Headspace Gaz Kromatografisi-Tandem Dört Kutuplu Kütle Spektrometrisi ile Hayvan Kaynaklı Tıpta Trimetilamin Tayini için Geliştirilmiş Bir Teknik

Özet

Burada, hayvansal kaynaklı ilaçlarda trimetilamin (TMA) tayini için uygun bir headspace gaz kromatografisi-tandem dört kutuplu kütle spektrometrisi (HS-GC-MS/MS) yöntemi açıklanmaktadır. Protokol, numune ön işlemini, üst boşluk tedavisini, analiz koşullarını, metodolojik doğrulamayı ve hayvansal kaynaklı ilaçlarda TMA'nın belirlenmesini içerir.

Özet

Hayvansal kaynaklı ilaçların ayırt edici özellikleri ve önemli iyileştirici etkileri vardır, ancak çoğunun belirgin bir balık kokusu vardır ve bu da klinik hastaların zayıf uyumuna neden olur. Trimetilamin (TMA), hayvansal kaynaklı tıptaki en önemli balık kokusu bileşenlerinden biridir. Kostik ilavesinden sonra hızlı asit-baz reaksiyonunun neden olduğu üst boşluk şişesindeki artan basınç nedeniyle mevcut tespit yöntemini kullanarak TMA'yı doğru bir şekilde tanımlamak zordur, bu da TMA'nın üst boşluk şişesinden kaçmasına neden olur ve hayvansal kaynaklı ilaçların balık kokusunun araştırma ilerlemesini durdurur. Bu çalışmada, asit ve kostik arasında bir izolasyon tabakası olarak bir parafin tabakası ekleyen kontrollü bir tespit yöntemi önerdik. TMA üretim hızı, parafin tabakasının termostatik fırın ısıtması yoluyla yavaşça sıvılaştırılmasıyla etkin bir şekilde kontrol edilebilir. Bu yöntem, iyi tekrarlanabilirlik ve yüksek hassasiyet ile tatmin edici doğrusallık, hassas deneyler ve geri kazanımlar gösterdi. Hayvansal kaynaklı ilaçların koku giderme konusunda teknik destek sağladı.

Giriş

Hayvan parçalarından ve/veya bunların yan ürünlerinden (burada hayvansal kaynaklı ilaçlar olarak anılacaktır) elde edilen ürünleri kullanarak insan hastalıklarının tedavisi giderek daha fazla ilgi görmektedir. Kanser, kardiyovasküler hastalık, karaciğer sirozu, mastitis ve diğer hastalıkların tedavisinde güçlü bir etki, küçük dozaj ve önemli ve spesifik klinik etkinlik avantajları ile önemli bir rol oynarlar. Bununla birlikte, hayvansal kaynaklı ilaçlar genellikle belirgin bir balık kokusuna sahiptir, bu da hastaların uyumunu büyük ölçüde etkiler ve özellikle çocuklar için elverişsizdir ^1,2. Balık kokusu esas olarak, yağ asidi oksidasyonu, amino asit bozunması ve balık kokusu ^2,3,4 ile çeşitli maddeler üretmenin diğer yolları yoluyla ayrışan ilaçta bulunan proteinlerden, amino asitlerden^, yağlardan ve diğer maddelerden gelir. Bunlar arasında trimetilamin (TMA), çürüyen veya çürümüş hayvansal kaynaklı gıdalarda yaygın olarak bulunan balık kokusuna sahip uçucu bir gazdır⁵.

