Una técnica mejorada para la detección de trimetilamina en medicina de origen animal mediante cromatografía de gases en el espacio de cabeza-espectrometría de masas cuadrupolar en tándem

Resumen

En este trabajo se describe un método de cromatografía de gases-espectrometría de masas cuadrupolar en tándem (HS-GC-MS/MS) adecuado para la determinación de trimetilamina (TMA) en medicamentos de origen animal. El protocolo incluye el pretratamiento de la muestra, el tratamiento del espacio de cabeza, las condiciones de análisis, la validación metodológica y la determinación de TMA en medicamentos de origen animal.

Resumen

Los medicamentos de origen animal tienen características distintivas y efectos curativos significativos, pero la mayoría de ellos tienen un olor obvio a pescado, lo que resulta en un cumplimiento deficiente de los pacientes clínicos. La trimetilamina (TMA) es uno de los componentes clave del olor a pescado en la medicina de origen animal. Es difícil identificar la TMA con precisión utilizando el método de detección existente debido al aumento de la presión en el vial del espacio de cabeza causado por la rápida reacción ácido-base después de la adición de lejía, lo que hace que la TMA escape del vial del espacio de cabeza, deteniendo el progreso de la investigación del olor a pescado de la medicina de origen animal. En este estudio, propusimos un método de detección controlada que introdujo una capa de parafina como capa de aislamiento entre el ácido y la lejía. La tasa de producción de TMA podría controlarse de manera efectiva licuar lentamente la capa de parafina a través del calentamiento termostático del horno. Este método mostró linealidad satisfactoria, experimentos de precisión y recuperaciones con buena reproducibilidad y alta sensibilidad. Prestó apoyo técnico para la desodorización de medicamentos de origen animal.

Introducción

El tratamiento de las enfermedades humanas mediante la utilización de productos derivados de partes de animales y/o sus subproductos (denominados aquí medicamentos de origen animal) está recibiendo cada vez más atención. Desempeñan un papel importante en el tratamiento del cáncer, las enfermedades cardiovasculares, la cirrosis hepática, la mastitis y otras enfermedades, con las ventajas de un efecto fuerte, una dosis pequeña y una eficacia clínica significativa y específica. Sin embargo, los medicamentos de origen animal generalmente tienen un olor a pescado prominente, lo que afecta en gran medida el cumplimiento de los pacientes y son especialmente desfavorables para los niños ^1,2. El olor a pescado proviene principalmente de las proteínas, aminoácidos, grasas y otras sustancias contenidas en el medicamento, que se descomponen a través de la oxidación de ácidos grasos, la degradación de aminoácidos y otras formas de producir una variedad de sustancias con olor a pescado ^2,3,4. Entre ellos, la trimetilamina (TMA) es un gas volátil con olor a pescado que existe ampliamente en alimentos de origen animal podridos o podridos⁵.

Hasta ahora, la cromatografía de gases (GC), la cromatografía líquida (LC), la cromatografía iónica, la espectrofotometría, la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) y los métodos de sensores se han utilizado comúnmente para detectar TMA en el medio ambiente, los alimentos y la orina 6,7,8,9. En vista de la baja contaminación de la columna de GC y del sistema de inyección, así como de la alta sensibilidad, reproducibilidad y bajo límite de detección (0,1-1 mg/kg), se prefirió el método de cromatografía de gases-espectrometría de masas en el espacio de cabeza (HS-GC-MS) para el análisis alimentario y biológico⁸. En la actualidad, solo China ha establecido un estándar nacional para TMA en alimentos, y HS-GC-MS es el primer método en el estándar GB5009.179-2016¹⁰. Por lo tanto, se seleccionó el método HS-GC-MS anterior para detectar TMA en medicina de origen animal. En la etapa inicial, nuestro grupo de investigación descubrió que el estándar de detección HS-GC-MS para TMA en alimentos podría detectar el olor a pescado en varios medicamentos de origen animal. Combinado con los resultados de los estudios^11,12, se pudo demostrar que la TMA es la sustancia clave común del olor a pescado en los medicamentos de origen animal. Sin embargo, se encontró que la reproducibilidad de los resultados experimentales era pobre, y existían problemas como el escape de TMA y la poca estabilidad, los cuales no pudieron ser verificados por la metodología. Esto podría deberse al hecho de que la lejía se inyectó en el vial del espacio de cabeza y la rápida reacción ácido-base condujo a un aumento de la presión en el vial, por lo que la TMA escapó del poro de inyección, lo que impidió la detección estable y precisa de la TMA. Por lo tanto, este estudio propuso un método mejorado de detección de cromatografía de gases en el espacio de cabeza-espectrometría de masas cuadrupolar en tándem (HS-GC-MS/MS) para abordar estos problemas.

