GMP Sınıfı Çözünebilir Gözenekli Mikro Taşıyıcılara Dayalı Büyük Ölçekli Hücre Üretimi

Özet

Burada, GMP sınıfı çözünebilir mikro taşıyıcılara dayanan tamamen kapalı bir sistem aracılığıyla yapışık hücrelerin büyük ölçekli üretimini gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan mezenkimal kök hücrelerinin, HEK293T hücrelerinin ve Vero hücrelerinin yetiştirilmesi doğrulandı ve hücre ve gen terapisi endüstrisi için hem miktar taleplerini hem de kalite kriterlerini karşıladı.

Özet

Hücre ve gen terapisi (CGT) endüstrisindeki araştırmacılar, hücrelerin verimli ve büyük ölçekli genişlemesinde uzun süredir zorlu bir zorlukla karşı karşıya kaldılar. İki boyutlu (2D) düzlemsel kültür sisteminin birincil eksikliklerini gidermek için, insan mezenkimal kök/stromal hücreler (hMSC'ler), HEK293T hücreleri ve Vero hücreleri dahil olmak üzere yapışık hücrelerin 3D kültürü için GMP dereceli, çözünebilir ve gözenekli bir mikro taşıyıcıya dayalı otomatik bir kapalı endüstriyel ölçekli hücre üretimi (ACISCP) platformu geliştirdik. Büyük ölçekli genişleme elde etmek için, 9 gün içinde toplam 128 kat genişleme ile 1,1 x 10 10 hMSC elde etmek için 5 L ve¹⁵ L karıştırılmış tank biyoreaktörleri ile iki aşamalı bir genişleme gerçekleştirildi. Hücreler, mikro taşıyıcıların tamamen çözülmesiyle toplandı, konsantre edildi, yıkandı ve sürekli akışlı santrifüj tabanlı bir hücre işleme sistemi ile formüle edildi ve daha sonra bir hücre doldurma sistemi ile birleştirildi. 2D düzlemsel kültürle karşılaştırıldığında, 3D kültürden hasat edilen hMSC'lerin kalitesinde önemli bir fark yoktur. Bu çözünebilir gözenekli mikro taşıyıcıları CGT sektöründeki diğer popüler hücre tiplerine de uyguladık; spesifik olarak, HEK293T hücreleri ve Vero hücreleri, sırasıyla 1.68 x 10 7 hücre / mL ve 1.08 x 10⁷ hücre / mL'lik pik hücre yoğunluklarına kadar ekilmiştir. Bu çalışma, yapışık hücrelerin endüstriyel ölçekte üretimini sağlamak için GMP sınıfı çözünebilir mikro taşıyıcıların ve gelişmiş kapalı ekipmanın özelliklerinden yararlanan bir biyoproses mühendisliği platformunun kullanılması için bir protokol sağlar.

Giriş

CGT endüstrisi son yirmi yılda üstel bir genişlemeye tanık oldu. Yeni nesil ilaçların evriminin çok sayıda refrakter hastalığı tedavi etmesi ve iyileştirmesi bekleniyor¹. 2017 yılında bir CGT ürünü olan Kymriah'ın ilk Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onayından bu yana, FDA'nın CGT için aktif araştırma amaçlı yeni ilaç başvurularının 2018'de 500'e yükseldiğini görmesiyle, dünyada CGT ile ilgili araştırma ve geliştirme hızlı bir şekilde büyümeye devam etti². CGT ürünlerinin onay sayısının 2030 yılına kadar Amerika Birleşik Devletleri'nde muhtemelen 54-74 olacağı tahmin edilmişti².