Şimdiye kadar, gaz kromatografisi (GC), sıvı kromatografisi (LC), iyon kromatografisi, spektrofotometri, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC-MS) ve sensör yöntemleri, ortamda, yiyeceklerde ve idrarda TMA'yı tespit etmek için yaygın olarak kullanılmıştır 6,7,8,9. GC kolonu ve enjeksiyon sisteminin düşük kontaminasyonunun yanı sıra yüksek hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve düşük tespit limiti (0.1-1 mg/kg) göz önüne alındığında, gıda ve biyolojik analizler için tepe boşluğu gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (HS-GC-MS) yöntemi tercih edilmiştir⁸. Şu anda, yalnızca Çin gıdada TMA için ulusal bir standart oluşturmuştur ve HS-GC-MS, GB5009.179-2016 standardı^10'daki ilk yöntemdir. Bu nedenle, hayvansal kaynaklı tıpta TMA'yı tespit etmek için yukarıdaki HS-GC-MS yöntemi seçilmiştir. Erken aşamada, araştırma grubumuz, gıdalardaki TMA için HS-GC-MS tespit standardının çeşitli hayvan kaynaklı ilaçlardaki balık kokusunu tespit edebildiğini buldu. Çalışmaların sonuçları^11,12 ile birleştiğinde^, TMA'nın hayvansal kaynaklı ilaçlarda balık kokusunun ortak anahtar maddesi olduğu kanıtlanabilir. Bununla birlikte, deneysel sonuçların tekrarlanabilirliğinin zayıf olduğu ve metodoloji ile doğrulanamayan TMA kaçışı ve zayıf stabilite gibi problemlerin olduğu bulunmuştur. Bunun nedeni, kostiğin üst boşluk şişesine enjekte edilmesi ve hızlı asit-baz reaksiyonunun şişede artan basınca yol açması olabilir, böylece TMA enjeksiyon gözeneğinden kaçarak TMA'nın kararlı ve doğru bir şekilde tespit edilmesini engelleyebilir. Bu nedenle, bu çalışma, bu sorunları ele almak için geliştirilmiş bir üst boşluk gaz kromatografisi-tandem dört kutuplu kütle spektrometrisi (HS-GC-MS/MS) algılama yöntemi önermiştir.

Protokol, iyi bir katı-sıvı faz değişim malzemesi olan katı parafin yardımıyla ön işlemdeki asit-baz reaktanları ayırarak numune ön işlemini iyileştirir. Parafin, termostatik fırının sıcaklık artışıyla yavaşça sıvılaştırıldıkça, şiddetli ve hızlı asit-baz reaksiyonunun neden olduğu basınç artışını önleyerek ve kararlı ve doğru TMA tespiti sağlayarak, kapalı üst boşluk şişesinde TMA da yavaşça salındı. Ayrıca, GC-MS/MS'de çoklu reaksiyon izleme (MRM) modlarıyla birleştirilmiş üst boşluk enjeksiyonu, matris kimyasal girişimini etkili bir şekilde bastırdı ve sonuçların güvenilirliğini sağladı. Metodolojik doğrulamanın sonuçları, geliştirilmiş algılama yönteminin doğrusallığının, hassasiyet testinin ve geri kazanım hızının, iyi tekrarlanabilirlik ve yüksek hassasiyetle gereksinimleri karşılayabileceğini kanıtladı.

Protokol

Pheretima, Periplaneta americana ve Hirudo'nun tıbbi malzemeleri hakkında bilgi için Tablo 1'e bakınız. Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi'nden Prof. Xu Runchun tarafından Pheretima aspergillum (E.Perrier), Periplaneta americana L. ve Whitmania pigra Whitman'ın kurutulmuş bedenleri olarak tanımlandılar.

1. Numune ekstraksiyonu

1. Pheretima, Periplaneta americana ve Hirudo'yu bitkisel bir öğütücü ile ezin (Malzeme Tablosuna bakınız), tıbbi tozu No. 2 (elek açıklığı: 0.8 mm) ve No. 4 (elek açıklığı: 0.25 mm) standart ilaç eleklerinden eleyin ve gerekli numune tozunu elde etmek için tozu iki elek arasında toplayın.
   NOT: Pheretima ezildikten sonra kabarıktır, bu nedenle tozunun elenmesine gerek yoktur.
2. 50 mL'lik bir plastik santrifüj tüpüne 1 g toz (0,001 g'a kadar hassas) alın, 20 mL %5 trikloroasetik asit (TCA) çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve yüksek hızlı dispersiyon homojenizatörü ile 1.000 ^{rmin-1'de 1} dakika homojenize edin.
3. Homojenizasyondan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.717 x g'da santrifüjleyin, cam huniye biraz emici pamuk ekleyin ve süpernatanı 50 mL'lik hacimsel bir şişeye süzün.
4. Yukarıdaki ekstraksiyon işlemini 15 mL ve 10 mL% 5 TCA çözeltisi ile iki kez tekrarlayın. Süzüntüyü birleştirin ve% 5 TCA çözeltisi ile 50 mL'ye seyreltin.

