Producción celular a gran escala basada en microportadores porosos solubles de grado GMP

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para lograr la fabricación a gran escala de células adherentes a través de un sistema completamente cerrado basado en microportadores solubles de grado GMP. El cultivo de células madre mesenquimales humanas, células HEK293T y células Vero se validó y cumplió tanto con las demandas de cantidad como con los criterios de calidad para la industria de la terapia celular y génica.

Resumen

Los investigadores de la industria de la terapia celular y génica (CGT) se han enfrentado durante mucho tiempo a un desafío formidable en la expansión eficiente y a gran escala de las células. Para abordar las principales deficiencias del sistema de cultivo plano bidimensional (2D), desarrollamos de manera innovadora una plataforma automatizada de producción celular a escala industrial cerrada (ACISCP) basada en un microportador poroso, soluble y de grado GMP para el cultivo 3D de células adherentes, incluidas las células madre/estroma mesenquimales humanas (hMSC), las células HEK293T y las células Vero. Para lograr una expansión a gran escala, se llevó a cabo una expansión en dos etapas con biorreactores de tanque agitado de 5 L y 15 L para producir 1,1 x 10¹⁰ hMSC con una expansión total de 128 veces en 9 días. Las células se cosecharon disolviendo completamente los microportadores, se concentraron, se lavaron y se formularon con un sistema de procesamiento celular basado en centrífugas de flujo continuo, y luego se alícuota con un sistema de llenado celular. En comparación con el cultivo plano 2D, no hay diferencias significativas en la calidad de las hMSC recolectadas del cultivo 3D. También hemos aplicado estos microportadores porosos solubles a otros tipos de células populares en el sector CGT; en concreto, se han cultivado células HEK293T y células Vero a densidades celulares máximas de 1,68 x 10 7 células/ml y 1,08 x 10⁷ células/ml, respectivamente. Este estudio proporciona un protocolo para el uso de una plataforma de ingeniería de bioprocesos que aprovecha las características de los microportadores solubles de grado GMP y equipos cerrados avanzados para lograr la fabricación a escala industrial de células adherentes.

Introducción

La industria de CGT ha sido testigo de una expansión exponencial en las últimas dos décadas. Se prevé la evolución de los medicamentos de nueva generación para tratar y curar numerosas enfermedades refractarias¹. Desde la primera aprobación por parte de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en inglés) de un producto de CGT, Kymriah, en 2017, la investigación y el desarrollo relacionados con CGT en el mundo han seguido creciendo a un ritmo rápido, y la FDA ha visto que las solicitudes activas de nuevos medicamentos en investigación para CGT aumentaron a 500 en 2018². Se había pronosticado que el número de aprobaciones de productos CGT probablemente sería de 54 a 74 en los Estados Unidos para 2030².

Si bien el rápido crecimiento de la investigación y la innovación de CGT es emocionante, todavía existe una gran brecha tecnológica entre la investigación de laboratorio y la fabricación a escala industrial que podría ofrecer estos medicamentos prometedores para llegar a tantos pacientes como sea necesario a costos asequibles. Los procesos actuales adoptados para estos ensayos clínicos se establecieron en laboratorios para experimentos a pequeña escala, y se necesitan esfuerzos significativos para mejorar e innovar en la fabricación de CGT³. Hay muchos tipos de productos CGT, la mayoría de ellos basados en células vivas, que pueden ser alogénicos, autólogos, de ingeniería o naturales. Estos fármacos vivos son mucho más complejos que las pequeñas entidades moleculares o los productos biológicos, por lo que la fabricación a gran escala supone un reto importante ^4,5,6. En este trabajo, demostramos un protocolo de producción celular a gran escala para tres células dependientes de anclaje que se aplican ampliamente en CGT. Entre ellas se encuentran las células madre/estroma mesenquimales humanas (hMSC), que se han utilizado para la terapia basada en células, y las células HEK293T y las células Vero, que se utilizan para producir virus para la ingeniería genética del producto celular terapéutico final. Las células dependientes de anclaje se cultivan comúnmente en sistemas planos, que requieren procesamiento manual. Sin embargo, los métodos de cultivo manual requieren una cantidad significativa de mano de obra y son propensos a la contaminación, lo que puede comprometer la calidad del producto final. Además, no existe un control del proceso en línea, lo que da lugar a una variabilidad sustancial de la calidad entre lotes⁷. Tomando como ejemplo la terapia con células madre, con una prometedora cartera de más de 200 candidatos a terapia con células madre, se estima que se necesitarían 300 billones de hMSC al año para satisfacer las demandas de las aplicaciones clínicas⁸. Por lo tanto, la fabricación a gran escala de células terapéuticas se ha convertido en un requisito previo para realizar estas intervenciones terapéuticas con una demanda celular tan alta⁹.

