Produção de células em larga escala com base em microtransportadores porosos solúveis de grau GMP

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para alcançar a fabricação em larga escala de células aderentes através de um sistema totalmente fechado baseado em microcarreadores dissolvidos grau GMP. O cultivo de células-tronco mesenquimais humanas, células HEK293T e células Vero foi validado e atendeu tanto às exigências de quantidade quanto aos critérios de qualidade para a indústria de terapia celular e gênica.

Resumo

Pesquisadores da indústria de terapia celular e gênica (CGT) há muito enfrentam um desafio formidável na expansão eficiente e em larga escala das células. Para resolver as deficiências primárias do sistema de cultura planar bidimensional (2D), desenvolvemos de forma inovadora uma plataforma automatizada de produção de células em escala industrial fechada (ACISCP) baseada em um microtransportador poroso, solúvel e de grau GMP para a cultura 3D de células aderentes, incluindo células-tronco mesenquimais/estromais humanas (hMSCs), células HEK293T e células Vero. Para alcançar a expansão em larga escala, uma expansão de dois estágios foi conduzida com biorreatores de tanque agitado de 5 L e 15 L para produzir 1,1 x^{10 10} hMSCs com uma expansão geral de 128 vezes em 9 dias. As células foram colhidas por dissolução completa dos microcarreadores, concentradas, lavadas e formuladas com um sistema de processamento celular baseado em centrífuga de fluxo contínuo e, em seguida, aliquotadas com um sistema de enchimento celular. Em comparação com a cultura planar 2D, não há diferenças significativas na qualidade das hMSCs colhidas da cultura 3D. Também aplicamos esses microcarreadores porosos solúveis a outros tipos de células populares no setor CGT; especificamente, células HEK293T e células Vero foram cultivadas até densidades celulares máximas de 1,68 x 10 7 células/mL e 1,08 x 10⁷ células/mL, respectivamente. Este estudo fornece um protocolo para o uso de uma plataforma de engenharia de bioprocessos que aproveita as características de microtransportadores dissolvidos de grau GMP e equipamentos fechados avançados para alcançar a fabricação em escala industrial de células aderentes.

Introdução

A indústria de CGT testemunhou uma expansão exponencial nas últimas duas décadas. Espera-se que a evolução dos medicamentos de última geração tratem e cure inúmeras doenças refratárias¹. Desde a primeira aprovação da Food and Drug Administration (FDA) de um produto CGT, Kymriah, em 2017, a pesquisa e o desenvolvimento relacionados à CGT no mundo continuaram a crescer em um ritmo rápido, com a FDA vendo os pedidos de novos medicamentos experimentais ativos para CGT aumentarem para 500 em 2018². Previa-se que o número de aprovações de produtos CGT provavelmente seria de 54-74 nos Estados Unidos até 2030².

Embora o rápido crescimento na pesquisa e inovação da CGT seja empolgante, ainda há uma grande lacuna tecnológica entre a pesquisa em laboratório e a fabricação em escala industrial que poderia fornecer esses medicamentos promissores para alcançar quantos pacientes forem necessários a custos acessíveis. Os processos atuais adotados para esses ensaios clínicos foram estabelecidos em laboratórios para experimentos em pequena escala, e esforços significativos são necessários para melhorar e inovar na fabricação de CGT³. Existem muitos tipos de produtos CGT, a maioria deles baseados em células vivas, que podem ser alogênicos, autólogos, engenheirados ou naturais. Esses fármacos vivos são muito mais complexos do que pequenas entidades moleculares ou biológicos, tornando a fabricação em larga escala um desafio significativo ^4,5,6. Neste trabalho, demonstramos um protocolo de produção celular em larga escala para três células dependentes de ancoragem que são amplamente aplicadas em TCGs. Estes incluem células-tronco mesenquimais/estromais humanas (hMSCs), que têm sido usadas para terapia baseada em células, e células HEK293T e células Vero, ambas usadas para produzir vírus para a engenharia genética do produto celular terapêutico final. Células dependentes de ancoragem são comumente cultivadas em sistemas planares, que requerem processamento manual. No entanto, os métodos de cultura manual requerem uma quantidade significativa de mão de obra e são propensos à contaminação, o que pode comprometer a qualidade do produto final. Além disso, não há controle de processo em linha, levando a uma variabilidade substancial na qualidade entre os lotes⁷. Tomando como exemplo a terapia com células-tronco, com um pipeline promissor de mais de 200 candidatos à terapia com células-tronco, estima-se que seriam necessários 300 trilhões de hMSCs por ano para atender às demandas de aplicações clínicas⁸. Assim, a fabricação em larga escala de células terapêuticas tornou-se um pré-requisito para a realização dessas intervenções terapêuticas com uma demanda celular tão^alta9.