2. Reaktif hazırlama

1. % 20 sodyum hidroksit çözeltisi hazırlayın: 20 g sodyum hidroksit tartın ve hacmi 100 mL'lik bir hacimsel şişeye sabitlemek için deiyonize su kullanın.
2. % 5 TCA çözeltisi hazırlayın: 25 g TCA tartın ve hacmi 500 mL hacimsel bir şişeye sabitlemek için deiyonize su kullanın.

3. TMA standart stok çözeltisi hazırlama

1. TMA standart stok çözeltisini hazırlayın: 0.0162 g TMA hidroklorür standart numunesini tartın, %5 TCA çözeltisi içinde çözün ve hacmi 100 μg/mL TMA standart stok çözeltisinin konsantrasyonuna eşit olan 100 mL'ye sabitleyin. 4 °C'de saklayın.
2. TMA standart kullanım solüsyonu hazırlayın: belirli bir hacimde TMA standart stok solüsyonu alın ve 0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL ve 10 μg/mL TMA standart solüsyonu konsantrasyonlarına kadar %5 TCA solüsyonu ile adım adım seyreltin.

4. Örnek headspace işleme

1. 20 mL'lik bir üst boşluk şişesinde 2 mL sodyum hidroksit çözeltisi ve 0,5 g katı parafini (erime noktası: 58-60 °C) doğru bir şekilde tartın (bkz.
2. Headspace şişesini yaklaşık 30 dakika boyunca 70 °C'de bir fırına koyun. Katı parafin tamamen erir.
3. Çıkarın ve parafinin katılaşması için oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Katılaşmış parafin, sodyum hidroksiti kapatacaktır.
4. Her numune ekstraksiyon çözeltisinden 2 mL alın ve parafin tabakasının üzerine koyun, kapağa bastırın ve kapatın.
5. Ölçüm için kapalı üst boşluk şişesini makineye koyun ( Malzeme Tablosuna bakın).

5. HS-GC-MS/MS analiz koşullarının ayarlanması

1. Üst boşluk koşulları ve GC-MS koşulları için Tablo 2'ye bakın.
2. İyon bilgisi için Tablo 3'e bakın.

6. Standart eğri çizimi

1. Sodalı su ve parafin sızdırmazlık tabakası içeren üst boşluk şişesini hazırlamak için 4.1-4.3 adımlarındaki üst boşluk işlemesine bakın.
2. 2 mL 0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL ve 10 μg/mL TMA standart çözeltisini 20 mL'lik bir üst boşluklu şişeye aspire edin, kapağı kapatın ve makinede ölçün.

7. Hassasiyet testi

1. Sodalı su ve parafin sızdırmazlık tabakası içeren üst boşluk şişesini hazırlamak için 4.1-4.3 adımlarındaki üst boşluk işlemesine bakın.
2. 2 mL 0.1 μg/mL TMA standart solüsyonunu 20 mL'lik bir üst boşluk şişesine aspire edin ve kapağı kapatın. Üreticinin talimatlarını izleyerek makinede altı paralel test gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).