Para evitar los contratiempos de los sistemas planos, se han realizado esfuerzos en el desarrollo de procesos de fabricación a gran escala en biorreactores de tanque agitado con microportadores convencionales no solubles 10,11,12,13^, pero estos adolecen de complicados procedimientos de preparación y baja eficiencia de recolección celular ¹⁴. Recientemente, hemos innovado en un microportador soluble para la expansión de células madre, con el objetivo de eludir los desafíos de la recolección de células de microportadores comerciales convencionales no solubles¹⁵. Este novedoso microportador poroso soluble 3D soluble de grado GMP, disponible en el mercado, 3D TableTrix, ha demostrado un gran potencial para la producción de células a gran escala. De hecho, el cultivo 3D basado en estos microportadores porosos podría potencialmente recrear microambientes biomiméticos favorables para promover la adhesión, proliferación, migración y activación celular¹⁶. Las estructuras porosas y las redes de poros interconectadas de los microportadores podrían crear un área de adhesión celular más grande y promover el intercambio de oxígeno, nutrientes y metabolitos, creando así un sustrato óptimo para la expansión celular in vitro ¹⁷. La alta porosidad de estos microportadores porosos solubles en 3D de grado GMP permite la expansión a gran escala de las hMSC, y la capacidad de las células para disolverse completamente permite la recolección eficiente de estas células expandidas¹⁸. También es un producto de grado GMP y ha sido registrado como excipiente farmacéutico en el Centro Chino de Evaluación de Medicamentos (números de presentación: F20210000003 y F20200000496)¹⁹ y en la FDA de los Estados Unidos (FDA, EE. UU.; Número de Expediente Maestro de Medicamentos: 35481)²⁰.

Aquí, ilustramos un sistema automatizado de producción de células a escala industrial cerrada (ACISCP)¹⁸ utilizando estos microportadores porosos dispersables y solubles para la expansión de células hMSC, HEK293T y Vero. Logramos una exitosa expansión de dos niveles de hMSCs (expansión acumulada de 128 pliegues en 9 días) de un biorreactor de 5 L a un biorreactor de 15 L y finalmente obtuvimos hasta 1,1 x 10¹⁰ hMSCs de un solo lote de producción. Las células se cosecharon disolviendo completamente los microportadores, se concentraron, se lavaron y se formularon con un sistema de procesamiento celular basado en centrífugas de flujo continuo, y luego se alícuota con un sistema de llenado celular. Además, evaluamos la calidad de los productos hMSC para confirmar el cumplimiento. También demostramos la aplicación de estos microportadores solubles para la producción a escala de otros dos tipos de células de anclaje, las células HEK293T y las células Vero, que se aplican ampliamente en la industria CGT. La densidad celular máxima de las células HEK293T alcanzó 1,68 x 10 7 células/ml, mientras que la densidad máxima de las células Vero alcanzó 1,08 x 10⁷ células/ml. El sistema ACISCP podría adaptarse para cultivar una variedad de células adherentes, y podría convertirse en una poderosa plataforma que contribuyera a acelerar la industrialización de la CGT.

Protocolo

El cordón umbilical humano se obtuvo del Hospital Tsinghua Changgeng de Pekín. Todos los procedimientos y protocolos relativos a la adquisición, aislamiento y cultivo de células madre mesenquimales del cordón umbilical humano (UCMSC) se llevaron a cabo con consentimiento informado y con la aprobación del Comité de Ética del Hospital Tsinghua Changgeng de Beijing (número de expediente 22035-4-02), y los procedimientos y protocolos cumplieron con la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores o estándares éticos comparables.

