Усовершенствованный метод детектирования триметиламина в медицине животного происхождения с помощью газовой хроматографии в свободном пространстве с тандемной квадрупольной масс-спектрометрией

Резюме

В данной работе описан метод газовой хроматографии и тандемной квадрупольной масс-спектрометрии (HS-GC-MS/MS), пригодный для определения триметиламина (ТМА) в лекарственных средствах животного происхождения. Протокол включает в себя предварительную обработку образца, обработку свободного пространства, условия анализа, методологическую валидацию и определение ТМА в лекарственных средствах животного происхождения.

Аннотация

Лекарственные препараты животного происхождения обладают отличительными характеристиками и значительными лечебными эффектами, но большинство из них имеют явный рыбный запах, что приводит к плохой комплаентности клинических пациентов. Триметиламин (ТМА) является одним из ключевых компонентов рыбного запаха в медицине животного происхождения. Трудно точно идентифицировать ТМА с помощью существующего метода обнаружения из-за повышенного давления во флаконе свободного пространства, вызванного быстрой кислотно-щелочной реакцией после добавления щелочи, что приводит к выходу ТМА из флакона с свободным пространством, что замедляет прогресс в исследовании рыбного запаха лекарств животного происхождения. В этом исследовании мы предложили метод контролируемого детектирования, который вводил слой парафина в качестве изолирующего слоя между кислотой и щелочью. Скорость производства ТМА можно эффективно контролировать, медленно разжижая слой парафина с помощью термостатического нагрева печи. Этот метод показал удовлетворительную линейность, точность экспериментов и восстановление с хорошей воспроизводимостью и высокой чувствительностью. Она оказывала техническую поддержку дезодорации лекарственных средств животного происхождения.

Введение

Лечению болезней человека с использованием продуктов, полученных из частей животных и/или их побочных продуктов (здесь именуемых лекарствами животного происхождения), уделяется повышенное внимание. Они играют важную роль в лечении рака, сердечно-сосудистых заболеваний, цирроза печени, мастита и других заболеваний, обладая преимуществами сильного эффекта, небольшой дозировки и значительной и специфической клинической эффективности. Однако лекарства животного происхождения, как правило, имеют ярко выраженный рыбный запах, который сильно влияет на комплаентность пациентов и особенно неблагоприятен для детей ^1,2. Рыбный запах в основном исходит от белков, аминокислот, жиров и других веществ, содержащихся в лекарстве, которые разлагаются путем окисления жирных кислот, разложения аминокислот и другими способами с образованием различных веществ с рыбным запахом ^2,3,4. Среди них триметиламин (ТМА) представляет собой летучий газ с рыбным запахом, который широко распространен в гниющих или гнилых продуктах животного происхождения⁵.

До сих пор для обнаружения ТМА в окружающей среде, пищевых продуктах и моче широко использовались газовая хроматография (ГХ), жидкостная хроматография (ЖХ), ионная хроматография, спектрофотометрия, жидкостная хромато-масс-спектрометрия (ЖХ-МС) и сенсорные методы 6,7,8,9. Ввиду низкой загрязненности колонки ГХ и системы впрыска, а также высокой чувствительности, воспроизводимости и низкого предела обнаружения (0,1-1 мг/кг) для анализа пищевых продуктов и биологического анализа был отдан предпочтение методу газовой хромато-масс-спектрометрии в свободном пространстве (HS-GC-MS)⁸. В настоящее время только в Китае установлен национальный стандарт для ТМА в пищевых продуктах, и HS-GC-MS является первым методом в стандарте GB5009.179-2016¹⁰. Поэтому для выявления ТМА в медицине животного происхождения был выбран вышеуказанный метод HS-GC-MS. На ранней стадии наша исследовательская группа обнаружила, что стандарт обнаружения HS-GC-MS для ТМА в пищевых продуктах может обнаруживать рыбный запах в нескольких лекарствах животного происхождения. В сочетании с результатами исследований^11,12 можно доказать, что ТМА является распространенным ключевым веществом рыбного запаха в лекарствах животного происхождения. Тем не менее, было обнаружено, что воспроизводимость экспериментальных результатов была низкой, и были такие проблемы, как побег ТМА и плохая стабильность, которые не могли быть проверены методологией. Это могло быть связано с тем, что щелочь вводилась во флакон свободного пространства, и быстрая кислотно-щелочная реакция приводила к повышению давления во флаконе, таким образом, ТМА выходила из поры инъекции, препятствуя стабильному и точному обнаружению ТМА. Таким образом, в данном исследовании был предложен усовершенствованный метод обнаружения газовой хроматографии с тандемной квадрупольной масс-спектрометрией (HS-GC-MS/MS) для решения этих проблем.

