Una tecnica migliorata per il rilevamento della trimetilammina nella medicina di derivazione animale mediante gascromatografia dello spazio di testa-spettrometria di massa a quadrupolo tandem

Riepilogo

Qui viene descritto un metodo di spettrometria di massa a quadrupolo tandem (HS-GC-MS/MS) dello spazio di testa adatto per la determinazione della trimetilammina (TMA) in medicinali di derivazione animale. Il protocollo include il pretrattamento del campione, il trattamento dello spazio di testa, le condizioni di analisi, la convalida metodologica e la determinazione della TMA nei medicinali di derivazione animale.

Abstract

I farmaci di origine animale hanno caratteristiche distintive e significativi effetti curativi, ma la maggior parte di essi ha un evidente odore di pesce, con conseguente scarsa conformità dei pazienti clinici. La trimetilammina (TMA) è uno dei componenti chiave dell'odore di pesce nella medicina di derivazione animale. È difficile identificare con precisione la TMA utilizzando il metodo di rilevamento esistente a causa dell'aumento della pressione nella fiala dello spazio di testa causato dalla rapida reazione acido-base dopo l'aggiunta di liscivia, che causa la fuoriuscita di TMA dalla fiala dello spazio di testa, bloccando il progresso della ricerca sull'odore di pesce della medicina di derivazione animale. In questo studio, abbiamo proposto un metodo di rilevamento controllato che ha introdotto uno strato di paraffina come strato di isolamento tra acido e liscivia. La velocità di produzione di TMA potrebbe essere efficacemente controllata liquefacendo lentamente lo strato di paraffina attraverso il riscaldamento termostatico del forno. Questo metodo ha mostrato linearità soddisfacente, esperimenti di precisione e recuperi con buona riproducibilità e alta sensibilità. Ha fornito supporto tecnico per la deodorizzazione della medicina di derivazione animale.

Introduzione

Il trattamento delle malattie umane utilizzando prodotti derivati da parti animali e / o loro sottoprodotti (indicati qui come medicinali di derivazione animale) sta ricevendo maggiore attenzione. Svolgono un ruolo importante nel trattamento del cancro, delle malattie cardiovascolari, della cirrosi epatica, della mastite e di altre malattie, con i vantaggi di un forte effetto, piccoli dosaggi e un'efficacia clinica significativa e specifica. Tuttavia, i farmaci di origine animale hanno generalmente un odore di pesce prominente, che influisce notevolmente sulla compliance dei pazienti e sono particolarmente sfavorevoli per i bambini ^1,2. L'odore di pesce proviene principalmente dalle proteine, dagli amminoacidi, dai grassi e da altre sostanze contenute nel medicinale, che vengono decomposti attraverso l'ossidazione degli acidi grassi, la degradazione degli amminoacidi e altri modi per produrre una varietà di sostanze con un odore di pesce ^2,3,4. Tra questi, la trimetilammina (TMA) è un gas volatile con un odore di pesce che esiste ampiamente negli alimenti di origine animale marci o marci⁵.

Fino ad ora, la gascromatografia (GC), la cromatografia liquida (LC), la cromatografia ionica, la spettrofotometria, la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) e i metodi dei sensori sono stati comunemente utilizzati per rilevare TMA nell'ambiente, negli alimenti e nelle urine 6,7,8,9. In considerazione della bassa contaminazione della colonna GC e del sistema di iniezione, nonché dell'elevata sensibilità, riproducibilità e basso limite di rivelazione (0,1-1 mg/kg), è stato preferito il metodo della gascromatografia-spettrometria di massa dello spazio di testa (HS-GC-MS) per l'analisi alimentare e biologica⁸. Al momento, solo la Cina ha stabilito uno standard nazionale per TMA negli alimenti e HS-GC-MS è il primo metodo nello standard GB5009.179-2016¹⁰. Pertanto, il suddetto metodo HS-GC-MS è stato selezionato per rilevare la TMA nella medicina di derivazione animale. Nella fase iniziale, il nostro gruppo di ricerca ha scoperto che lo standard di rilevamento HS-GC-MS per TMA negli alimenti potrebbe rilevare l'odore di pesce in diversi farmaci di origine animale. In combinazione con i risultati degli studi^11,12, è stato possibile dimostrare che la TMA è la sostanza chiave comune dell'odore di pesce nei medicinali di derivazione animale. Tuttavia, si è riscontrato che la riproducibilità dei risultati sperimentali era scarsa e c'erano problemi come la fuga di TMA e la scarsa stabilità, che non potevano essere verificati dalla metodologia. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che la liscivia è stata iniettata nella fiala dello spazio di testa e la rapida reazione acido-base ha portato ad un aumento della pressione nel flaconcino, quindi TMA è fuoriuscito dal poro di iniezione, impedendo il rilevamento stabile e accurato di TMA. Pertanto, questo studio ha proposto un metodo di rilevamento migliorato per la spettrometria di massa quadrupolare tandem dello spazio di testa (HS-GC-MS / MS) per affrontare questi problemi.