1. Cultivo monocapa de hMSCs, células HEK293T y células Vero

1. Aislar las UCMSC humanas primarias de la jalea de Wharton de acuerdo con el método²¹ informado. Utilice un medio de cultivo de hMSC sin suero (SF) para el aislamiento y el crecimiento de las UCMSC primarias, recoja las células en el pasaje 2 y criopreserva como banco de células maestras (MCB).
2. Inocular 6 x 10⁵ UCMSC humanas (preferiblemente células de paso 2 o de paso 3) en un matraz T75 (es decir, la densidad de siembra en vasos planos 2D es de 8.000 células/cm²) para cultivo monocapa con 15 mL de medio de cultivo SF hMSC completo. Asegure una siembra uniforme mediante un movimiento en forma de ocho del matraz. Cultivo a 37 °C en incubadora de cultivo celular al 5% de CO₂ hasta una confluencia del 80%-90%.
3. Para recolectar, decantar el medio de cultivo celular y enjuagar las células con 3-5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces. A continuación, añadir 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% e incubar a 37 °C durante 1-2 min hasta que la mayoría de las células se hayan vuelto redondas y se hayan desprendido del matraz, como se observa en un microscopio invertido de campo claro con un objetivo 4x. Agregue 3 mL de medio de cultivo SF hMSC para terminar la digestión.
4. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml y centrifugue a 179 x g durante 5 min. Decantar el sobrenadante, enjuagar el gránulo celular con PBS dos veces y volver a suspender en alrededor de 3-5 ml de medio de cultivo SF hMSC para sembrar microportadores en biorreactores.
   NOTA: Verifique la viabilidad celular y asegúrese de que las células sean >90% viables. Prepare las células solo después de que se haya completado todo el trabajo de preparación de los biorreactores (pasos 2.1-3.6).
5. Para el cultivo monocapa de células HEK293T y células Vero, inocular a 2 x 10^6-3 x 10⁶ células en cada matraz T75 y cultivar con DMEM que contengan un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 10% de suero de ternero recién nacido (NBS), respectivamente.
6. Siga los pasos 1.3-1.4 para recolectar las células. Vuelva a suspender en 3-5 ml de DMEM que contenga un 10% de FBS.