El protocolo mejora el pretratamiento de la muestra al separar los reactivos ácido-base en el pretratamiento con la ayuda de parafina sólida, un buen material de cambio de fase sólido-líquido. A medida que la parafina se licuaba lentamente con el aumento de temperatura del horno termostático, la TMA también se liberaba lentamente en el vial sellado del espacio de cabeza, evitando el aumento de presión causado por la violenta y rápida reacción ácido-base y asegurando una detección estable y precisa de la TMA. Además, la inyección de espacio de cabeza combinada con los modos de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) en GC-MS/MS suprimió eficazmente la interferencia química de la matriz y garantizó la confiabilidad de los resultados. Los resultados de la validación metodológica demostraron que la linealidad, la prueba de precisión y la tasa de recuperación del método de detección mejorado podían cumplir con los requisitos, con buena reproducibilidad y alta sensibilidad.

Protocolo

Ver Tabla 1 para información sobre los materiales medicinales de Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo. Fueron identificados por el profesor Xu Runchun, de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu, como los cuerpos secos de Pheretima aspergillum (E. Perrier), Periplaneta americana L . y Whitmania pigra Whitman.

1. Extracción de muestras

1. Triture Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo con un molinillo de hierbas (ver Tabla de materiales), tamice el polvo medicinal a través de los tamices de medicamentos estándar No. 2 (abertura del tamiz: 0.8 mm) y No. 4 (apertura del tamiz: 0.25 mm), y recoja el polvo entre los dos tamices para obtener el polvo de muestra requerido.
   NOTA: La Pheretima es esponjosa después de la trituración, por lo que no es necesario tamizar su polvo.
2. Tome 1 g de polvo (con una precisión de 0,001 g) en un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml, agregue 20 ml de solución de ácido tricloroacético (TCA) al 5% (consulte la tabla de materiales) y homogeneice a 1,000 ^{rmin-1 durante 1} min con un homogeneizador de dispersión de alta velocidad.
3. Después de la homogeneización, centrifugar a 1.717 x g durante 5 min a temperatura ambiente, agregar un poco de algodón absorbente en el embudo de vidrio y filtrar el sobrenadante en un matraz aforado de 50 mL.
4. Repita el proceso de extracción anterior dos veces con 15 ml y 10 ml de solución de TCA al 5%. Combine el filtrado y dilúyalo a 50 ml con una solución de TCA al 5%.

2. Preparación de reactivos

1. Preparar solución de hidróxido de sodio al 20%: pesar 20 g de hidróxido de sodio y utilizar agua desionizada para fijar el volumen en un matraz aforado de 100 mL.
2. Preparar solución de TCA al 5%: pesar 25 g de TCA y utilizar agua desionizada para fijar el volumen en un matraz aforado de 500 mL.

3. Preparación de la solución madre estándar de TMA

1. Prepare la solución madre estándar de TMA: pese 0,0162 g de muestra estándar de clorhidrato de TMA, disuélvala en una solución de TCA al 5% y fije el volumen a 100 ml, igual a la concentración de 100 μg/ml de solución madre estándar de TMA. Guárdelo a 4 °C.
2. Prepare la solución de uso estándar de TMA: tome un cierto volumen de solución madre estándar de TMA y dilúyala paso a paso con una solución de TCA al 5% a concentraciones de 0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL y 10 μg/mL de solución estándar de TMA.

4. Procesamiento del espacio de cabeza de la muestra

1. Pesar con precisión 2 ml de solución de hidróxido de sodio y 0,5 g de parafina sólida (punto de fusión: 58-60 °C) en un vial de espacio de cabeza de 20 ml (ver Tabla de materiales).
2. Coloque el vial de espacio libre en un horno a 70 °C durante unos 30 min. La parafina sólida se derrite por completo.
3. Sácalo y déjalo enfriar a temperatura ambiente para que la parafina se solidifique. La parafina solidificada sellará el hidróxido de sodio.
4. Tome 2 ml de cada solución de extracción de muestra y colóquela encima de la capa de parafina, presione la tapa y selle.
5. Coloque el vial de espacio de cabeza sellado en la máquina (consulte la Tabla de materiales) para la medición.

5. Establecimiento de las condiciones de análisis HS-GC-MS/MS

1. Consulte la Tabla 2 para conocer las condiciones de espacio de cabeza y las condiciones de GC-MS.
2. Consulte la Tabla 3 para obtener información sobre iones.