CGT araştırma ve inovasyonundaki hızlı büyüme heyecan verici olsa da, laboratuvar araştırmaları ile endüstriyel ölçekli üretim arasında, bu umut verici ilaçları uygun maliyetlerle ihtiyaç duyulduğu kadar hastaya ulaştırabilecek büyük bir teknolojik boşluk var. Bu klinik deneyler için benimsenen mevcut süreçler, küçük ölçekli deneyler için laboratuvarlarda oluşturulmuştur ve CGT üretimini geliştirmek ve yenilik yapmak için önemli çabalara ihtiyaç vardır³. Çoğu allojenik, otolog, mühendislik ürünü veya doğal olabilen canlı hücrelere dayanan birçok CGT ürünü türü vardır. Bu canlı ilaçlar, küçük moleküler varlıklardan veya biyolojiklerden çok daha karmaşıktır, bu nedenle büyük ölçekli üretimi önemli bir zorluk haline getirir ^4,5,6. Bu çalışmada, CGT'lerde yaygın olarak uygulanan üç ankraj bağımlı hücre için büyük ölçekli bir hücre üretim protokolü gösteriyoruz. Bunlar, hücre bazlı tedavi için kullanılan insan mezenkimal kök / stromal hücrelerini (hMSC'ler) ve her ikisi de nihai terapötik hücre ürününün genetik mühendisliği için virüs üretmek için kullanılan HEK293T hücreleri ve Vero hücrelerini içerir. Ankraja bağımlı hücreler genellikle manuel işleme gerektiren düzlemsel sistemlerde kültürlenir. Bununla birlikte, manuel kültür yöntemleri önemli miktarda işçilik gerektirir ve son ürünün kalitesini tehlikeye atabilecek kontaminasyona eğilimlidir. Ayrıca, hat içi proses kontrolü yoktur, bu da partiler arasında kalitede önemli değişkenliklere yol açar⁷. Örnek olarak kök hücre tedavisini ele alırsak, 200'den fazla kök hücre tedavisi adayından oluşan umut verici bir boru hattı ile, klinik uygulamaların taleplerini karşılamak için yılda 300 trilyon hMSC'ye ihtiyaç duyulacağı tahmin edilmektedir⁸. Bu nedenle, terapötik hücrelerin büyük ölçekli üretimi, bu terapötik müdahaleleri bu kadar yüksek hücre talebiyle gerçekleştirmek için bir ön koşul haline gelmiştir⁹.

Düzlemsel sistemlerin aksaklıklarını önlemek için, geleneksel çözünmeyen mikro taşıyıcılara^{sahip karıştırılmış} tank biyoreaktörlerinde büyük ölçekli üretim süreçlerinin geliştirilmesine yönelik çabalar sarf edilmiştir 10,11,12,13^, ancak bunlar karmaşık hazırlama prosedürlerinden ve düşük hücre toplama verimliliğinden muzdariptir ¹⁴. Son zamanlarda, kök hücre genişlemesi için çözünebilir bir mikro taşıyıcı geliştirdik ve geleneksel çözünmeyen ticari mikro taşıyıcılardan hücre toplamanın zorluklarını aşmayı amaçladık¹⁵. Bu yeni, ticari olarak temin edilebilen GMP sınıfı 3D çözünebilir gözenekli mikro taşıyıcı, 3D TableTrix, büyük ölçekli hücre üretimi için büyük bir potansiyel göstermiştir. Gerçekten de, bu gözenekli mikro taşıyıcılara dayanan 3D kültür, hücre yapışmasını, çoğalmasını, göçünü ve aktivasyonunu teşvik etmek için potansiyel olarak uygun biyomimetik mikro ortamları yeniden yaratabilir¹⁶. Mikro taşıyıcıların gözenekli yapıları ve birbirine bağlı gözenek ağları, daha büyük bir hücre yapışma alanı oluşturabilir ve oksijen, besin ve metabolitlerin değişimini teşvik edebilir, böylece in vitro hücre genişlemesi için optimal bir substrat oluşturabilir¹⁷. Bu GMP sınıfı 3D çözünebilir gözenekli mikro taşıyıcıların yüksek gözenekliliği, hMSC'lerin büyük ölçekli genişlemesini sağlar ve hücrelerin tamamen çözünme yeteneği, bu genişlemiş hücrelerin verimli bir şekilde toplanmasına izin verir¹⁸. Aynı zamanda GMP sınıfı bir üründür ve Çin İlaç Değerlendirme Merkezi (dosyalama numaraları: F20210000003 ve F20200000496)¹⁹ ve Amerika Birleşik Devletleri FDA'sı (FDA, ABD; İlaç Ana Dosya numarası: 35481)²⁰.