2. Preparación del biorreactor de tanque agitado antes de la siembra celular

1. En el día −1, enjuague bien el recipiente de vidrio con agua desionizada (DI) una vez.
2. Desmontar todos los tubos de acero inoxidable y los impulsores de la placa principal, sumergirlos en agua desionizada y sonicar con un limpiador ultrasónico a 40 kHz y 60 °C durante 1 h para limpiar a fondo.
   NOTA: Los preparativos y procedimientos serán los mismos para la expansión de primer nivel en el biorreactor de 5 L y la expansión de segundo nivel en el biorreactor de 15 L. Los parámetros para el biorreactor de 15 L se indican entre paréntesis en todo momento. Si no se indican parámetros entre paréntesis, estos parámetros son los mismos para los biorreactores de 5 L y 15 L.
3. Verifique cuidadosamente que todas las juntas tóricas estén intactas y en su lugar, y luego vuelva a instalar las piezas desmontadas en la placa principal de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Reemplace las juntas tóricas desgastadas o rotas antes del ensamblaje si es necesario. Las juntas tóricas desgastadas comprometerán la hermeticidad y, por lo tanto, la esterilidad del recipiente.
4. Agregue 7 L (18 L para el biorreactor de 15 L) de solución de NaOH de 0,5 M en el recipiente de 5 L y coloque la placa de cabeza con los tubos ensamblados en el borde del recipiente para sumergir los tubos en la solución de NaOH. Déjelo reposar durante 12 h o toda la noche para eliminar las endotoxinas de los tubos y el recipiente de vidrio.
   NOTA: No exceda los 7 L (18 L), ya que este es el volumen máximo del recipiente de vidrio de 5 L (15 L). Use el equipo de protección personal adecuado cuando manipule la solución de NaOH, ya que es corrosiva.
5. Retire la placa frontal y decante la solución de NaOH en una botella de desecho adecuada. Deséchelo de acuerdo con las normas de seguridad del laboratorio. Enjuague bien el recipiente, la placa de cabeza y sus partes con agua desionizada libre de endotoxinas o agua inyectable para eliminar los alcalinos residuales.
6. Agregue 2 L (5 L) de PBS a la embarcación, vuelva a ensamblar todas las piezas y atornille la placa de cabecera al marco metálico de la embarcación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
7. Coloque un paquete de consumibles de sistema cerrado en las piezas/tubos/puertos de acero inoxidable (SS) apropiados en la placa frontal de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Sujete todas las abrazaderas Robert en los tubos, y se recomienda reforzar con pinzas con hemostáticos. Deje uno de los tubos, con un filtro de ventilación de aire de 0,22 μm en el extremo que está conectado al condensador, sin sujetar.
   NOTA: Deslice los tubos de silicona en las puntas de los hemostáticos para evitar perforar los tubos de silicona. Sujete solo los tubos de silicona y evite sujetar los tubos C-flex incluidos en este kit. Dejar un tubo en el condensador sin sujetar permitirá el alivio de la presión durante el autoclave.
8. Prepare 250 ml de solución de NaOH 0,1 M en un frasco de vidrio GL 45 de 500 ml esterilizable en autoclave y colóquelo con un tapón de rosca de conector multipuerto GL 45 con dos puertos. Conecte un tubo de silicona de 180 mm de largo, 0,13 pulgadas x 0,25 pulgadas (diámetro interno x diámetro exterior) en uno de los puertos de la parte inferior de la tapa; La longitud debe ser lo suficientemente larga como para tocar el fondo de la botella.
9. Conecte otro trozo de tubo de silicona, con una longitud 500 mm más larga que el anterior, al mismo puerto en la parte superior de la tapa, y conecte el otro extremo a un puerto de alimentación por goteo en la placa de cabeza del recipiente de 5 L. Conecte un filtro de ventilación de aire de 0,22 μm al otro puerto del tapón de rosca.
10. Realice una calibración de dos puntos en la sonda de pH según las instrucciones del fabricante. A continuación, inserte las sondas de pH, oxígeno disuelto (OD) y recuento de células vivas en el recipiente en los puertos PG13,5 apropiados y atorníllelas firmemente en la placa de cabeza.
11. Realice una comprobación de hermeticidad del recipiente completamente ensamblado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mantenga una presión de 0,4 bar ± 0,01 bar durante al menos 30 min. Libere lentamente la presión después de que el sistema pase la prueba. Si la prueba de hermeticidad falla, busque cuidadosamente los puntos de fuga y refuerce el conjunto del recipiente.
12. Autoclave el recipiente completamente ensamblado con el kit de consumibles a 15 psi y 121 °C durante 60 min. Después del autoclave, revise todos los filtros de ventilación de aire para asegurarse de que estén intactos y secos. Retire todos los hemostáticos.
    NOTA: Un filtro de ventilación de aire húmedo no filtrará el gas de manera eficiente y podría comprometer la esterilidad del recipiente durante el cultivo celular. Cambie los filtros de ventilación de aire si están mojados y vuelva a esterilizar todo el recipiente en autoclave.
13. Transfiera el recipiente esterilizado en autoclave a una sala limpia y espere a que se enfríe por completo a temperatura ambiente. Inserte la sonda de temperatura en el tubo del termopozo y conecte los cables para el motor, la sonda de pH y la sonda de oxígeno disuelto del controlador a las partes respectivas del recipiente. Envuelva firmemente la alfombrilla térmica alrededor del recipiente.
14. Suelte las abrazaderas Robert en los tubos flexibles del condensador de gases de escape, el rociador de anillo, el puerto de alimentación por goteo para NaOH y el puerto de recubrimiento de aire. Encienda el controlador, inicie sesión e ingrese los parámetros enumerados en la Tabla 1 en el sistema de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estos tubos no deben sujetarse en ningún momento durante el proceso de cultivo.
15. Haga clic en Inicio y asigne un nombre al experimento para iniciar el biorreactor. Deje que el biorreactor funcione con estos ajustes durante al menos 12 horas, o durante la noche, para saturar el PBS con oxígeno con el fin de realizar una calibración de un punto para la sonda de oxígeno disuelto más tarde.
16. Calibre la velocidad del volumen de manejo de líquidos de la bomba 1 y la bomba 2 en el controlador del biorreactor. Instale un tubo de silicona de 0,13 x 0,25 pulgadas en cada bomba por separado, con un extremo sumergido en una botella de agua y el otro extremo del tubo insertado en un cilindro de medición.
17. Ajuste la velocidad de rotación de la bomba a 300 rpm y el tiempo durante 1 minuto. Tenga en cuenta la cantidad de agua dispensada en el cilindro de medición para ambas bombas. Estos números serán necesarios para los pasos posteriores.
18. Prepare 500 ml de medio de cultivo SF hMSC según las instrucciones del fabricante y reemplace la tapa del frasco del medio de cultivo celular con un cierre de recipiente desechable C-Flex EZ Top y una tapa compatible. Realice el reemplazo de la tapa dentro de un gabinete de bioseguridad (BSC).
19. Suelde el tubo de salida del frasco de medio al tubo C-flex de entrada del frasco de 10 g de microportadores W01 preesterilizados para MSC. Instale una sección del tubo en la bomba 1 del controlador del biorreactor, ajuste la rotación de la bomba a 300 rpm y bombee todo el medio de cultivo de la botella a la botella de microportadores. Almacenar estos microportadores a 4 °C hasta su uso en el día 0.
    NOTA: Los microportadores deben prepararse el día −1. Para el cultivo de biorreactores de 15 L, prepare cuatro frascos (es decir, 40 g, con 4 x 500 ml de medio SF) en total.

