JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

כאן מתוארת שיטת ספקטרומטריית מסה מרובעת של גז ראש (HS-GC-MS/MS) המתאימה לקביעת טרימתילאמין (TMA) בתרופות שמקורן מן החי. הפרוטוקול כולל טיפול מקדים לדגימה, טיפול במרחב הראש, תנאי ניתוח, תיקוף מתודולוגי וקביעת TMA בתרופות שמקורן בבעלי חיים.

Abstract

לתרופות מן החי יש מאפיינים ייחודיים והשפעות מרפא משמעותיות, אך לרובן יש ריח דגים ברור, וכתוצאה מכך היענות לקויה של חולים קליניים. טרימתילאמין (TMA) הוא אחד ממרכיבי ריח הדג העיקריים ברפואה מן החי. קשה לזהות TMA במדויק באמצעות שיטת הזיהוי הקיימת בשל הלחץ המוגבר בבקבוקון הראש הנגרם על ידי התגובה החומצית-בסיסית המהירה לאחר הוספת lye, הגורמת ל-TMA לברוח מבקבוקון headspace, מה שמעכב את התקדמות המחקר של ריח הדג של תרופות שמקורן בבעלי חיים. במחקר זה הצענו שיטת זיהוי מבוקרת שהציגה שכבת פרפין כשכבת בידוד בין חומצה לליי. קצב ייצור TMA יכול להיות נשלט ביעילות על ידי הנזלה איטית של שכבת הפרפין באמצעות חימום תנור תרמוסטטי. שיטה זו הראתה ליניאריות משביעת רצון, ניסויים מדויקים והתאוששויות עם יכולת שחזור טובה ורגישות גבוהה. היא סיפקה תמיכה טכנית לנטרול ריחות של תרופות שמקורן בבעלי חיים.

Introduction

טיפול במחלות אנושיות על ידי שימוש במוצרים שמקורם בחלקי בעלי חיים ו / או תוצרי הלוואי שלהם (המכונים כאן תרופות מן החי) זוכה לתשומת לב מוגברת. הם ממלאים תפקיד חשוב בטיפול בסרטן, מחלות לב וכלי דם, שחמת הכבד, דלקת השדים ומחלות אחרות, עם יתרונות של השפעה חזקה, מינון קטן, ויעילות קלינית משמעותית וספציפית. עם זאת, תרופות שמקורן מן החי בדרך כלל יש ריח דגים בולט, אשר משפיע מאוד על ההיענות של החולים, והם שליליים במיוחד עבור ילדים 1,2. ריח הדג מגיע בעיקר מהחלבונים, חומצות האמינו, השומנים וחומרים אחרים הכלולים בתרופה, אשר מפורקים באמצעות חמצון חומצות שומן, פירוק חומצות אמינו ודרכים אחרות לייצר מגוון חומרים בעלי ריח דגים 2,3,4. ביניהם, trimethylamine (TMA) הוא גז נדיף עם ריח דגים כי קיים נרחב מזונות נרקבים או רקובים מן החי5.