Il protocollo migliora il pretrattamento del campione separando i reagenti acido-base nel pretrattamento con l'aiuto di paraffina solida, un buon materiale a cambiamento di fase solido-liquido. Mentre la paraffina si liquefaceva lentamente con l'aumento della temperatura del forno termostatico, anche il TMA veniva rilasciato lentamente nella fiala sigillata dello spazio di testa, evitando l'aumento di pressione causato dalla violenta e rapida reazione acido-base e garantendo un rilevamento stabile e accurato del TMA. Inoltre, l'iniezione dello spazio di testa combinata con le modalità di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM) in GC-MS / MS ha efficacemente soppresso l'interferenza chimica della matrice e ha garantito l'affidabilità dei risultati. I risultati della convalida metodologica hanno dimostrato che la linearità, il test di precisione e il tasso di recupero del metodo di rilevamento migliorato potevano soddisfare i requisiti, con una buona riproducibilità e un'elevata sensibilità.

Protocollo

Vedere la Tabella 1 per informazioni sui medicinali di Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo. Sono stati identificati dal Prof. Xu Runchun, dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu, come i corpi essiccati di Pheretima aspergillum (E.Perrier), Periplaneta americana L. e Whitmania pigra Whitman.

1. Estrazione del campione

1. Schiacciare Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo con un macinino a base di erbe (vedi Tabella dei materiali), setacciare la polvere medicinale attraverso i setacci standard n. 2 (apertura del setaccio: 0,8 mm) e n. 4 (apertura del setaccio: 0,25 mm) e raccogliere la polvere tra i due setacci per ottenere la polvere campione richiesta.
   NOTA: Il Pheretima è soffice dopo la frantumazione, quindi la sua polvere non ha bisogno di essere setacciata.
2. Prelevare 1 g di polvere (con precisione 0,001 g) in una provetta da centrifuga di plastica da 50 ml, aggiungere 20 ml di soluzione di acido tricloroacetico al 5% (TCA) (vedere Tabella dei materiali) e omogeneizzare a 1.000 rmin-1 per ¹ minuto con un omogeneizzatore a dispersione ad alta velocità.
3. Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare a 1.717 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, aggiungere un po 'di cotone assorbente nell'imbuto di vetro e filtrare il surnatante in un matraccio tarato da 50 ml.
4. Ripetere il processo di estrazione di cui sopra due volte con 15 ml e 10 ml di soluzione TCA al 5%. Combinare il filtrato e diluirlo a 50 ml con una soluzione TCA al 5%.

2. Preparazione del reagente

1. Preparare una soluzione di idrossido di sodio al 20%: pesare 20 g di idrossido di sodio e utilizzare acqua deionizzata per fissare il volume in un matraccio tarato da 100 ml.
2. Preparare la soluzione di TCA al 5%: pesare 25 g di TCA e utilizzare acqua deionizzata per fissare il volume in un matraccio tarato da 500 ml.

3. Preparazione della soluzione madre standard TMA

1. Preparare la soluzione madre standard TMA: pesare 0,0162 g di campione standard di TMA cloridrato, scioglierlo in una soluzione TCA al 5% e fissare il volume a 100 ml, pari alla concentrazione di 100 μg/ml di soluzione madre standard TMA. Conservare a 4 °C.
2. Preparare la soluzione standard TMA: prelevare un certo volume di soluzione madre standard TMA e diluirla passo dopo passo con una soluzione TCA al 5% a concentrazioni di 0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL e 10 μg/mL soluzione standard TMA.

4. Elaborazione dello spazio di testa del campione

1. Pesare accuratamente 2 mL di soluzione di idrossido di sodio e 0,5 g di paraffina solida (punto di fusione: 58-60 °C) in un flaconcino da 20 mL dello spazio di testa (vedere Tabella dei materiali).
2. Introdurre il flaconcino dello spazio di testa in forno a 70 °C per circa 30 minuti. La paraffina solida si scioglie completamente.
3. Toglierlo e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente in modo che la paraffina si solidifichi. La paraffina solidificata sigillerà l'idrossido di sodio.
4. Prelevare 2 ml di ciascuna soluzione di estrazione del campione e metterla sopra lo strato di paraffina, premere il tappo e sigillare.
5. Posizionare il flaconcino sigillato dello spazio di testa sulla macchina (vedere Tabella dei materiali) per la misurazione.

5. Impostazione delle condizioni di analisi HS-GC-MS/MS

1. Vedere la Tabella 2 per le condizioni dello spazio di testa e le condizioni GC-MS.
2. Vedere la Tabella 3 per informazioni sugli ioni.