6. Dibujo de curva estándar

1. Consulte el procesamiento del espacio de cabeza de la muestra en los pasos 4.1-4.3 para preparar el vial de espacio de cabeza que contiene lejía y la capa de sellado de parafina.
2. Aspire 2 ml de solución estándar de TMA de 0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml, 2 μg/ml, 5 μg/ml y 10 μg/ml de TMA en un vial de espacio de cabeza de 20 ml, selle la tapa y mida en la máquina.

7. Prueba de precisión

1. Consulte el procesamiento del espacio de cabeza de la muestra en los pasos 4.1-4.3 para preparar el vial de espacio de cabeza que contiene lejía y la capa de sellado de parafina.
2. Aspire 2 ml de solución estándar de TMA de 0,1 μg/ml en un vial de espacio de cabeza de 20 ml y selle la tapa. Realice seis pruebas paralelas en la máquina siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales).

8. Experimento de la tasa de recuperación

1. Tome un lote de Pheretima, Periplaneta Americana e Hirudo (S02, S05, S07; Tabla 1) como los medicamentos representativos para el experimento de la tasa de recuperación.
2. Tomar varios lotes de polvo de muestra (S02, S05, S07) y hornearlos en un horno a 50 °C durante 72 h hasta que no se detecte TMA.
3. Consulte el método de preparación de la muestra en las secciones 4-6 para detectar el contenido de TMA en el polvo de medicamento horneado.
4. Tome 1 g de polvo horneado (con una precisión de 0,001 g), colóquelo en un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml y agregue 50 μl de solución estándar de TMA.
   NOTA: La concentración de la solución estándar de TMA es de 100 μg/mL, 1000 μg/mL y 10000 μg/mL.
5. Añadir 20 mL de solución de TCA al 5% y homogeneizar a 1000 ^{rmin-1 durante 1} min.
6. Después de la homogeneización, centrifugar a 1717 x g durante 5 min, agregar un poco de algodón absorbente en el embudo de vidrio y filtrar el sobrenadante en un matraz aforado de 50 mL.
7. Repita el proceso de extracción anterior dos veces con 15 ml y 10 ml de solución de TCA al 5%; combine el filtrado y dilúyalo a 50 ml con una solución de TCA al 5%.

9. Determinación de los límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ)

1. Determine el nivel de detalle por la concentración correspondiente cuando la relación señal/ruido (S/N) = 3.
2. Determine el LOQ por la concentración correspondiente cuando la relación S/N = 10.

10. Determinación del contenido de TMA de la muestra

1. Tome aproximadamente 1 g de polvo fino de Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo, respectivamente, extraiga la muestra de acuerdo con el método anterior y determinela en la máquina.

Resultados

En la Figura 1 y en la Figura 2 se muestran diagramas esquemáticos del principio de preprocesamiento y el funcionamiento de este protocolo, respectivamente. El tiempo pico de TMA fue de 2,3 min, con una forma de pico nítida y sin interferencia de otras impurezas (Figura 3). Midiendo el rango lineal de 0,1-10 μg/mL de solución estándar de TMA, con la concentración de TMA como abscisa y el área del pico como ordenada, se dibuj?...

Discusión

Los medicamentos de origen animal provienen de todo el cuerpo, órganos o tejidos, productos fisiológicos o patológicos, excreciones o secreciones y productos procesados de animales. La TMA es una fuente importante de olor a pescado en los medicamentos de origen animal; es una sustancia maloliente típica con un umbral olfativo muy bajo (0,000032 × ^10-6 V/V) y un fuerte olor a pescado¹³. En la actualidad, el método HS-GC-MS comúnmente utilizado no puede detectar TMA en medicamentos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Beckman Coulter Trading (China) Co.	SSC-2-0213
Chinese herbal medicine grinder	Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory	HX-200K
Convection oven	Sanyo Electric Co., Ltd	MOV-112F
Decapper for 20 mm Aluminum caps	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	V1750004
Electronic balance	Shimadzu Corporation Japan	AUW220D
Gas chromatography mass spectrometry	Shimadzu Corporation Japan	TQ-8050 NX
Headspace Vial	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	25760200
Homogenizer	Shanghai biaomo Factory	FJ200-SH
Preassembled Cap	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	L4150050
Sample sieve	Zhenxing Sieve Factory	/
SH-Volatile Amine	Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd	227-3626-01
Sodium hydroxide	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022101401
Solid paraffin wax	Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory	20221112
Trichloroacetic acid	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022102001
Trimethylamine hydrochloride	Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd	AF22022108
Ultra-pure water system	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd	UPR-11-5T