עד כה, כרומטוגרפיית גז (GC), כרומטוגרפיה נוזלית (LC), כרומטוגרפיית יונים, ספקטרופוטומטריה, ספקטרומטריית כרומטוגרפיה נוזלית-מסה (LC-MS), ושיטות חיישנים שימשו בדרך כלל לגילוי TMA בסביבה, מזון ושתן 6,7,8,9. לאור הזיהום הנמוך של עמוד ה-GC ומערכת ההזרקה, כמו גם הרגישות הגבוהה, יכולת השחזור ומגבלת הגילוי הנמוכה (0.1-1 מ"ג/ק"ג), שיטת ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה של גז Headspace (HS-GC-MS) הועדפה לניתוח מזון וביולוגי8. נכון לעכשיו, רק סין קבעה תקן לאומי עבור TMA במזון, ו- HS-GC-MS היא השיטה הראשונה בתקן GB5009.179-201610. לכן, שיטת HS-GC-MS הנ"ל נבחרה כדי לזהות TMA ברפואה שמקורה בבעלי חיים. בשלב המוקדם, קבוצת המחקר שלנו מצאה כי תקן זיהוי HS-GC-MS עבור TMA במזון יכול לזהות את ריח הדג במספר תרופות שמקורן בבעלי חיים. בשילוב עם תוצאות המחקרים11,12, ניתן להוכיח כי TMA הוא חומר המפתח הנפוץ של ריח דגים בתרופות מן החי. עם זאת, נמצא כי יכולת השחזור של תוצאות הניסוי הייתה ירודה, והיו בעיות כגון בריחת TMA ויציבות ירודה, שלא ניתן היה לאמת על ידי המתודולוגיה. זה יכול להיות בגלל העובדה שהליי הוזרק לתוך בקבוקון הראש והתגובה החומצית-בסיסית המהירה הובילה ללחץ מוגבר בבקבוקון, וכך TMA ברח מנקבובית ההזרקה, ומנע זיהוי יציב ומדויק של TMA. לכן, מחקר זה הציע שיטה משופרת לזיהוי ספקטרומטריית מסה מרובעת של גז ראש (HS-GC-MS/MS) כדי לטפל בבעיות אלה.

הפרוטוקול משפר את הטיפול המקדים לדגימה על ידי הפרדת מגיבי בסיס חומצה בטיפול המקדים בעזרת פרפין מוצק, חומר טוב לשינוי פאזה מוצק-נוזלי. כאשר הפרפין נוזל באיטיות עם עליית הטמפרטורה של הכבשן התרמוסטטי, TMA שוחרר באיטיות גם בבקבוקון הראש האטום, ובכך נמנע מעליית הלחץ הנגרמת על ידי תגובת בסיס חומצה אלימה ומהירה והבטיח זיהוי TMA יציב ומדויק. יתר על כן, הזרקת headspace בשילוב עם מצבי ניטור תגובה מרובים (MRM) ב- GC-MS/MS דיכאו ביעילות הפרעות כימיות של מטריצה והבטיחו את אמינות התוצאות. תוצאות התיקוף המתודולוגי הוכיחו כי הלינאריות, בדיקת הדיוק וקצב ההתאוששות של שיטת הזיהוי המשופרת יכולים לעמוד בדרישות, עם יכולת שחזור טובה ורגישות גבוהה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ראו טבלה 1 למידע על החומרים הרפואיים של Pheretima, Periplaneta americana ו-Hirudo. הם זוהו על ידי פרופ' שו רונצ'ון, מאוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית, כגופותיהם המיובשות של Pheretima aspergillum (E.Perrier), Periplaneta americana L. ו-Whitmania pigra Whitman.

1. מיצוי דגימות

  1. מרסקים את Pheretima, Periplaneta americana ו-Hirudo בעזרת מטחנת צמחים (ראו טבלת חומרים), מנפים את האבקה הרפואית דרך מס' 2 (צמצם מסננת: 0.8 מ"מ) ומס' 4 (צמצם מסננת: 0.25 מ"מ) מסננות תרופות סטנדרטיות, ואוספים את האבקה בין שתי המסננות כדי לקבל את אבקת הדגימה הנדרשת.
    הערה: הפרטימה רכה לאחר הריסוק, ולכן אין צורך לנפות את האבקה שלה.
  2. יש ליטול גרם אחד של אבקה (מדויק עד 0.001 גרם) בצינור צנטריפוגה מפלסטיק בנפח 50 מ"ל, להוסיף 20 מ"ל של תמיסת חומצה טריכלורואצטית (TCA) 5% (ראו טבלת חומרים) וליצור הומוגניזציה במהירות של 1,000 סל"ד-1 למשך דקה אחת עם הומוגנייזר פיזור במהירות גבוהה.
  3. לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה בגודל 1,717 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוסיפים מעט כותנה סופגת במשפך הזכוכית, ומסננים את הסופרנאטנט לצלוחית נפחית של 50 מ"ל.
  4. חזור על תהליך המיצוי לעיל פעמיים עם 15 מ"ל ו 10 מ"ל של תמיסת TCA 5%. שלב את התסנין ודלל אותו ל 50 מ"ל עם תמיסת TCA 5%.