3. Siembra, cultivo y cosecha de células en un biorreactor de tanque agitado de 5 L

1. En el día 0, realice una calibración de un punto, específicamente del 100%, para la sonda de oxígeno disuelto en el controlador del biorreactor según las instrucciones del fabricante. El biorreactor de tanque agitado ya está listo para el cultivo celular.
2. Prepare una botella de vidrio de 2 L (5 L) para la recolección de residuos, colóquela con un tapón de rosca de conector multipuerto GL 45 con dos puertos, con tubos C-Flex de 30 mm, 0,25 pulgadas x 0,44 pulgadas conectados a ambos puertos, y autoclave para esterilizar. Suelde el tubo C-flex desde uno de los puertos de la botella de residuos hasta el tubo de recolección en la placa de cabecera del recipiente del biorreactor con un soldador de tubos.
3. Detenga temporalmente el control de temperatura, pH y oxígeno disuelto en el controlador del biorreactor, instale el tubo de silicona conectado al tubo de recolección en la bomba peristáltica 2 en la dirección correcta del flujo de líquido y dispense completamente todo el PBS del recipiente a la botella de desechos. Desaloje el tubo de la bomba y selle y desconecte la botella de desecho.
   NOTA: Siempre suelte las abrazaderas Robert en los tubos flexibles involucrados en el flujo de líquido en cada paso. Sujete hacia atrás después de que se complete la transferencia de líquido antes de sellar y desconectar. Sujételo más cerca del lado de la placa principal. El desenganche y la sujeción deben realizarse para todos los pasos posteriores, a menos que se indique lo contrario.
4. Prepare 7 L (30 L) de medio SF hMSC completo y reemplace cada tapa de botella original con un cierre de envase desechable C-Flex EZ Top y una tapa compatible. Suelde un módulo de filtración de un solo uso a uno de los puertos de la bolsa de almacenamiento de un solo uso de 10 L (50 L). Realice la operación de reemplazo de las tapas dentro de un BSC.
5. Filtre y transfiera el medio de cultivo a la bolsa de almacenamiento, una botella a la vez, soldando las botellas de medio de cultivo celular al otro extremo del filtro de cápsula y usando la bomba en el controlador del biorreactor. Designe como la bolsa de alimentación.
6. Suelde un puerto de salida de la bolsa de alimentación al tubo C-flex en el tubo de alimentación de la placa de entrada e instale el tubo en la bomba 1 en el controlador del biorreactor. Suelde el otro puerto de salida de la bolsa de alimentación al tubo de purga e instale el tubo para bombear 2 en el controlador del biorreactor en la dirección correcta del flujo de líquido.
   NOTA: Instale la sección de la línea de flujo de fluido, que está hecha de tubos de silicona, en la bomba para una mejor resistencia al desgaste en comparación con los tubos C-Flex. Asegúrese de que los tubos estén instalados en la dirección correcta.
7. Ajuste la velocidad 1 de la bomba a 300 rpm y detenga la bomba después de dispensar 1 L (5 L) de medio desde la bolsa de alimentación al recipiente, según la velocidad de dispensación de volumen indicada en el paso 2.17. Vuelva a iniciar el control de temperatura, pH y oxígeno disuelto, con los mismos ajustes que se describen en el paso 2.14.
8. Selle y desconecte el tubo que conecta la bolsa de alimentación al tubo de alimentación en la placa principal. Suelde el tubo C-Flex de la botella de los microportadores dispersos preparados en el paso 2.18 al tubo de alimentación y bombee todo el contenido de la botella al recipiente. Selle y desconecte la botella vacía de la suspensión del microportador. Desinfecte toda la superficie de la botella con etanol al 75% y colóquela en un BSC para usarla como botella de transferencia de suspensión celular.
   NOTA: Deje un trozo más largo de tubo C-Flex en el lado de la placa de cabecera al sellar y desconectar los accesorios desechables, ya que se realizarán varios pasos de soldadura y desconexión en el mismo tubo en los siguientes pasos.
9. Asegúrese de que la temperatura mostrada en el controlador alcance un estado estable de 37 °C, lo que generalmente toma unos 30 minutos, antes de proceder a preparar las células semilla como en los pasos 1.3-1.4. Resuspender 2,5 x 10⁸ hMSC en 500 mL de medio SF y transferir al frasco vacío que contenía previamente la suspensión del microportador.
   NOTA: Las células semilla para la expansión del biorreactor de 15 L deben prepararse de acuerdo con el paso 3.21, con el objetivo de inocular 1,0 x 10⁹ células en 500 mL.
10. Suelde el tubo C-Flex de la botella que ahora contiene la suspensión celular al puerto de alimentación en la placa de la cabeza y bombee todo el contenido de la botella al recipiente para iniciar la inoculación celular a los microportadores. Selle y desconecte la botella vacía. Vuelva a soldar el puerto de alimentación de la bolsa de alimentación al tubo de alimentación en la placa principal.
11. Ajuste la configuración de agitación en el controlador para permitir la agitación intermitente para mejorar la eficiencia de inoculación de las hMSC configurando los siguientes parámetros: V1 = 35 (30) rpm/5 min; V2 = 0 rpm/25 min; número de ciclos = 12 (24); Velocidad de agitación final = 35 (30) rpm.
    NOTA: La velocidad de agitación puede ajustarse a 40 (35) rpm o 45 (40) rpm si se observa una distribución o sedimentación no uniforme de los microportadores durante el proceso de cultivo.
12. Configure un suplemento de medio automatizado y un régimen de intercambio en el controlador del biorreactor en la interfaz de intercambio de medios. Establezca los parámetros para el cultivo de hMSC como se indica en la Tabla 2.
    NOTA: Suelte las abrazaderas Robert de los tubos flexibles involucrados en el flujo de líquido en esta etapa, especialmente para el tubo de alimentación y purga. Manténgalos sueltos durante todo el proceso de cultivo.