Para evitar os contratempos dos sistemas planares, esforços têm sido feitos no desenvolvimento de processos de fabricação em larga escala em biorreatores de tanque agitado com microcarreadores convencionais não solúveis 10,11,12,13^, mas estes sofrem com procedimentos de preparação complicados e baixa eficiência de colheita de células ¹⁴. Recentemente, inovamos um microcarreador solúvel para expansão de células-tronco, com o objetivo de contornar os desafios da colheita de células de microcarreadores comerciais convencionais não solúveis¹⁵. Este novo microtransportador poroso solúvel 3D de grau GMP, disponível comercialmente, 3D TableTrix, mostrou grande potencial para a produção de células em larga escala. De fato, a cultura 3D baseada nesses microcarreadores porosos poderia potencialmente recriar microambientes biomiméticos favoráveis para promover adesão, proliferação, migração e ativação celular¹⁶. As estruturas porosas e as redes de poros interconectadas dos microcarreadores poderiam criar uma maior área de adesão celular e promover a troca de oxigênio, nutrientes e metabólitos, criando assim um substrato ótimo para a expansão celular in vitro ¹⁷. A alta porosidade desses microcarreadores porosos solúveis 3D grau GMP permite a expansão em larga escala das hMSCs, e a capacidade de as células serem totalmente dissolvidas permite a colheita eficiente dessas células expandidas¹⁸. É também um produto de grau GMP e foi registrado como excipiente farmacêutico no Centro Chinês de Avaliação de Medicamentos (números de depósito: F20210000003 e F20200000496)¹⁹ e no FDA dos Estados Unidos (FDA, EUA; Número do arquivo mestre de drogas: 35481)²⁰.

Aqui, ilustramos um sistema automatizado de produção de células em escala industrial fechada (ACISCP)¹⁸ usando esses microcarreadores porosos dispersíveis e solúveis para hMSC, célula HEK293T e expansão de células Vero. Conseguimos uma expansão bem-sucedida de duas camadas de hMSCs (expansão cumulativa de 128 vezes em 9 dias) de um biorreator de 5 L para um biorreator de 15 L e, finalmente, obtivemos até 1,1 x 10¹⁰ hMSCs de um único lote de produção. As células foram colhidas por dissolução completa dos microcarreadores, concentradas, lavadas e formuladas com um sistema de processamento de células baseado em centrífuga de fluxo contínuo e, em seguida, aliquotadas com um sistema de enchimento celular. Além disso, avaliamos a qualidade dos produtos hMSC para confirmar a conformidade. Também demonstramos a aplicação desses microcarreadores solúveis para a produção em escala de dois outros tipos de células de ancoragem, células HEK293T e células Vero, que são extensivamente aplicadas na indústria CGT. O pico de densidade celular das células HEK293T atingiu 1,68 x 10 7 células/mL, enquanto o pico de densidade das células Vero atingiu 1,08 x 10⁷ células/mL. O sistema ACISCP poderia ser adaptado para cultivar uma variedade de células aderentes, e poderia potencialmente se tornar uma plataforma poderosa contribuindo para acelerar a industrialização da CGT.

Protocolo

O cordão umbilical humano foi obtido do Hospital Beijing Tsinghua Changgeng. Todos os procedimentos e protocolos referentes à aquisição, isolamento e cultura de células-tronco mesenquimais do cordão umbilical humano (CTMSCs) foram conduzidos com consentimento informado e com a aprovação do Comitê de Ética do Beijing Tsinghua Changgeng Hospital (processo número 22035-4-02), e os procedimentos e protocolos cumpriram a declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores ou padrões éticos comparáveis.