2. הכנת מגיב

  1. הכינו תמיסת נתרן הידרוקסיד 20%: שקלו 20 גרם נתרן הידרוקסידי והשתמשו במים נטולי יונים, כדי לקבע את הנפח בצלוחית נפחית של 100 מ"ל.
  2. הכינו תמיסת TCA 5%: שקלו 25 גרם TCA והשתמשו במים נטולי יונים, כדי לקבע את הנפח בצלוחית נפחית של 500 מ"ל.

3. הכנת פתרון מלאי סטנדרטי TMA

  1. הכינו תמיסת מלאי סטנדרטית של TMA: שקלו 0.0162 גרם של דגימה סטנדרטית TMA הידרוכלוריד, המסו אותה בתמיסת TCA 5% וקיבעו את הנפח ל-100 מ"ל, שווה לריכוז של 100 מיקרוגרם/מ"ל של תמיסת מלאי סטנדרטית TMA. אחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C.
  2. הכן פתרון שימוש סטנדרטי של TMA: קח נפח מסוים של תמיסת מלאי סטנדרטית TMA ודלל אותו צעד אחר צעד עם תמיסת TCA 5% לריכוזים של 0.1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 2 מיקרוגרם/מ"ל, 5 מיקרוגרם/מ"ל ו-10 מיקרוגרם/מ"ל תמיסה סטנדרטית TMA.

4. עיבוד headspace לדוגמה

  1. שקלו במדויק 2 מ"ל תמיסת נתרן הידרוקסידי ו-0.5 גרם פרפין מוצק (נקודת התכה: 58-60 מעלות צלזיוס) בבקבוקון מרווח של 20 מ"ל (ראו טבלת חומרים).
  2. מכניסים את בקבוקון הראש לתנור ל-70 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות. הפרפין המוצק נמס לחלוטין.
  3. הוציאו אותו, ותנו לו להתקרר לטמפרטורת החדר, כך שהפרפין יתמצק. הפרפין המוצק יאטום נתרן הידרוקסידי.
  4. קח 2 מ"ל מכל תמיסת מיצוי דגימה והנח אותה על גבי שכבת הפרפין, לחץ על המכסה ואטם.
  5. הניחו את בקבוקון מרווח הראש האטום על המכשיר (ראו טבלת חומרים) לצורך מדידה.

5. הגדרת תנאי ניתוח HS-GC-MS/MS

  1. ראה טבלה 2 עבור תנאי headspace ותנאי GC-MS.
  2. ראו טבלה 3 למידע על יונים.

6. ציור עקומה סטנדרטי

  1. עיין בעיבוד headspace לדוגמה בשלבים 4.1-4.3 כדי להכין את בקבוקון headspace המכיל שכבת איטום lye ופרפין.
  2. יש לשאוף 2 מ"ל של 0.1 מיקרוגרם/מ"ל, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מיקרוגרם/מ"ל, 2 מיקרוגרם/מ"ל, 5 מיקרוגרם/מ"ל ו-10 מיקרוגרם/מ"ל תמיסה סטנדרטית TMA בנפח 20 מ"ל, לאטום את המכסה ולמדוד במכשיר.

7. בדיקת דיוק

  1. עיין בעיבוד headspace לדוגמה בשלבים 4.1-4.3 כדי להכין את בקבוקון headspace המכיל lye ואת שכבת איטום הפרפין.
  2. יש לשאוף 2 מ"ל של תמיסה סטנדרטית TMA של 0.1 מיקרוגרם/מ"ל לתוך בקבוקון מרווח ראש של 20 מ"ל ולאטום את המכסה. לבצע שש בדיקות מקבילות במכונה בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).