Burada, hMSC, HEK293T hücresi ve Vero hücre genişlemesi için bu dağılabilir ve çözünebilir gözenekli mikro taşıyıcıları kullanan otomatik bir kapalı endüstriyel ölçekli hücre üretimi (ACISCP) sistemini¹⁸ gösteriyoruz. 5 L'lik bir biyoreaktörden 15 L'lik bir biyoreaktöre hMSC'lerin başarılı bir şekilde iki katmanlı genişlemesini (9 günde 128 kümülatif kat genişlemesi) elde ettik ve son olarak tek bir üretim partisinden 1,1 x 10¹⁰ hMSC'ye kadar elde ettik. Hücreler, mikro taşıyıcıların tamamen çözülmesiyle hasat edildi, konsantre edildi, yıkandı ve sürekli akış santrifüj tabanlı hücre işleme sistemi ile formüle edildi ve daha sonra bir hücre doldurma sistemi ile aliquote edildi. Ayrıca, uygunluğu doğrulamak için hMSC ürünlerinin kalitesini değerlendirdik. Ayrıca, CGT endüstrisinde yaygın olarak uygulanan diğer iki ankraj hücresi türü olan HEK293T hücreleri ve Vero hücrelerinin ölçeklendirilmiş üretimi için bu çözünebilir mikro taşıyıcıların uygulanmasını da gösterdik. HEK293T hücrelerinin pik hücre yoğunluğu 1.68 x 10 7 hücre/mL'ye ulaşırken, Vero hücrelerinin pik yoğunluğu 1.08 x 10⁷ hücre/mL'ye ulaştı. ACISCP sistemi, çeşitli yapışık hücrelerin kültürüne uyarlanabilir ve potansiyel olarak CGT'nin sanayileşmesini hızlandırmaya katkıda bulunan güçlü bir platform haline gelebilir.

Protokol

İnsan göbek kordonu Pekin Tsinghua Changgeng Hastanesi'nden alındı. İnsan göbek kordonu mezenkimal kök hücrelerinin (UCMSC'ler) edinimi, izolasyonu ve kültürü ile ilgili tüm prosedürler ve protokoller, bilgilendirilmiş onam ve Pekin Tsinghua Changgeng Hastanesi Etik Komitesi'nin (dosya numarası 22035-4-02) onayı ile yürütülmüştür ve prosedürler ve protokoller 1964 Helsinki deklarasyonu ve daha sonraki değişiklikleri veya karşılaştırılabilir etik standartlara uygundur.

1. hMSC'lerin, HEK293T hücrelerinin ve Vero hücrelerinin tek katmanlı kültürü

1. Birincil insan UCMSC'lerini Wharton'un jölesinden bildirilen yönteme göre izole edin²¹. Birincil UCMSC'lerin izolasyonu ve büyümesi için serumsuz (SF) hMSC kültür ortamı kullanın, hücreleri geçiş 2'de hasat edin ve bir ana hücre bankası (MCB) olarak kriyoprezervasyon yapın.
2. 6 x 10⁵ insan UCMSC'sini (tercihen pasaj 2 veya pasaj 3 hücre) bir T75 şişesine (yani, 2D düzlemsel kaplardaki tohumlama yoğunluğu 8.000 hücre /^cm2'dir) 15 mL tam SF hMSC kültür ortamı ile tek katmanlı kültür için aşılayın. Şişenin sekiz rakamlı hareketi ile düzgün tohumlama sağlayın. %5 CO₂ hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de% 80 -% 90 birleşmeye kadar kültür.
3. Hasat etmek için hücre kültürü ortamını boşaltın ve hücreleri iki kez 3-5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın. Daha sonra, 2 mL% 0.25 Tripsin-EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 1-2 dakika inkübe edin, çoğu hücre yuvarlak hale gelene ve şişeden ayrılana kadar, 4x objektifli parlak alan ters çevrilmiş mikroskop altında gözlemlendiği gibi. Sindirimi sonlandırmak için 3 mL SF hMSC kültür ortamı ekleyin.
4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 179 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın, hücre peletini PBS ile iki kez durulayın ve biyoreaktörlerdeki mikro taşıyıcılara tohumlama için yaklaşık 3-5 mL SF hMSC kültür ortamında yeniden süspanse edin.
   NOT: Hücre canlılığını kontrol edin ve hücrelerin %>90 canlı olduğundan emin olun. Hücreleri ancak biyoreaktörler için tüm hazırlık çalışmaları tamamlandıktan sonra hazırlayın (adım 2.1-3.6).
5. HEK293T hücrelerinin ve Vero hücrelerinin tek katmanlı kültürü için, her bir T75 şişesine 2 x 10 6-3 x^{10 6} hücrede aşılayın ve sırasıyla% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 10 yenidoğan buzağı serumu (NBS) içeren DMEM ile kültürleyin.
6. Hücreleri toplamak için 1.3-1.4 adımlarını izleyin. % 10 FBS içeren 3-5 mL DMEM'de yeniden süspansiyon yapın.