13. Tome las muestras a través del tubo de muestreo conectando las bolsas de muestreo desechables a través de conectores Luer en los puntos de tiempo deseados, generalmente una vez al día, y alícuota 10 ml cada vez en la bolsa de muestreo. Alícuota 2-3 mL de muestra en la primera bolsa de muestreo, desechar y luego alícuota los 10 mL reales de muestra en una nueva bolsa de muestreo cada vez.
    NOTA: La muestra inicial de 2-3 ml podría ser líquido dejado en el tubo desde el punto de tiempo de muestreo anterior y puede no representar con precisión la condición en el recipiente. Realice siempre estos pasos con medidas asépticas adicionales desinfectando los conectores Luer antes y después de realizar o desconectar conexiones con etanol al 75%.
14. Transfiera las muestras tomadas a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml. Realice las siguientes pruebas en las muestras.
    1. Tome 200 μL de la suspensión de microportadores cargada de células y tiña con Calcein-AM/PI Cell Double Tining de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Observar bajo un microscopio de fluorescencia.
    2. Sedimentar los microportadores por gravitación, lo que suele tardar entre 5 y 10 minutos. Aspire el sobrenadante y pruebe la concentración de glucosa con un medidor de glucosa según las instrucciones del fabricante. Traza un gráfico del nivel de glucosa.
    3. Incubar los microportadores cargados de células sedimentadas con una solución de digestión recién preparada de 3-5 ml de 1 mg/ml a 37 °C durante 20-30 min para disolver completamente los microportadores. Cuente las células después de la tinción con AO/PI con un analizador de células de fluorescencia automatizado. Traza una curva de crecimiento celular. Se correlaciona con la curva de crecimiento de células vivas en tiempo real generada en el controlador.
15. En el día 4 o el día 5 de cultivo, prepare 50 ml (200 ml) de solución digestiva a 30 mg/ml. La relación de masa de trabajo entre la solución de digestión y los microportadores solubles oscila entre 3:20 y 5:20. Filtro estéril con un filtro de cápsula de 0,22 μm, y diluir además en 500 ml (2 L) de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con calcio y magnesio. Transfiera a una bolsa de almacenamiento desechable de 3 L.
    NOTA: Prepare la solución de digestión solo antes de la recolección de células. Intenta apuntar a al menos 1,0 x 10 9-1,2 x 10⁹ celdas para la expansión de primer nivel y 1,0 x^{10 10} celdas para la expansión de segundo nivel. Si las células crecen más rápido, coseche en el día 4; Si no es así, cosecha en el día 5. No se aconseja ir más allá del día 5.
16. Ajuste la velocidad de agitación a 0 en el controlador para que los microportadores se asienten, lo que generalmente ocurre dentro de los 20 minutos. Apague el protocolo automatizado de intercambio de medios y detenga el control de temperatura, pH y oxígeno disuelto en el controlador del biorreactor. Encienda manualmente la bomba 2 a 300 rpm en el controlador y dispense el sobrenadante en el régimen de alimentación para dejar aproximadamente 1 L (2 L) de suspensión de cultivo en el recipiente (utilizando la velocidad de dispensación de volumen indicada en el paso 2.17 o calibrando a partir de las marcas de graduación en el cuerpo del recipiente). Selle y desconecte totalmente la bolsa de alimentación.
17. Suelde la bolsa de solución digestiva recién preparada del paso 3.15 al tubo de alimentación y bombee todo el contenido al recipiente. Inicie la velocidad de agitación a 45 (40) rpm. Asegúrese de que el control de temperatura mantenga la temperatura a 37 °C. Los microportadores se disolverán en 40-60 minutos. Tomar 1 ml de la muestra con una jeringa Luer lock estéril a los 30 min y posteriormente cada 5-10 min para observar bajo un microscopio de campo claro para comprobar la disolución de los microportadores.
18. Una vez que los microportadores se hayan disuelto, suelde una bolsa de almacenamiento de 3 L (dos bolsas de almacenamiento de 3 L para el biorreactor de 15 L) al tubo de recolección y bombee la suspensión celular por completo usando la bomba 2 a 300 rpm. Prepare 1 L (3,5 L) de solución salina que contenga 1% de albúmina sérica humana (HSA) como tampón de lavado y 500 ml de medio SF completo (500 ml de tampón de criopreservación celular, se toma como ejemplo una formulación de 10% de dimetilsulfato (DMSO) y 90% de medio SF) en bolsas de almacenamiento desechables separadas utilizando los métodos y accesorios mencionados en los pasos anteriores para otras transferencias de líquidos.
19. Encienda el sistema de procesamiento de células, instale un kit de procesamiento de células desechables en el instrumento de acuerdo con las instrucciones del fabricante, suelde las bolsas de suspensión de células, tampón de lavado y medio SF (tampón de criopreservación) al kit de procesamiento de células desechables y siga cuidadosamente todas las instrucciones que se muestran en la interfaz de usuario para inicializar y verificar la integridad y la instalación adecuada del kit.
20. Una vez completada la instalación, introduzca los parámetros enumerados en la Tabla 3 para el lavado celular con tampón de lavado y la resuspensión en medio SF (tampón de criopreservación) en el software para iniciar el proceso de lavado y resuspensión. Todo el procedimiento se realizará automáticamente con varios puntos de control manuales.
21. Tome una muestra de las células de la cámara de centrífuga, según lo indicado por el sistema de procesamiento celular, y calcule la densidad celular con un analizador celular automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ajuste el volumen de resuspensión para una densidad de 2 x 10⁶ células/ml o un volumen total máximo de 250 ml.
22. Selle y desconecte la bolsa de transferencia de células del kit de procesamiento de células desechables después de que el sistema haya aspirado las células fuera de la cámara. Vuelva a ajustar la densidad celular a 2 x 10⁶ células/ml con medio SF completo en una bolsa de transferencia de células más grande/bolsa de almacenamiento mediana si es necesario. Estas serán las células semilla para la expansión de segundo nivel en el biorreactor de 15 L.