8. ניסוי קצב התאוששות

  1. קח קבוצה של Pheretima, Periplaneta Americana, ו Hirudo (S02, S05, S07; טבלה 1) כתרופות המייצגות לניסוי שיעור ההחלמה.
  2. קח כמה קבוצות של אבקה לדוגמה (S02, S05, S07) ואופים אותם בתנור ב 50 ° C במשך 72 שעות עד לא מזוהה TMA.
  3. עיין בשיטת הכנת הדגימה בסעיפים 4-6 כדי לזהות את תכולת TMA באבקת רפואה אפויה.
  4. קח 1 גרם של אבקה אפויה (מדויק ל 0.001 גרם), לשים אותו לתוך צינור צנטריפוגת פלסטיק 50 מ"ל, ולהוסיף 50 μL של תמיסה סטנדרטית TMA.
    הערה: הריכוז של תמיסה סטנדרטית TMA הוא 100 מיקרוגרם/מ"ל, 1000 מיקרוגרם/מ"ל ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל.
  5. הוסף 20 מ"ל של תמיסת TCA 5% והומוגניזציה ב 1000 סל"ד-1 למשך דקה אחת.
  6. לאחר הומוגניזציה, צנטריפוגה ב 1717 x גרם במשך 5 דקות, מוסיפים מעט כותנה סופגת במשפך הזכוכית ומסננים את supernatant לתוך בקבוק נפח 50 מ"ל.
  7. חזור על תהליך המיצוי לעיל פעמיים עם 15 מ"ל ו 10 מ"ל של תמיסת TCA 5%; שלב את התסנין ודלל אותו ל 50 מ"ל עם תמיסת TCA 5%.

9. קביעת גבולות הזיהוי (LOD) והכימות (LOQ)

  1. קבע את LOD לפי הריכוז המתאים כאשר יחס אות לרעש (S/N) = 3.
  2. קבע את LOQ לפי הריכוז המתאים כאשר S/N = 10.

10. קביעת תוכן TMA לדוגמה

  1. קח בערך 1 גרם של אבקה דקה של Pheretima, Periplaneta americana, ו Hirudo , בהתאמה, לחלץ את הדגימה על פי השיטה לעיל, ולקבוע אותו על המכונה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

דיאגרמות סכמטיות של עקרון העיבוד מראש והפעולה של פרוטוקול זה מוצגות באיור 1 ובאיור 2, בהתאמה. זמן השיא של TMA היה 2.3 דקות, עם צורת שיא חדה וללא הפרעות מזיהומים אחרים (איור 3). מדידת הטווח הליניארי של 0.1-10 מיקרוגרם/מ"ל תמיסה סטנדרטית TMA, עם ריכוז TMA כ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

תרופות מן החי מגיעות מכל הגוף, איברים או רקמות, מוצרים פיזיולוגיים או פתולוגיים, הפרשות או הפרשות, ומוצרים מעובדים של בעלי חיים. TMA הוא מקור חשוב לריח דגים בתרופות מן החי; זהו חומר בעל ריח רע טיפוסי עם סף ריח נמוך מאוד (0.000032 × 10-6 V/V) וריח דגים חזק13. כיום, שיטת HS-GC-MS הנפוצה אינה ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82173991), ותוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (2022YFS0442).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CentrifugeBeckman Coulter Trading (China) Co.SSC-2-0213
Chinese herbal medicine grinderZhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical FactoryHX-200K
Convection ovenSanyo Electric Co., LtdMOV-112F
Decapper for 20 mm Aluminum capsANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) IncV1750004
Electronic balanceShimadzu Corporation JapanAUW220D
Gas chromatography mass spectrometryShimadzu Corporation JapanTQ-8050 NX
Headspace VialANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc25760200
HomogenizerShanghai biaomo FactoryFJ200-SH
Preassembled CapANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) IncL4150050
Sample sieveZhenxing Sieve Factory/
SH-Volatile AmineChengdu Meimelte Technology Co., Ltd227-3626-01
Sodium hydroxideChengdu Chron Chemicals Co., Ltd2022101401
Solid paraffin waxShanghai Hualing Kangfu apparatus factory20221112
Trichloroacetic acidChengdu Chron Chemicals Co., Ltd2022102001
Trimethylamine hydrochlorideChengdu Aifa Biotechnology Co., LtdAF22022108
Ultra-pure water systemSichuan Youpu Ultrapure Technology Co., LtdUPR-11-5T