1. Cultura monocamada de hMSCs, células HEK293T e células Vero

1. Isolar as UCMSCs humanas primárias da geleia de Wharton de acordo com o método relatado²¹. Utilizar meio de cultura hMSC sem soro (SF) para o isolamento e crescimento de UCMSCs primárias, colher as células na passagem 2 e criopreservar como banco de células mestre (MCB).
2. Inocular 6 x 10⁵ UCMSCs humanas (preferencialmente passagem 2 ou passagem 3 células) em um frasco T75 (ou seja, a densidade de semeadura em vasos planares 2D é de 8.000 células/cm²) para cultura monocamada com 15 mL de meio de cultura completo SF hMSC. Assegurar a semeadura uniforme através de um movimento de figura oito do frasco. Cultura a 37 °C em incubadora de cultura de células CO₂ a 5% para confluência de 80%-90%.
3. Para a colheita, decantar o meio de cultura celular e enxaguar as células com 3-5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes. Em seguida, adicionar 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% e incubar a 37 °C por 1-2 min até que a maioria das células se torne redonda e se desprenda do frasco, como observado em um microscópio invertido de campo claro com objetiva de 4x. Adicionar 3 mL de meio de cultura SF hMSC para finalizar a digestão.
4. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL e centrifuga a 179 x g por 5 min. Decantar o sobrenadante, enxaguar o pellet de células com PBS duas vezes e ressuspender em cerca de 3-5 mL de meio de cultura SF hMSC para semeadura em microcarreadores em biorreatores.
   NOTA: Verifique a viabilidade celular e certifique-se de que as células são >90% viáveis. Só preparar as células depois de concluído todo o trabalho de preparação dos biorreatores (passos 2.1-3.6).
5. Para a cultura em monocamada de células HEK293T e células Vero, inocular 2 x 10 6-3 x 10⁶ células em cada frasco T75 e cultura com DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e 10% de soro de bezerro recém-nascido (NBS), respectivamente.
6. Siga os passos 1.3-1.4 para colher as células. Ressuspender em 3-5 mL de DMEM contendo SFB a 10%.