4. Formulación, llenado y acabado celular

1. Comience a preparar el biorreactor de 15 L 1 día antes de la recolección celular del biorreactor de 5 L. Siga los pasos de las secciones 2 y 3 del protocolo en su totalidad, excepto con los parámetros para 15 L indicados entre paréntesis.
2. Vuelva a suspender las células en 250 ml de tampón de criopreservación, y selle y desconecte la bolsa de transferencia de células del kit de procesamiento de células desechables después de que el sistema haya aspirado las células fuera de la cámara.
3. Transfiera 2.000 ml de tampón de criopreservación junto con los 250 ml de células resuspendidas del paso 4.2 a una bolsa de transferencia de células de 3 L. Suelde esta bolsa de transferencia a un kit de consumibles desechables de llenado y acabado.
   NOTA: El volumen adicional de tampón de criopreservación utilizado aquí debe determinarse mediante la especificación de la formulación y el cálculo del número total de células según los resultados del recuento obtenidos en el paso 3.21
4. Ensamble el kit de consumibles desechables de llenado y acabado en el sistema de llenado de celdas y encienda el sistema de preenfriamiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Siga las instrucciones del sistema y configúrelo para llenar 20 ml/bolsa con un total de 20 bolsas por lote. Selle y desconecte estas bolsas del kit y siga los procedimientos estándar de criopreservación. Utilice bolsas de almacenamiento criogénico.
5. Suelde un nuevo juego de 20 bolsas de criopreservación al kit de consumibles desechables de llenado y acabado y repita el procedimiento de llenado y acabado hasta que todas las celdas estén alícuotas. Siga los procedimientos estándar para criopreservar estas células.

5. Caracterización de la calidad celular

1. Muestrear las hMSCs recolectadas de los microportadores solubles, y utilizar un sistema de procesamiento celular para su caracterización por citometría de flujo para la determinación de la identidad celular siguiendo los métodos descritos en la literatura¹⁸.
2. Descongelar las células criopreservadas y replatear en matraces 2D convencionales o microplacas para una mayor caracterización de las características celulares, incluida la morfología celular y la capacidad de diferenciación de tres linajes, siguiendo los métodos descritos en la literatura¹⁸.