6. Disegno della curva standard

1. Fare riferimento all'elaborazione dello spazio di testa del campione nei punti 4.1-4.3 per preparare il flaconcino dello spazio di testa contenente lo strato sigillante di liscivia e paraffina.
2. Aspirare 2 mL di soluzione standard TMA da 0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL e 10 μg/mL in un flaconcino da 20 mL, sigillare il cappuccio e misurare sulla macchina.

7. Test di precisione

1. Fare riferimento all'elaborazione dello spazio di testa del campione nei punti 4.1-4.3 per preparare il flaconcino dello spazio di testa contenente la liscivia e lo strato sigillante di paraffina.
2. Aspirare 2 mL di soluzione standard TMA da 0,1 μg/mL in un flaconcino dello spazio di testa da 20 mL e sigillare il cappuccio. Eseguire sei prove parallele nella macchina seguendo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali).

8. Esperimento sul tasso di recupero

1. Prendi una partita di Pheretima, Periplaneta Americana e Hirudo (S02, S05, S07; Tabella 1) come farmaci rappresentativi per l'esperimento del tasso di recupero.
2. Prelevare diversi lotti di polvere campione (S02, S05, S07) e cuocerli in forno a 50 °C per 72 ore fino a quando non viene rilevata alcuna TMA.
3. Fare riferimento al metodo di preparazione del campione nei paragrafi 4-6 per rilevare il contenuto di TMA nella polvere del medicinale da forno.
4. Prendere 1 g di polvere cotta (con precisione 0,001 g), metterla in una provetta da centrifuga di plastica da 50 ml e aggiungere 50 μL di soluzione standard TMA.
   NOTA: La concentrazione della soluzione standard TMA è di 100 μg/mL, 1000 μg/mL e 10000 μg/mL.
5. Aggiungere 20 ml di soluzione TCA al 5% e omogeneizzare a 1000 ^{rmin-1 per 1} min.
6. Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare a 1717 x g per 5 minuti, aggiungere un po 'di cotone assorbente nell'imbuto di vetro e filtrare il surnatante in un matraccio tarato da 50 ml.
7. Ripetere il processo di estrazione di cui sopra due volte con 15 ml e 10 ml di soluzione TCA al 5%; unire il filtrato e diluirlo a 50 mL con una soluzione TCA al 5%.

9. Determinazione dei limiti di rilevazione (LOD) e quantificazione (LOQ)

1. Determinare il LOD in base alla concentrazione corrispondente quando il rapporto segnale/rumore (S/N) = 3.
2. Determinare il LOQ in base alla concentrazione corrispondente quando S/N = 10.

10. Determinazione del contenuto di TMA campione

1. Prendi circa 1 g di polvere fine di Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo , rispettivamente, estrai il campione secondo il metodo sopra e determinalo sulla macchina.

Risultati

I diagrammi schematici del principio di pre-elaborazione e del funzionamento di questo protocollo sono mostrati rispettivamente nella Figura 1 e nella Figura 2. Il tempo di picco della TMA è stato di 2,3 minuti, con una forma a picco nitida e nessuna interferenza da altre impurità (Figura 3). Misurando l'intervallo lineare della soluzione standard TMA 0,1-10 μg/mL, con concentrazione TMA come ascissa e area di picco come ordinata...

Discussione

I medicinali di origine animale provengono da tutto il corpo, organi o tessuti, prodotti fisiologici o patologici, escrezioni o secrezioni e prodotti trasformati di animali. La TMA è un'importante fonte di odore di pesce nei medicinali di derivazione animale; è una tipica sostanza maleodorante con una soglia olfattiva molto bassa (0,000032 × ^10-6 V/V) e un forte odore di pesce¹³. Allo stato attuale, il metodo HS-GC-MS comunemente usato non è in grado di rilevare la TMA nei medicinal...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Beckman Coulter Trading (China) Co.	SSC-2-0213
Chinese herbal medicine grinder	Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory	HX-200K
Convection oven	Sanyo Electric Co., Ltd	MOV-112F
Decapper for 20 mm Aluminum caps	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	V1750004
Electronic balance	Shimadzu Corporation Japan	AUW220D
Gas chromatography mass spectrometry	Shimadzu Corporation Japan	TQ-8050 NX
Headspace Vial	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	25760200
Homogenizer	Shanghai biaomo Factory	FJ200-SH
Preassembled Cap	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	L4150050
Sample sieve	Zhenxing Sieve Factory	/
SH-Volatile Amine	Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd	227-3626-01
Sodium hydroxide	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022101401
Solid paraffin wax	Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory	20221112
Trichloroacetic acid	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022102001
Trimethylamine hydrochloride	Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd	AF22022108
Ultra-pure water system	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd	UPR-11-5T