2. Hücre tohumlamadan önce karıştırılmış tank biyoreaktörünün hazırlanması

1. -1. günde, cam kabı bir kez akan deiyonize (DI) su ile iyice durulayın.
2. Tüm paslanmaz boruları ve pervaneleri başlık plakasından sökün, DI suya daldırın ve iyice temizlemek için 40 kHz ve 60 °C'de 1 saat ultrasonik temizleyici ile sonikasyon yapın.
   NOT: Hazırlıklar ve prosedürler, 5 L biyoreaktördeki birinci kademe genişletme ve 15 L biyoreaktördeki ikinci kademe genişletme için aynı olacaktır. 15 L biyoreaktör için parametreler baştan sona parantez içinde verilmiştir. Parantez içinde herhangi bir parametre verilmemişse, bu parametreler 5 L ve 15 L biyoreaktörler için aynıdır.
3. Tüm O-ringlerin sağlam ve yerinde olduğunu dikkatlice kontrol edin ve ardından sökülen parçaları üreticinin talimatlarına göre tekrar başlık plakasına takın.
   NOT: Gerekirse montajdan önce aşınmış veya yırtılmış O-ringleri değiştirin. Aşınmış O-ringler, hava sızdırmazlığını ve dolayısıyla kabın sterilitesini tehlikeye atacaktır.
4. 5 L'lik kaba 7 L (15 L biyoreaktör için 18 L) 0,5 M NaOH çözeltisi ekleyin ve tüpleri NaOH çözeltisine daldırmak için kabın kenarına monte edilmiş tüplerin bulunduğu başlık plakasını yerleştirin. Endotoksinleri tüplerden ve cam kaptan çıkarmak için 12 saat veya gece boyunca bekletin.
   NOT: 7 L'yi (18 L) aşmayın çünkü bu, 5 L (15 L) cam kabın maksimum hacmidir. Aşındırıcı olduğu için NaOH solüsyonunu kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
5. Başlığı çıkarın ve NaOH çözeltisini uygun bir atık şişesine boşaltın. Laboratuvar güvenlik yönetmeliklerine göre atın. Kalan alkalini gidermek için kabı, başlık plakasını ve parçalarını endotoksin içermeyen DI su veya enjeksiyon için su ile iyice durulayın.
6. Tekneye 2 L (5 L) PBS ekleyin, tüm parçaları yeniden monte edin ve başlık plakasını üreticinin talimatlarına göre kabın metal çerçevesine cıvatalayın.
7. Kapalı Sistem Sarf Malzemesi Paketini, üreticinin talimatlarına göre başlık plakasındaki uygun paslanmaz çelik (SS) parçalara/borulara/bağlantı noktalarına takın. Tüplerdeki tüm Robert klemplerini kelepçeleyin ve kanama durdurucularla klempleyerek takviye edilmesi önerilir. Kondansatöre bağlı ucunda 0,22 μm havalandırma filtresi bulunan tüplerden birini kelepçesiz bırakın.
   NOT: Silikon tüplerin delinmesini önlemek için silikon tüpleri uçların üzerine hemostatların üzerine kaydırın. Clamp sadece silikon tüplere ve bu kitte bulunan C-flex tüpleri sıkıştırmaktan kaçının. Kondansatördeki bir tüpün kelepçesiz bırakılması, otoklavlama sırasında basıncın tahliye edilmesini sağlayacaktır.
8. Otoklavlanabilir 500 mL GL 45 cam şişede 250 mL 0,1 M NaOH çözeltisi hazırlayın ve iki portlu bir GL 45 Çok Konektör Vidalı Kapak ile takın. Kapağın alt tarafındaki bağlantı noktalarından birine 180 mm uzunluğunda, 0.13 inç x 0.25 inç (iç çap x dış çap) silikon tüp bağlayın; Uzunluk, şişenin dibine değecek kadar uzun olmalıdır.
9. Bir öncekinden 500 mm daha uzun olan başka bir silikon tüp parçasını kapağın üst tarafındaki aynı bağlantı noktasına bağlayın ve diğer ucunu 5 L'lik kap kafa plakasındaki bir damlama besleme portuna bağlayın. Vidalı kapaktaki diğer bağlantı noktasına 0.22 μm'lik bir havalandırma filtresi bağlayın.