6. HEK293T expansión de los microportadores G02 en el biorreactor de tanque agitado

1. Prepare un biorreactor de 5 L como se mencionó en el paso 2. En el caso de las células HEK293T, cultive las células con microportadores G02 estériles en lugar de W01. El proceso de cultivo es similar al de la sección 3 del protocolo, aunque algunos parámetros son diferentes, como se detallará en los siguientes pasos. Instale un tubo de perfusión especial en el biorreactor en reemplazo del tubo de purga, ya que la perfusión es necesaria para el cultivo de células HEK293T.
2. A diferencia del protocolo detallado en la sección 3 del protocolo, prepare 20 g de microportadores G02 (es decir, dos frascos) en DMEM con un 10% de FBS para el biorreactor de 5 L, con el volumen de cultivo del día 0 establecido en 3,5 L (es decir, una concentración final de aproximadamente 5,71 g/L). Dispense 2 L de medio en el recipiente antes de los dos frascos de microportadores G02 e inocule 500 ml de 1,75 x 10^{9 HEK293T} células (es decir, a una densidad final de 5 x 10⁵ células/ml).
3. Realizar un régimen de agitación y un régimen de intercambio de medios (basado en la cantidad de medio que se requiere intercambiar por día, expresada como volumen de cultivo por día, CVD), que es diferente de la sección 3 del protocolo y se detalla en la Tabla 4.
   NOTA: Active la bomba 1 y la bomba 2 manualmente para que ambas puedan bombear continuamente para que se produzca la perfusión. Ajuste la velocidad de la bomba todos los días para cumplir con la tasa de perfusión en función de la calibración de la velocidad de dispensación de volumen de las bombas. Por lo general, esto estará en el rango de un solo dígito. Para HEK293T células, use medio fresco como alimento y deseche el medio gastado totalmente en una botella de desecho, a diferencia de las hMSC, para las cuales se hace circular el medio.
4. Para la expansión de segundo nivel al biorreactor de 15 L, utilice la transferencia de cordón a cordón de las células HEK293T en lugar de la disolución completa de los microportadores como se usa con las hMSC. Específicamente, detenga la agitación para sedimentar los microportadores después de que se alcance la densidad celular deseada y luego aspire la mayor cantidad posible de sobrenadante fuera del tubo de perfusión, alimente PBS con 3 veces el volumen de suspensión restante para lavar los microportadores y repita tres veces. Aspire y deseche la mayor cantidad posible de PBS en el lavado final.
5. Alimente 3,5 L de tripsina recombinante 1x para separar las células de los microportadores mientras los microportadores G02 permanecen intactos. Ajuste la temperatura a 37 °C y la velocidad de agitación a 60 rpm. Termine el desprendimiento dentro de los 45 minutos, cuando más del 80% de las células se hayan desprendido, con una cantidad igual de medio completo.
6. Transfiera directamente desde el puerto de cosecha a un recipiente preparado de 15 L para la expansión de segundo nivel.

7. Expansión de la célula Vero en microportadores V01 en el biorreactor de tanque agitado

1. Preparar los microportadores V01 transfiriendo los microportadores liofilizados al recipiente del biorreactor junto con PBS a una concentración de 20 mg/mL. Ensamble y esterilice el recipiente como se menciona en la sección 2 del protocolo, pero en su lugar se esteriliza en autoclave durante 30 minutos.
2. Después de la esterilización, los microportadores V01 se asientan de forma natural. Cambie el sobrenadante con DMEM básico dos veces utilizando los tubos de purga y alimentación, y agregue el DMEM completo que contiene 10% de NBS al 50%-75% del volumen del vaso antes de proceder a la sección 3 del protocolo para la inoculación y el cultivo celular.
3. A diferencia del protocolo detallado en la sección 3 del protocolo, utilice 24 g de microportadores V01 para un cultivo de 4 L de células Vero (es decir, una concentración final de 6 g/L) e inocule 500 ml de 4 x 10⁹ células Vero (es decir, a una densidad final de 1 x 10⁶ células/mL).
4. Siga los pasos 6.3-6.6 para conocer los parámetros del proceso de cultivo y el paso a la expansión de segundo nivel en el biorreactor de tanque agitado de 15 L.

Resultados

La plataforma ACISCP es un sistema completamente cerrado que emplea una serie de biorreactores de tanque agitado para la expansión a escala, un sistema de procesamiento celular para la recolección y formulación celular automatizada y un sistema de llenado celular (Figura 1). Las células adherentes se adhieren a los microportadores porosos, que pueden dispersarse en el biorreactor, logrando así el cultivo suspendido de las células adherentes.

Siguiendo el pro...

Discusión

Tanto la inmunoterapia como la terapia con células madre utilizan células vivas como fármacos; Sin embargo, sus productos finales no deben purificarse o esterilizarse de la misma manera que las moléculas pequeñas o los virus. Por lo tanto, el principio de Calidad por Diseño (QbD) siempre debe tenerse en cuenta y aplicarse en la práctica al proceso de Fabricación y Control de Productos Químicos (CMC) durante la producción de células²³. Se considera preferentemente que un sistema de culti...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.