Протокол улучшает предварительную обработку образца за счет разделения кислотно-щелочных реагентов в предварительной обработке с помощью твердого парафина, хорошего материала для фазового перехода твердой и жидкой фаз. По мере того, как парафин медленно разжижался с повышением температуры термостатической печи, ТМА также медленно высвобождался в герметичном флаконе, избегая повышения давления, вызванного бурной и быстрой кислотно-щелочной реакцией, и обеспечивая стабильное и точное обнаружение ТМА. Кроме того, инжекция свободного пространства в сочетании с режимами множественного мониторинга реакций (MRM) в ГХ-МС/МС эффективно подавляла матричные химические интерференции и обеспечивала достоверность результатов. Результаты методологической валидации доказали, что линейность, точность испытаний и скорость восстановления усовершенствованного метода обнаружения могут соответствовать требованиям, с хорошей воспроизводимостью и высокой чувствительностью.

протокол

В таблице 1 приведена информация о лекарственных материалах Pheretima, Periplaneta americana и Hirudo. Они были идентифицированы профессором Сюй Жуньчунем из Чэндуского университета традиционной китайской медицины как высушенные тела Pheretima aspergillum (E.Perrier), Periplaneta americana L. и Whitmania pigra Whitman.

1. Извлечение образцов

1. Измельчите Pheretima, Periplaneta americana и Hirudo с помощью травяной мельницы (см. Таблицу материалов), просейте лекарственный порошок через стандартные лекарственные сита No 2 (отверстие сита: 0,8 мм) и No 4 (отверстие сита: 0,25 мм) и соберите порошок между двумя ситами для получения требуемого образца порошка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Феретима после измельчения пушистая, поэтому ее порошок не нужно просеивать.
2. Возьмите 1 г порошка (с точностью до 0,001 г) в пластиковую центрифужную пробирку объемом 50 мл, добавьте 20 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты (ТСА) (см. таблицу материалов) и гомогенизируйте при 1000 ^rmin-1 в течение 1 мин с помощью высокоскоростного дисперсионного гомогенизатора.
3. После гомогенизации центрифугу при 1,717 x g в течение 5 мин при комнатной температуре, добавьте немного впитывающей ваты в стеклянную воронку и отфильтруйте надосадочную жидкость в мерную колбу объемом 50 мл.
4. Повторите описанный выше процесс экстракции дважды с 15 мл и 10 мл 5% раствора ТСА. Соедините фильтрат и разбавьте его до 50 мл 5% раствором ТСА.

2. Приготовление реагента

1. Приготовьте 20% раствор гидроксида натрия: взвесьте 20 г гидроксида натрия и с помощью деионизированной воды закрепите объем в мерной колбе объемом 100 мл.
2. Приготовьте 5% раствор ТСА: взвесьте 25 г ТСА и используйте деионизированную воду для фиксации объема в мерной колбе объемом 500 мл.

3. Приготовление стандартного исходного раствора ТМА

1. Приготовьте стандартный исходный раствор ТМА: взвесьте 0,0162 г стандартного образца гидрохлорида ТМА, растворите его в 5% растворе ТСА и установите объем 100 мл, равный концентрации 100 мкг/мл стандартного исходного раствора ТМА. Хранить при температуре 4 °C.
2. Приготовьте стандартный раствор ТМА: возьмите определенный объем стандартного исходного раствора ТМА и постепенно разбавьте его 5% раствором ТСА до концентраций 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 5 мкг/мл и 10 мкг/мл стандартного раствора ТМА.

4. Обработка свободного пространства образца

1. Точно взвесьте 2 мл раствора гидроксида натрия и 0,5 г твердого парафина (температура плавления: 58-60 °C) во флаконе объемом 20 мл (см. Таблицу материалов).
2. Поместите флакон в духовку при температуре 70 °C примерно на 30 минут. Твердый парафин полностью плавится.
3. Выньте его, и дайте остыть до комнатной температуры, чтобы парафин затвердел. Затвердевший парафин запечатает гидроксид натрия.
4. Возьмите 2 мл раствора для экстракции каждого образца и положите его поверх слоя парафина, прижмите крышку и запечатайте.
5. Поместите герметичный флакон свободного пространства на машину (см. Таблицу материалов) для измерения.