2. Preparação do biorreator de tanque agitado antes da semeadura celular

1. No dia −1, lave bem o recipiente de vidro com água corrente deionizada (DI) uma vez.
2. Desmonte todos os tubos e impulsores inoxidáveis da placa de cabeça, mergulhe-os em água DI e sonice com um limpador ultrassônico a 40 kHz e 60 °C por 1 h para limpar completamente.
   NOTA: Os preparativos e procedimentos serão os mesmos para a expansão de primeiro nível no biorreator de 5 L e a expansão de segundo nível no biorreator de 15 L. Os parâmetros para o biorreator de 15 L são dados entre parênteses. Se nenhum parâmetro for indicado entre parênteses, estes parâmetros são os mesmos para os biorreatores de 5 L e 15 L.
3. Verifique cuidadosamente se todos os O-rings estão intactos e no lugar e, em seguida, instale as peças desmontadas de volta na placa de cabeça de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Substitua os O-rings desgastados ou rasgados antes da montagem, se necessário. Anéis O desgastados comprometem a estanqueidade e, consequentemente, a esterilidade do vaso.
4. Adicionar 7 L (18 L para o biorreator de 15 L) de solução de NaOH 0,5 M no recipiente de 5 L e colocar a placa de cabeça com os tubos montados na borda do vaso para imergir os tubos na solução de NaOH. Deixe repousar por 12 h ou durante a noite para remover as endotoxinas dos tubos e recipientes de vidro.
   NOTA: Não exceda 7 L (18 L), pois este é o volume máximo do recipiente de vidro de 5 L (15 L). Use equipamento de proteção individual adequado ao manusear a solução de NaOH, pois ela é corrosiva.
5. Remova a placa de cabeça e decante a solução de NaOH em um frasco de resíduos adequado. Descarte de acordo com as normas de segurança do laboratório. Enxágue bem o vaso, a placa frontal e suas partes com água DI livre de endotoxinas ou água injetável para remover a alcalina residual.
6. Adicionar 2 L (5 L) de PBS ao recipiente, remontar todas as peças e parafusar a placa de cabeça na estrutura metálica do recipiente de acordo com as instruções do fabricante.
7. Encaixe um Pacote de Consumíveis de Sistema Fechado nas peças/tubos/portas de aço inoxidável (SS) apropriados na placa de cabeça de acordo com as instruções do fabricante. Aperte todas as pinças Robert nos tubos, e o reforço com pinçamento com hemostáticos é recomendado. Deixe um dos tubos, com um filtro de ventilação de ar de 0,22 μm na extremidade que está conectado ao condensador, desapertado.
   NOTA: Coloque os tubos de silicone nas pontas dos hemostáticos para evitar perfurar os tubos de silicone. Fixe apenas os tubos de silicone e evite apertar os tubos C-flex incluídos neste kit. Deixar um tubo no condensador sem freio permitirá o alívio da pressão durante a autoclavagem.
8. Prepare 250 mL de solução de NaOH 0,1 M em um frasco de vidro autoclavável de 500 mL GL 45 e encaixe com uma tampa de rosca de conector multiportas GL 45 com duas portas. Conecte um tubo de silicone de 180 mm de comprimento, 0,13 pol x 0,25 pol (diâmetro interno x diâmetro externo) em uma das portas na parte inferior da tampa; O comprimento deve ser longo o suficiente para apenas tocar o fundo da garrafa.
9. Conecte outra peça de tubo de silicone, com um comprimento 500 mm maior que o anterior, à mesma porta no lado superior da tampa e conecte a outra extremidade a uma porta de alimentação por gotejamento na placa frontal do vaso de 5 L. Conecte um filtro de ventilação de ar de 0,22 μm à outra porta da tampa de rosca.
10. Execute uma calibração de dois pontos na sonda de pH de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, insira as sondas de pH, oxigênio dissolvido (OD) e contagem de células vivas no recipiente nas portas PG13,5 apropriadas e aperte a placa de cabeça.
11. Realizar uma verificação de estanqueidade do recipiente totalmente montado de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha uma pressão de 0,4 bar ± 0,01 bar por pelo menos 30 min. Solte lentamente a pressão depois que o sistema passar no teste. Se o teste de estanqueidade falhar, procure cuidadosamente pontos de vazamento e reforce o conjunto da embarcação.
12. Autoclave o recipiente totalmente montado com o kit consumível a 15 psi e 121 °C por 60 min. Após a autoclavagem, verifique todos os filtros de ventilação de ar para se certificar de que estão intactos e secos. Remova todos os hemostáticos.
    NOTA: Um filtro de ventilação de ar úmido não filtrará o gás de forma eficiente e pode comprometer a esterilidade do vaso durante a cultura celular. Troque os filtros de ventilação de ar se estiverem molhados e autoclave todo o vaso novamente.
13. Transfira o vaso autoclavado para uma sala limpa e espere esfriar completamente até a temperatura ambiente. Insira a sonda de temperatura no tubo do poço térmico e conecte os cabos do motor, da sonda de pH e da sonda DO do controlador às respectivas partes do recipiente. Enrole bem o tapete térmico ao redor do vaso.
14. Desaperte as abraçadeiras Robert nos tubos flexíveis do condensador de gases de escape, do sparger de anéis, da porta de alimentação por gotejamento para NaOH e da porta de sobreposição de ar. Ligue o controlador, efetue login e insira os parâmetros listados na Tabela 1 no sistema de acordo com as instruções do fabricante. Esses tubos não devem ser pinçados em nenhum momento durante o processo de cultura.
15. Clique em Iniciar e nomeie o experimento para iniciar o biorreator. Permitir que o biorreator funcione nessas configurações por pelo menos 12 h, ou durante a noite, para saturar o PBS com oxigênio, a fim de realizar uma calibração de um ponto para a sonda DO mais tarde.
16. Calibrar a velocidade do volume de manuseio de líquidos da bomba 1 e da bomba 2 no controlador do biorreator. Instale um tubo de silicone de 0,13 pol x 0,25 em cada bomba separadamente, com uma extremidade mergulhando em uma garrafa de água e a outra extremidade do tubo inserida em um cilindro de medição.
17. Ajuste a velocidade de rotação da bomba para 300 rpm e o tempo para 1 min. Observe a quantidade de água dispensada no cilindro de medição para ambas as bombas. Esses números serão necessários para as etapas subsequentes.
18. Preparar 500 mL de meio de cultura SF hMSC de acordo com as instruções do fabricante e substituir a tampa do frasco do meio de cultura celular por um fechamento descartável do recipiente C-Flex EZ Top e tampa compatível. Realizar a substituição da tampa dentro de um gabinete de biossegurança (BSC).
19. Soldar o tubo de saída no frasco de meio para o tubo de entrada C-flex no frasco de 10 g de microtransportadores W01 pré-esterilizados para MSC. Instale uma seção do tubo na bomba 1 do controlador do biorreator, ajuste a rotação da bomba para 300 rpm e bombeie todo o meio de cultura da garrafa para a garrafa de microportadores. Conservar estes microtransportadores a 4 °C até à utilização no dia 0.
    NOTA: Os microtransportadores devem ser preparados no dia −1. Para a cultura de 15 L em biorreator, preparar quatro frascos (ou seja, 40 g, com 4 x 500 mL de meio SF) no total.

3. Semeadura, cultivo e colheita de células em um biorreator de tanque agitado de 5 L

1. No dia 0, realizar uma calibração de um ponto, especificamente 100%, para a sonda DO no controlador do biorreator, de acordo com as instruções do fabricante. O biorreator de tanque agitado está pronto para a cultura celular.
2. Prepare um frasco de vidro de 2 L (5 L) para coleta de resíduos, encaixe-o com uma tampa de rosca de conector multiportas GL 45 com duas portas, com tubos C-Flex de 30 mm, 0,25 pol x 0,44 pol conectados a ambas as portas e autoclave para esterilizar. Solde o tubo C-flex de uma das portas da garrafa de resíduos para o tubo de colheita na placa de cabeça do vaso do biorreator com um soldador de tubo.
3. Pare o controle de temperatura, pH e DO no controlador do biorreator temporariamente, instale o tubo de silicone conectado ao tubo de colheita na bomba peristáltica 2 na direção correta do fluxo de líquido e distribua totalmente todo o PBS do recipiente na garrafa de resíduos. Desalojar o tubo da bomba, selar e desconectar a garrafa de resíduos.
   NOTA: Sempre desaperte quaisquer braçadeiras Robert nos tubos flexíveis envolvidos no fluxo de líquido em cada etapa. Aperte de volta depois que a transferência de líquido for concluída antes de selar e desconectar. Grampo mais próximo em direção ao lado da placa de cabeça. O despinçamento e o aperto devem ser realizados para todas as etapas subsequentes, salvo indicação em contrário.
4. Prepare 7 L (30 L) de meio SF hMSC completo e substitua cada tampa de garrafa original por um fechamento de recipiente C-Flex EZ Top descartável e tampa compatível. Solde um módulo de filtragem de uso único em uma das portas do saco de armazenamento de uso único de 10 L (50 L). Realizar a operação de substituição das tampas dentro de um BSC.
5. Filtrar e transferir o meio de cultura para o saco de armazenamento, um frasco de cada vez, soldando os frascos de meio de cultura celular para a outra extremidade do filtro da cápsula e usando a bomba no controlador do biorreator. Designe como saco de alimentação.
6. Solde uma porta de saída do saco de alimentação para o tubo C-flex no tubo de alimentação da placa de cabeça e instale o tubo para bombear 1 no controlador do biorreator. Solde a outra porta de saída do saco de alimentação para o tubo de sangria e instale o tubo para bombear 2 no controlador do biorreator na direção correta do fluxo de líquido.
   NOTA: Instale a seção na linha de fluxo de fluido, que é feita de tubos de silicone, na bomba para melhor resistência ao desgaste em comparação com os tubos C-Flex. Verifique se os tubos estão instalados na direção correta.
7. Ajuste a velocidade de 1 bomba para 300 rpm e pare a bomba depois de distribuir 1 L (5 L) de meio do saco de alimentação para o recipiente, com base na velocidade de distribuição de volume indicada no passo 2.17. Inicie o controle de temperatura, pH e DO novamente, com as mesmas configurações descritas na etapa 2.14.
8. Sele e desconecte o tubo que conecta o saco de alimentação ao tubo de alimentação na placa de cabeça. Soldar o tubo C-Flex do frasco dos microtransportadores dispersos preparados na etapa 2.18 para o tubo de alimentação e bombear todo o conteúdo do frasco para o recipiente. Sele e desconecte o frasco vazio da suspensão do microportador. Desinfete toda a superfície da garrafa com etanol 75% e coloque em um BSC para usar como um frasco de transferência de suspensão celular.
   NOTA: Deixe uma peça mais longa do tubo C-Flex no lado da placa de cabeça ao selar e desconectar os acessórios descartáveis, pois várias etapas de soldagem e desconexão serão realizadas no mesmo tubo nas etapas seguintes.
9. Certifique-se de que a temperatura mostrada no controlador atinja um estado estacionário de 37 °C, o que geralmente leva cerca de 30 minutos, antes de prosseguir a preparação das células de semente como nas etapas 1.3-1.4. Ressuspender 2,5 x 10⁸ hMSCs em 500 mL de meio SF e transferir para o frasco vazio contendo previamente a suspensão do microcarreador.
   OBS: As células de sementes para expansão do biorreator de 15 L devem ser preparadas de acordo com o passo 3.21, com o objetivo de inocular 1,0 x 10⁹ células em 500 mL.
10. Solde o tubo C-Flex do frasco que agora contém a suspensão da célula para a porta de alimentação na placa de cabeça e bombeie todo o conteúdo do frasco para o recipiente para iniciar a inoculação celular para os microtransportadores. Lacre e desconecte o frasco vazio. Solde novamente a porta de alimentação do saco de alimentação para o tubo de alimentação na placa de cabeça.
11. Ajuste as configurações de agitação no controlador para permitir agitação intermitente para aumentar a eficiência de inoculação das hMSCs, definindo os seguintes parâmetros: V1 = 35 (30) rpm/5 min; V2 = 0 rpm/25 min; número de ciclos = 12 (24); velocidade final de agitação = 35 (30) rpm.
    NOTA: A velocidade de agitação pode ser ajustada para 40 (35) rpm ou 45 (40) rpm se for observada distribuição não uniforme ou sedimentação dos microcarreadores durante o processo de cultura.
12. Configure um suplemento de meio automatizado e um regime de troca no controlador do biorreator na interface do Medium Exchange. Defina os parâmetros para o cultivo de hMSC conforme indicado na Tabela 2.
    NOTA: Desprenda quaisquer grampos Robert nos tubos flexíveis envolvidos no fluxo de líquido nesta fase, especialmente para o tubo de alimentação e sangria. Mantenha-os desembaraçados durante todo o processo de cultura.
13. Recolha as amostras através do tubo de amostragem, ligando os sacos de recolha de amostras descartáveis através de conectores Luer nos pontos de tempo desejados, geralmente uma vez por dia, e alíquotando 10 ml de cada vez no saco de amostragem. Aliquot 2-3 mL de amostra no primeiro saco de amostragem, descarte e, em seguida, alíquota os 10 mL reais de amostra em um novo saco de coleta de cada vez.