8. Kurtarma oranı deneyi

1. Bir grup Pheretima, Periplaneta Americana ve Hirudo (S02, S05, S07; Tablo 1) geri kazanım oranı deneyi için temsili ilaçlar olarak.
2. Birkaç parti numune tozu (S02, S05, S07) alın ve bunları 50 °C'de bir fırında 72 saat boyunca TMA tespit edilmeyene kadar pişirin.
3. Pişmiş ilaç tozundaki TMA içeriğini tespit etmek için bölüm 4-6'daki numune hazırlama yöntemine bakın.
4. 1 g pişmiş toz alın (0.001 g'a kadar hassas), 50 mL'lik bir plastik santrifüj tüpüne koyun ve 50 μL TMA standart çözeltisi ekleyin.
   NOT: TMA standart çözeltisinin konsantrasyonu 100 μg/mL, 1000 μg/mL ve 10000 μg/mL'dir.
5. 20 mL% 5 TCA çözeltisi ekleyin ve 1 dakika boyunca 1000 ^rmin-1'de homojenize edin.
6. Homojenizasyondan sonra, 5 dakika boyunca 1717 x g'da santrifüjleyin, cam huniye biraz emici pamuk ekleyin ve süpernatanı 50 mL'lik bir hacimsel şişeye süzün.
7. Yukarıdaki ekstraksiyon işlemini 15 mL ve 10 mL% 5 TCA çözeltisi ile iki kez tekrarlayın; filtratı birleştirin ve% 5 TCA çözeltisi ile 50 mL'ye seyreltin.

9. Tespit (LOD) ve miktar tayini (LOQ) sınırlarının belirlenmesi

1. Sinyal-gürültü oranı (S/N) = 3 olduğunda LOD'yi karşılık gelen konsantrasyona göre belirleyin.
2. S/N = 10 olduğunda karşılık gelen konsantrasyona göre LOQ'yu belirleyin.

10. Örnek TMA içeriğinin belirlenmesi

1. Sırasıyla yaklaşık 1 g ince toz Pheretima, Periplaneta americana ve Hirudo alın, numuneyi yukarıdaki yönteme göre çıkarın ve makinede belirleyin.

Sonuçlar

Bu protokolün ön işleme prensibinin ve çalışmasının şematik diyagramları sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmektedir. TMA'nın pik süresi 2.3 dakika idi, keskin bir tepe şekli vardı ve diğer safsızlıklardan etkilenmedi (Şekil 3). 0.1-10 μg/mL TMA standart çözeltisinin doğrusal aralığı, apsis olarak TMA konsantrasyonu ve ordinat olarak tepe alanı ile standart bir eğri çizildi. Doğrusal regresyon ...

Tartışmalar

Hayvansal kaynaklı ilaçlar tüm vücuttan, organ veya dokulardan, fizyolojik veya patolojik ürünlerden, dışkılardan veya salgılardan ve hayvanların işlenmiş ürünlerinden gelir. TMA, hayvansal kaynaklı ilaçlarda önemli bir balık kokusu kaynağıdır; çok düşük koku alma eşiği (0.000032 × ^10-6 V/V) ve güçlü balık kokusu¹³ olan tipik bir kötü kokulu maddedir. Şu anda, yaygın olarak kullanılan HS-GC-MS yöntemi, hayvansal kaynaklı ilaçlarda TMA'yı stabil ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Beckman Coulter Trading (China) Co.	SSC-2-0213
Chinese herbal medicine grinder	Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory	HX-200K
Convection oven	Sanyo Electric Co., Ltd	MOV-112F
Decapper for 20 mm Aluminum caps	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	V1750004
Electronic balance	Shimadzu Corporation Japan	AUW220D
Gas chromatography mass spectrometry	Shimadzu Corporation Japan	TQ-8050 NX
Headspace Vial	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	25760200
Homogenizer	Shanghai biaomo Factory	FJ200-SH
Preassembled Cap	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	L4150050
Sample sieve	Zhenxing Sieve Factory	/
SH-Volatile Amine	Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd	227-3626-01
Sodium hydroxide	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022101401
Solid paraffin wax	Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory	20221112
Trichloroacetic acid	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022102001
Trimethylamine hydrochloride	Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd	AF22022108
Ultra-pure water system	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd	UPR-11-5T