5. Задание условий анализа HS-GC-MS/MS

1. В таблице 2 приведены условия свободного пространства и условия ГХ-МС.
2. Информацию об ионах см. в таблице 3 .

6. Стандартный чертеж кривой

1. Обратитесь к обработке свободного пространства образца на шагах 4.1-4.3, чтобы подготовить флакон с свободным пространством, содержащий щелок и парафиновый герметизирующий слой.
2. Отсасывайте 2 мл стандартного раствора ТМА 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 5 мкг/мл и 10 мкг/мл стандартного раствора ТМА во флакон объемом 20 мл, закрывайте крышку и измеряйте на аппарате.

7. Прецизионный тест

1. Обратитесь к обработке свободного пространства образца на шагах 4.1-4.3, чтобы подготовить флакон с щелочью и парафиновым герметизирующим слоем.
2. Аспирировать 2 мл стандартного раствора ТМА 0,1 мкг/мл в флакон объемом 20 мл и запечатать крышку. Выполните шесть параллельных испытаний в машине в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).

8. Эксперимент по оценке скорости восстановления

1. Возьмите партию Pheretima, Periplaneta americana и Hirudo (S02, S05, S07; Таблица 1) в качестве репрезентативных лекарственных средств для эксперимента по скорости выздоровления.
2. Возьмите несколько партий образца порошка (S02, S05, S07) и запекайте их в духовке при температуре 50 °C в течение 72 ч до тех пор, пока не будет обнаружено ТМА.
3. Для определения содержания ТМА в запеченном медицинском порошке обратитесь к методу пробоподготовки в разделах 4-6.
4. Возьмите 1 г разрыхленного порошка (с точностью до 0,001 г), поместите его в пластиковую центрифужную пробирку объемом 50 мл и добавьте 50 мкл стандартного раствора ТМА.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация стандартного раствора ТМА составляет 100 мкг/мл, 1000 мкг/мл и 10000 мкг/мл.
5. Добавьте 20 мл 5% раствора ТСА и гомогенизируйте при 1000 ^rmin-1 в течение 1 мин.
6. После гомогенизации центрифугу при 1717 x g в течение 5 мин, добавьте немного впитывающей ваты в стеклянную воронку и отфильтруйте надосадочную жидкость в мерную колбу объемом 50 мл.
7. Повторите описанный выше процесс экстракции дважды с 15 мл и 10 мл 5% раствора ТСА; соединить фильтрат и разбавить его до 50 мл 5% раствором ТСА.

9. Определение пределов обнаружения (LOD) и количественной оценки (LOQ)

1. Определите уровень детализации по соответствующей концентрации, когда отношение сигнал/шум (S/N) = 3.
2. Определите LOQ по соответствующей концентрации, когда S/N = 10.

10. Определение содержания ТМА в образце

1. Берут около 1 г мелкодисперсного порошка Pheretima, Periplaneta americana и Hirudo соответственно, извлекают пробу по вышеописанной методике и определяют ее на машине.

Результаты

Принципиальные схемы принципа предварительной обработки и работы этого протокола приведены на рисунке 1 и рисунке 2 соответственно. Пиковое время ТМА составило 2,3 мин, с острой формой пика и отсутствием помех от других примесей (рис. 3). Пр?...

Обсуждение

Лекарственные препараты животного происхождения получают из всего организма, органов или тканей, физиологических или патологических продуктов, выделений или выделений, а также продуктов переработки животных. ТМА является важным источником рыбного запаха в лекарствах животного прои?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuge	Beckman Coulter Trading (China) Co.	SSC-2-0213
Chinese herbal medicine grinder	Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory	HX-200K
Convection oven	Sanyo Electric Co., Ltd	MOV-112F
Decapper for 20 mm Aluminum caps	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	V1750004
Electronic balance	Shimadzu Corporation Japan	AUW220D
Gas chromatography mass spectrometry	Shimadzu Corporation Japan	TQ-8050 NX
Headspace Vial	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	25760200
Homogenizer	Shanghai biaomo Factory	FJ200-SH
Preassembled Cap	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc	L4150050
Sample sieve	Zhenxing Sieve Factory	/
SH-Volatile Amine	Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd	227-3626-01
Sodium hydroxide	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022101401
Solid paraffin wax	Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory	20221112
Trichloroacetic acid	Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd	2022102001
Trimethylamine hydrochloride	Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd	AF22022108
Ultra-pure water system	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd	UPR-11-5T