10. Üreticinin talimatlarına göre pH probu üzerinde iki noktalı kalibrasyon gerçekleştirin. Ardından, pH, çözünmüş oksijen (DO) ve canlı hücre sayımı problarını uygun PG13,5 portlarındaki kaba yerleştirin ve başlık plakasına sıkıca vidalayın.
11. Tamamen monte edilmiş kabın hava geçirmezliğini üreticinin talimatlarına göre kontrol edin. En az 30 dakika boyunca 0,4 bar ± 0,01 bar basıncı koruyun. Sistem testi geçtikten sonra basıncı yavaşça boşaltın. Hava geçirmezlik testi başarısız olursa, sızıntı noktalarını dikkatlice arayın ve kap tertibatını güçlendirin.
12. Tamamen monte edilmiş kabı sarf malzemesi kiti ile 15 psi ve 121 °C'de 60 dakika boyunca otoklavlayın. Otoklavlamanın ardından, sağlam ve kuru olduklarından emin olmak için tüm havalandırma filtrelerini kontrol edin. Tüm kanama durdurucuları çıkarın.
    NOT: Islak hava tahliye filtresi, gazı verimli bir şekilde filtrelemez ve hücre kültürü sırasında kabın sterilitesini tehlikeye atabilir. Havalandırma filtrelerini ıslaksa değiştirin ve tüm kabı tekrar otoklavlayın.
13. Otoklavlanmış kabı temiz bir odaya aktarın ve tamamen oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Sıcaklık probunu termovel tüpüne yerleştirin ve kontrolörden motor, pH probu ve çözünmüş oksijen probu kablolarını kap üzerindeki ilgili parçalara bağlayın. Isı matını kabın etrafına sıkıca sarın.
14. Robert kelepçelerini egzoz gazı kondansatörü, halka püskürtücü, NaOH için damla besleme portu ve hava kaplama portu üzerindeki esnek borulardaki kelepçeleri açın. Denetleyiciyi açın, oturum açın ve Tablo 1'de listelenen parametreleri üreticinin talimatlarına göre sisteme girin. Bu tüpler kültür işlemi sırasında hiçbir zaman klemplenmemelidir.
15. Başlat'a tıklayın ve biyoreaktörü başlatmak için deneyi adlandırın. Daha sonra çözünmüş oksijen probu için tek noktalı kalibrasyon gerçekleştirmek üzere PBS'yi oksijenle doyurmak için biyoreaktörün bu ayarlarda en az 12 saat veya gece boyunca çalışmasına izin verin.
16. Biyoreaktör kontrolöründe pompa 1 ve pompa 2'nin sıvı işleme hacim hızını kalibre edin. Her pompaya ayrı ayrı 0,13 inç x 0,25 inç silikon tüp takın, bir ucu bir şişe suya daldırılır ve tüpün diğer ucu bir ölçüm silindirine yerleştirilir.
17. Pompa dönüş hızını 300 rpm'ye ve süreyi 1 dakikaya ayarlayın. Her iki pompa için ölçüm silindirine dağıtılan su miktarını not edin. Sonraki adımlar için bu numaralara ihtiyaç duyulacaktır.
18. Üreticinin talimatlarına göre 500 mL SF hMSC kültür ortamı hazırlayın ve hücre kültürü ortamı şişesinin kapağını tek kullanımlık bir C-Flex EZ Top kap kapağı ve uyumlu kapakla değiştirin. Kapak değişimini bir biyogüvenlik kabini (BSC) içinde gerçekleştirin.
19. Orta şişedeki çıkış borusunu, MSC için 10 g önceden sterilize edilmiş W01 mikro taşıyıcı şişesindeki giriş C-flex tüpüne kaynaklayın. Tüpün bir bölümünü biyoreaktör kontrolörünün 1. pompasına takın, pompa dönüşünü 300 rpm'ye ayarlayın ve şişedeki tüm kültür ortamını mikro taşıyıcı şişesine pompalayın. Bu mikro taşıyıcıları 4. günde kullanılana kadar 0 °C'de saklayın.
    NOT: Mikro taşıyıcılar -1. günde hazırlanmalıdır. 15 L biyoreaktör kültürü için toplamda dört şişe (yani 40 g, 4 x 500 mL SF ortamı ile) hazırlayın.