    NOTA: A amostra inicial de 2-3 ml pode ser líquida deixada no tubo a partir do ponto de tempo de amostragem anterior e pode não representar com precisão a condição no recipiente. Sempre execute essas etapas com medidas assépticas extras, higienizando os conectores Luer antes e depois de fazer ou quebrar conexões com etanol 75%.
14. Transfira as amostras colhidas para um tubo centrífugo cônico de 15 mL. Execute os seguintes testes nas amostras.
    1. Tome 200 μL da suspensão de microtransportador carregada de células e core com Calcein-AM/PI Cell Double Staining de acordo com as instruções do fabricante. Observe sob um microscópio de fluorescência.
    2. Sedimentar os microcarreadores por gravitação, que geralmente leva 5-10 min. Aspirar o sobrenadante e testar a concentração de glicose com um medidor de glicose de acordo com as instruções do fabricante. Plote um gráfico de nível de glicose.
    3. Incubar os microcarreadores carregados de células sedimentadas com 3-5 mL recém-preparados de 1 mg/mL de solução digestiva a 37 °C por 20-30 min para dissolver completamente os microcarreadores. Conte as células após a coloração com AO/PI com um analisador automatizado de células de fluorescência. Traçar uma curva de crescimento celular. Correlacione-se com a curva de crescimento de células vivas em tempo real gerada no controlador.
15. No dia 4 ou no dia 5 de cultura, preparar 50 mL (200 mL) de solução digestiva a 30 mg/mL. A relação de massa de trabalho entre a solução digestiva e os microcarreadores solúveis varia de 3:20 a 5:20. Filtro estéril com filtro de cápsulas de 0,22 μm e diluir em 500 mL (2 L) de solução salina balanceada de Hank (HBSS) com cálcio e magnésio. Transfira para um saco de armazenamento descartável de 3 L.
    NOTA: Prepare apenas a solução digestiva imediatamente antes da colheita celular. Tente apontar para pelo menos 1,0 x 10 9-1,2 x 10⁹ células para a expansão de primeiro nível e 1,0 x^{10 10} células para a expansão de segunda camada. Se as células crescerem mais rápido, colher no dia 4; caso contrário, colher no dia 5. Não é aconselhável ir além do dia 5.
16. Defina a velocidade de agitação para 0 no controlador para que os microtransportadores se acomodem, o que geralmente acontece dentro de 20 min. Desligue o protocolo automatizado de troca de meio e pare o controle de temperatura, pH e DO no controlador do biorreator. Iniciar manualmente a bomba 2 a 300 rpm no controlador e distribuir o sobrenadante no regime de alimentação para deixar cerca de 1 L (2 L) de suspensão de cultura no recipiente (utilizando a velocidade de distribuição de volume indicada no passo 2.17 ou a aferição a partir das marcas de graduação no corpo do recipiente). Sele e desconecte totalmente o saco de alimentação.
17. Soldar o saco de solução digestiva recém-preparada do ponto 3.15 ao tubo de alimentação e bombear todo o conteúdo para o recipiente. Inicie a velocidade de agitação a 45 (40) rpm. Certifique-se de que o controle de temperatura ainda mantém a temperatura em 37 °C. Microcarriers irá dissolver-se dentro de 40-60 min. Tomar 1 mL da amostra com uma seringa Luer lock estéril em 30 min e, posteriormente, a cada 5-10 min para observar sob um microscópio de campo claro para verificar a dissolução dos microcarreadores.
18. Depois que os microtransportadores tiverem se dissolvido, solde um saco de armazenamento de 3 L (dois sacos de armazenamento de 3 L para o biorreator de 15 L) ao tubo de colheita e bombeie completamente a suspensão da célula usando a bomba 2 a 300 rpm. Preparar 1 L (3,5 L) de solução salina contendo 1% de albumina de soro humano (HSA) como tampão de lavagem e 500 mL de meio SF completo (500 mL de tampão de criopreservação celular, uma formulação de 10% de sulfato de dimetilo (DMSO) e meio SF 90% é tomado como exemplo) em sacos de armazenamento descartáveis separados usando os métodos e acessórios mencionados nas etapas anteriores para outras transferências de líquidos.
19. Ligue o sistema de processamento de células, instale um Kit de Processamento de Células Descartáveis no instrumento de acordo com as instruções do fabricante, solde os sacos de suspensão celular, tampão de lavagem e meio SF (tampão de criopreservação) no Kit de Processamento de Células Descartáveis e siga cuidadosamente todas as instruções exibidas na interface do usuário para inicializar e verificar a integridade e a instalação adequada do kit.
20. Uma vez concluída a instalação, insira os parâmetros listados na Tabela 3 para lavagem das células com tampão de lavagem e ressuspensão em meio SF (tampão de criopreservação) no software para iniciar o processo de lavagem e ressuspensão. Todo o procedimento será realizado automaticamente com vários pontos de verificação manual.
21. Pegue uma amostra das células da câmara de centrifugação, conforme indicado pelo sistema de processamento de células, e calcule a densidade celular com um analisador de células automatizado de acordo com as instruções do fabricante. Ajustar o volume de ressuspensão para uma densidade de 2 x 10⁶ células/mL ou um volume total máximo de 250 mL.
22. Sele e desconecte o saco de transferência de células do Kit de Processamento de Células Descartáveis depois que o sistema aspirar as células para fora da câmara. Reajuste a densidade celular para 2 x 10⁶ células/mL com meio SF completo em uma bolsa de transferência celular maior/bolsa de armazenamento média, se necessário. Estas serão as células de semente para a expansão de segundo nível no biorreator de 15 L.