References

  1. Fan, H., et al. Material basis of stench of animal medicine: a review. China Journal of Chinese Materia Medica. 47 (20), 5452-5459 (2022).
  2. Deng, Y. J., et al. Progress on formation and taste-masking technology of stench of animal medicines. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (10), 2353-2359 (2020).
  3. Casaburi, A., Piombino, P., Nychas, G. J., Villani, F., Ercolini, D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiology. 45 (Pt A), 83-102 (2015).
  4. Rouger, A., Tresse, O., Zagorec, M. Bacterial contaminants of poultry meat: sources, species, and dynamics. Microorganisms. 5 (3), 50(2017).
  5. Baliño-Zuazo, L., Barranco, A. A novel liquid chromatography-mass spectrometric method for the simultaneous determination of trimethylamine, dimethylamine and methylamine in fishery products. Food Chemistry. 196, 1207-1214 (2016).
  6. Zhao, C., et al. Ultra-efficient trimethylamine gas sensor based on Au nanoparticles sensitized WO3 nanosheets for rapid assessment of seafood freshness. Food Chemistry. 392, 133318(2022).
  7. Bota, G. M., Harrington, P. B. Direct detection of trimethylamine in meat food products using ion mobility spectrometry. Talanta. 68 (3), 629-635 (2006).
  8. Neyer, P., Bernasconi, L., Fuchs, J. A., Allenspach, M. D., Steuer, C. Derivatization-free determination of short-chain volatile amines in human plasma and urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (2), e23062(2020).
  9. Mitsubayashi, K., et al. Trimethylamine biosensor with flavin-containing monooxygenase type 3 (FMO3) for fish-freshness analysis. Sensors & Actuators B: Chemical. 103 (1-2), 463-467 (2004).
  10. National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China. GB 5009. 179-2016. , 12(2016).
  11. Liu, X. M., et al. Study on material basis and processing principle of fishy smell of Pheretima aspergillum by electronic nose and HS-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 26 (12), 154-161 (2020).
  12. Zheng, X., Sun, F., Du, L., Huang, Y., Zhang, Z. Comparison on changes of volatile components in Gecko before and after processing by HS-SPME-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 28 (15), 145-152 (2022).
  13. Yoshiharu, I. Odor olfactory measurement. , Japan Association on Odor Environment. Tokyo. (2004).
  14. Jia, Z. W., Mao, B. P., Miao, S., Mao, X. H., Ji, S. Determination of sulfur dioxide residues in sulfur fumigated Chinese herbs with headspace gas chromatography. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (2), 277-281 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 11/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry. The Authors section was updated from:

Hui Ye1
Xuemei Liu1
Haozhou Huang2
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin3
Xiaoming Bao4
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
3TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4Shimadzu (China) Co., Ltd

to:

Hui Ye1
Xuemei Liu1
JiaBao Liao2
Haozhou Huang3
Lin Huang1
Yang Bao1
Hongyan Ma1
Junzhi Lin4
Xiaoming Bao5
Dingkun Zhang1
Runchun Xu1
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Pharmacy School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
2China Resources Sanjiu Modern Chinese Medicine Pharmaceutical Co., Ltd
3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
4TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
5Shimadzu (China) Co., Ltd

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

193Headspace

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved