wurden auf der Grundlage veröffentlichter Daten und Empfehlungen10,11 für GMP-hergestellte Zellprodukte festgelegt (Tabelle 1).

  1. Durchführung einer Transduktionseffizienz-Durchflusszytometrie-Färbung (Tag 14)
    HINWEIS: Ein Aliquot von 1 x 106 Zellen wird auf Lebensfähigkeit (7-AAD) und CD3-Marker2 gefärbt, um die Transduktionseffizienz zu bewerten (siehe Materialtabelle). Wenn das interessierende Gen, wie im Fall von CAR-T-Zellen, nachgewiesen werden muss, sollte der spezifische Antikörper eine andere Farbe als der CD3-Marker und 7-AAD haben, um eine Kompensation zu vermeiden. Geeignete Kontrollproben sollten berücksichtigt werden.
    1. Geben Sie die Probe in ein FACS-Röhrchen und fügen Sie 500 μl FACS-Puffer hinzu.
    2. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g bei RT für 5 min.
    3. Entsorgen Sie den Überstand vollständig mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Pellet in einer 1:5 verdünnten Lösung von CD3:FACS-Puffer (siehe Materialtabelle).
    4. Wirbeln Sie die Probe vor und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis im Dunkeln.
    5. Fügen Sie 500 μl FACS-Puffer hinzu. Zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 min (RT).
    6. Entsorgen Sie den Überstand vollständig und resuspendieren Sie das Pellet in einer 1:20 verdünnten Lösung von 7-AAD:FACS-Puffer (siehe Materialtabelle).
    7. Wirbeln Sie die Probe vor und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang auf Eis im Dunkeln.
    8. Fügen Sie 200 μl FACS-Puffer hinzu und analysieren Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer (siehe Materialtabelle).

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Ergebnisse

Bewertung der Transduktionseffizienz
Die transduzierten Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie auf die Expression des interessierenden Gens (GFP) untersucht. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt. An Tag 14 waren mehr als 95% der Zellen CD3+, was auf eine erfolgreiche T-Zell-Aktivierung und -Expansion hinweist. Die Transduktionseffizienz innerhalb der CD3+-Population wurde mit 58,7 % gemessen (TD,

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Diskussion

Lentivirale Vektoren als Gentransportvehikel sind wichtige Werkzeuge auf dem Gebiet der Zell- und Gentherapie, da sie sowohl sich teilende als auch sich nicht teilende Zellen transduzieren können12. Die großtechnische Produktion von lentiviralen Vektoren mit GMP-konformen Methoden ist jedoch aufgrund verschiedener Parameter, wie Transfektionsmethoden und Aufreinigungsschritte, immer noch eine Herausforderung, was zu einer Variabilität der Lentivirus-Chargen führen kann. Akademische Zentren bez...

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Offenlegungen

N.S. entwickelte das Protokoll und schrieb das Manuskript, das von A.S. überprüft und beaufsichtigt wurde; K.S., G.A. führte zusätzliche Experimente durch; D.K., M.L. leistete wertvolle Unterstützung bei den Experimenten und zusammen mit V.Z., N.T. im Begutachtungsprozess. N.T. ist Mitglied von ProtATonce Ltd. Alle anderen Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von der Europäischen Union und den griechischen nationalen Mitteln im Rahmen des Operationellen Programms Wettbewerbsfähigkeit, Unternehmertum und Innovation unter der Bezeichnung RESEARCH - CREATE - INNOVATE (Projektcode: T2EDK - 00474) kofinanziert. Wir möchten uns auch bei der Choose Life Foundation für die kontinuierliche Unterstützung des GMP-Labors "Dimitris Lois" des Instituts für Zelltherapie bedanken.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well TC-treated plateCorning353047
5 mL FACS tube Corning352054
50 mL Falcon tubesGreiner biomedica227261
6-well TC-treated plateCorning353046
7-AADBD Biosciences559925
BD FACS CANTO IIBD BiosciencesV96300084
BSAApplichemA1391
Cell Counter Corning Cell CytosmartJ21E0081
CryovialsGreiner biomedica122263
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)Life Technologies14190
EDTAInvitrogen15575-038
FACS Buffer (1x D-PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA)--
FlowJo Software v10.6.2 TreeStar Inc-
Gibco CTS Opti-MEM I MediumThermoFisher ScientificA4124801
GMP rhIL-15Miltenyi Biotec170-076-114
GMP rhIL-2Miltenyi Biotec170-076-146
GMP rhIL-7Miltenyi Biotec170-076-111
Hanks’s Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175
HEPA Whitley H35 HypoxystationDon Whitley ScientificHA0315172H
Human Serum Albumin (HSA)BaxterB05AA01
Junior LB 9509 Portable LuminometerBerthold Technologies6506
Lenti-X Provirus Quantitation KitTakara Bio631239
LymphoprepStemcell Technologies7811
MACS GMP T cell TransActMiltenyi Biotec170-076-156
Mouse Anti-Human  CD3 (Clone: UCHT-1)BD Biosciences557706
MycoAlert Plus Detection kitLonza BioscienceLT07-703
Parafilm ultra-expandable closing film tape 5 cm x 75 mD.Dutscher90261
PeriStem PS-650-DB (apheresis bag)Biomed DeviceSC00816
Planer Kryo10 Series IIIPlaner
T75 flasksGreiner biomedica658175
Trypan blue, 0.4% solutionInvitrogenT10282
Vectofusin-1 GMPMiltenyi Biotec170-076-165
X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza BioscienceA1048501

Referenzen

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