4. Formulação, enchimento e acabamento da célula

1. Iniciar a preparação do biorreator de 15 L 1 dia antes da colheita celular do biorreator de 5 L. Siga os passos nas seções 2 e 3 do protocolo completamente, exceto com os parâmetros para 15 L indicados entre parênteses.
2. Ressuspender as células em 250 mL de tampão de criopreservação e selar e desconectar a bolsa de transferência celular do Kit de Processamento de Células Descartáveis após o sistema ter aspirado as células para fora da câmara.
3. Transferir 2.000 mL de tampão de criopreservação juntamente com os 250 mL de células ressuspensas da etapa 4.2 para uma bolsa de transferência celular de 3 L. Solde este saco de transferência a um Kit de Consumíveis Descartável de Enchimento e Acabamento.
   NOTA: O volume adicional de tampão de criopreservação utilizado aqui deve ser determinado pela especificação da formulação e pelo cálculo do número total de células de acordo com os resultados de contagem obtidos na etapa 3.21
4. Monte o Kit de Consumíveis Descartáveis de Enchimento e Acabamento no sistema de enchimento da célula e ligue o sistema de pré-resfriamento de acordo com as instruções do fabricante. Siga as instruções do sistema e defina para encher 20 mL/saco com um total de 20 sacos por lote. Lacre e desconecte esses sacos do kit e siga os procedimentos padrão de criopreservação. Use sacos de crioarmazenamento.
5. Solde um novo conjunto de 20 sacos de criopreservação ao Kit de Consumíveis Descartáveis de Enchimento e Acabamento e repita o procedimento de enchimento e acabamento até que todas as células sejam aliquotadas. Siga os procedimentos padrão para criopreservar essas células.

5. Caracterização da qualidade celular

1. Coletar amostras das hMSCs colhidas dos microcarreadores solúveis e utilizar um sistema de processamento celular para caracterização por citometria de fluxo para a determinação da identidade celular seguindo os métodos descritos na literatura¹⁸.
2. Descongelar as células criopreservadas e repor em frascos 2D convencionais ou microplacas para posterior caracterização das características celulares, incluindo a morfologia celular e capacidade de diferenciação de trilinhagens, seguindo métodos descritos na literatura¹⁸.