3. 5 L'lik karıştırılmış tanklı biyoreaktörde hücre tohumlama, kültür ve hasat

1. 0. günde, üreticinin talimatlarına göre biyoreaktör kontrolöründeki çözünmüş oksijen probu için tek noktalı, özellikle %100 kalibrasyon gerçekleştirin. Karıştırılmış tank biyoreaktörü artık hücre kültürü için hazırdır.
2. Atık toplama için 2 L'lik (5 L) bir cam şişe hazırlayın, her iki porta bağlı 30 mm, 0,25 inç x 0,44 inç C-Flex tüplere sahip iki portlu GL 45 Çok Portlu Konnektör Vidalı Kapak ve sterilize etmek için otoklav ile takın. C-flex tüpünü, atık şişesindeki portlardan birinden biyoreaktör kabının başlık plakasındaki hasat tüpüne bir boru kaynak makinesi ile kaynaklayın.
3. Biyoreaktör kontrolöründeki sıcaklık, pH ve çözünmüş oksijen kontrolünü geçici olarak durdurun, hasat tüpüne bağlı silikon tüpü peristaltik pompa 2'ye doğru sıvı akış yönünde takın ve kaptan tüm PBS'yi atık şişesine tamamen dağıtın. Boruyu pompadan çıkarın ve atık şişesini kapatın ve bağlantısını kesin.
   NOT: Her adımda sıvı akışında yer alan esnek borulardaki Robert kelepçelerini her zaman açın. Sızdırmaz hale getirmeden ve bağlantıyı kesmeden önce sıvı transferi tamamlandıktan sonra kelepçeleyin. cl cl tarafına doğru yaklaşın. Aksi belirtilmedikçe, sonraki tüm adımlar için kelepçenin açılması ve sıkıştırılması yapılmalıdır.
4. 7 L (30 L) tam SF hMSC ortamı hazırlayın ve her orijinal şişe kapağını tek kullanımlık bir C-Flex EZ Top kap kapağı ve uyumlu kapakla değiştirin. Tek Kullanımlık Filtreleme Modülünü 10 L (50 L) Tek Kullanımlık Saklama Torbası üzerindeki bağlantı noktalarından birine kaynaklayın. Bir BSC'nin içindeki kapakları değiştirme işlemini gerçekleştirin.
5. Hücre kültürü ortamının şişelerini kapsül filtresinin diğer ucuna kaynaklayarak ve biyoreaktör kontrolöründeki pompayı kullanarak kültür ortamını her seferinde bir şişe olmak üzere saklama torbasına süzün ve aktarın. Yem torbası olarak belirleyin.
6. Besleme torbasından bir çıkış portunu başlık plakasının besleme borusundaki C-flex tüpüne kaynaklayın ve tüpü biyoreaktör kontrolöründeki pompa 1'e takın. Besleme torbasından gelen diğer çıkış portunu boşaltma borusuna kaynaklayın ve boruyu biyoreaktör kontrolöründeki pompa 2'ye doğru sıvı akışı yönünde takın.
   NOT: C-Flex tüplere kıyasla aşınma ve yıpranmaya karşı daha iyi direnç için silikon borudan yapılmış sıvı akış hattındaki bölümü pompaya takın. Tüplerin doğru yönde takıldığından emin olun.