6. HEK293T expansão em microcarreadores G02 no biorreator de tanque agitado

1. Prepare um biorreator de 5 L conforme mencionado na etapa 2. Para HEK293T células, cultivar as células com microcarreadores G02 estéreis em vez de W01. O processo de cultura é semelhante ao da seção 3 do protocolo, embora alguns parâmetros sejam diferentes, como será detalhado nas etapas a seguir. Instale um tubo de perfusão especial no biorreator em substituição ao tubo de sangria, pois a perfusão é necessária para o cultivo de células HEK293T.
2. Diferente do protocolo detalhado na seção 3 do protocolo, preparar 20 g de microcarreadores G02 (ou seja, dois frascos) em DMEM com FBS a 10% para o biorreator de 5 L, com o volume de cultura dia 0 fixado em 3,5 L (ou seja, uma concentração final de cerca de 5,71 g/L). Distribuir 2 L de meio no recipiente antes dos dois frascos de microcarreadores G02 e inocular 500 mL de células de 1,75 x 10⁹ HEK293T (ou seja, a uma densidade final de 5 x 10⁵ células/mL).
3. Realizar um regime de agitação e regime de troca média (baseado na quantidade de meio a ser trocada por dia, expressa em volume de cultura por dia, DCV), que é diferente do protocolo seção 3 e está detalhado na Tabela 4.
   NOTA: Ative a bomba 1 e a bomba 2 manualmente para que ambas possam bombear continuamente para que a perfusão ocorra. Ajuste a velocidade da bomba todos os dias para atender à taxa de perfusão com base na calibração da velocidade de dosagem de volume das bombas. Normalmente, isso estará na faixa de um dígito. Para HEK293T células, use meio fresco como ração e descarte o meio gasto totalmente em uma garrafa de lixo, ao contrário das hMSCs, para as quais o meio circula.
4. Para a expansão de segundo nível para o biorreator de 15 L, use a transferência de esferas das células HEK293T em vez da dissolução completa dos microcarreadores como usado com hMSCs. Especificamente, pare a agitação para sedimentar os microcarreadores depois que a densidade celular desejada for atingida e, em seguida, aspirar o sobrenadante possível para fora do tubo de perfusão, alimentar o PBS com 3 vezes o volume de suspensão restante para lavar os microcarreadores e repetir três vezes. Aspirar e descartar o máximo de PBS possível na lavagem final.
5. Alimentar 3,5 L de tripsina recombinante 1x para separar as células dos microcarreadores enquanto os microcarreadores G02 permanecem intactos. Ajuste a temperatura para 37 °C e a velocidade de agitação para 60 rpm. Terminar o descolamento dentro de 45 min, quando mais de 80% das células tiverem se destacado, com igual quantidade de meio completo.
6. Transferência diretamente do porto de colheita para um navio preparado de 15 L para expansão de segundo nível.

7. Expansão da célula Vero em microcarreadores V01 no biorreator de tanque agitado

1. Preparar microcarreadores V01 transferindo os microcarreadores liofilizados para o vaso do biorreator juntamente com PBS para uma concentração de 20 mg/mL. Montar e esterilizar o vaso conforme mencionado na seção 2 do protocolo, mas em autoclave por 30 min.
2. Após a esterilização, os microtransportadores V01 se acomodam naturalmente. Trocar o sobrenadante com DMEM básico duas vezes usando os tubos de sangria e alimentação, e adicionar o DMEM completo contendo 10% NBS a 50%-75% do volume do vaso antes de prosseguir para a seção 3 do protocolo para inoculação e cultura celular.
3. Diferente do protocolo detalhado na seção 3 do protocolo, utilizar 24 g de microcarreadores V01 para uma cultura de 4 L de células Vero (ou seja, uma concentração final de 6 g/L) e inocular 500 mL de 4 x 10⁹ células Vero (ou seja, em uma densidade final de 1 x 10⁶ células/mL).
4. Siga as etapas 6.3-6.6 para os parâmetros do processo de cultura e passagem para expansão de segundo nível no biorreator de tanque agitado de 15 L.

Resultados

A plataforma ACISCP é um sistema totalmente fechado que emprega uma série de biorreatores de tanque agitado para expansão em escala, um sistema de processamento de células para colheita e formulação automatizada de células e um sistema de enchimento de células (Figura 1). As células aderentes ligam-se aos microcarreadores porosos, que podem ser dispersos no biorreator, conseguindo, assim, o cultivo em suspensão das células aderentes.

Seguindo o protocol...

Discussão

Tanto a imunoterapia quanto a terapia com células-tronco utilizam células vivas como drogas; No entanto, seus produtos finais não devem ser purificados ou esterilizados da mesma forma que pequenas moléculas ou vírus. Portanto, o princípio do Quality by Design (QbD) deve ser sempre lembrado e aplicado na prática ao processo de Fabricação e Controle Químico (CMC) durante a produção de células²³. Um sistema de cultura de células totalmente fechado, bem como um sistema de processamento e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.