7. Pompayı 1 hızını 300 rpm'ye ayarlayın ve adım 2.17'de belirtilen hacim dağıtım hızına bağlı olarak besleme torbasından kaba 1 L (5 L) ortam dağıttıktan sonra pompayı durdurun. Sıcaklık, pH ve çözünmüş oksijen kontrolünü, adım 2.14'te açıklanan ayarlarla yeniden başlatın.
8. Besleme torbasını başlık plakasındaki besleme borusuna bağlayan boruyu kapatın ve ayırın. C-Flex tüpünü, adım 2.18'de hazırlanan dağınık mikro taşıyıcıların şişesinden besleme tüpüne kaynaklayın ve şişedeki tüm içeriği kaba pompalayın. Boş mikro taşıyıcı süspansiyon şişesini kapatın ve bağlantısını kesin. Şişenin tüm yüzeyini %75 etanol ile dezenfekte edin ve hücre süspansiyonu transfer şişesi olarak kullanmak üzere bir BSC'ye yerleştirin.
   NOT: Aşağıdaki adımlarda aynı boru üzerinde birden fazla kaynak ve ayırma adımı gerçekleştirileceğinden, tek kullanımlık aksesuarları kapatırken ve bağlantısını keserken başlık plakası tarafında daha uzun bir C-Flex tüp parçası bırakın.
9. Tohum hücrelerini 1.3-1.4 adımlarında olduğu gibi hazırlamaya devam etmeden önce, kontrolörde gösterilen sıcaklığın genellikle yaklaşık 30 dakika süren 37 °C'lik sabit bir duruma ulaştığından emin olun. 500 mL SF ortamında 2,5 x 10⁸ hMSC'yi yeniden süspanse edin ve daha önce mikro taşıyıcı süspansiyonunu içeren boş şişeye aktarın.
   NOT: 15 L biyoreaktör genleşmesi için tohum hücreleri, 500 mL'de 1.0 x 10⁹ hücreyi aşılamak amacıyla adım 3.21'e göre hazırlanmalıdır.
10. C-Flex tüpünü, şimdi hücre süspansiyonunu içeren şişeden başlık plakasındaki besleme portuna kaynaklayın ve mikro taşıyıcılara hücre aşılamasını başlatmak için şişedeki tüm içeriği kaba pompalayın. Boş şişeyi kapatın ve bağlantısını kesin. Besleme portunu besleme torbasından başlık plakasındaki besleme borusuna yeniden kaynaklayın.
11. Aşağıdaki parametreleri ayarlayarak hMSC'lerin gelişmiş aşılama verimliliği için aralıklı çalkalaya izin vermek için kontrolördeki çalkalama ayarlarını yapın: V1 = 35 (30) rpm/5 dak; V2 = 0 dev/dak/25 dk; döngü sayısı = 12 (24); Son çalkalama hızı = 35 (30) rpm.
    NOT: Kültür işlemi sırasında mikro taşıyıcıların düzgün olmayan dağılımı veya çökelmesi gözlenirse, çalkalama hızı 40 (35) rpm veya 45 (40) rpm'ye ayarlanabilir.
12. Medium Exchange arayüzündeki biyoreaktör kontrolöründe otomatik bir ortam takviyesi ve değişim rejimi ayarlayın. hMSC ekimi için parametreleri Tablo 2'de belirtildiği gibi ayarlayın.
    NOT: Bu aşamada, özellikle besleme ve boşaltma borusu için, sıvı akışında yer alan esnek borulardaki Robert kelepçelerini açın. Bunları tüm kültür süreci boyunca kelepçesiz tutun.
13. Tek kullanımlık numune alma torbalarını Luer konektörleri aracılığıyla istenen zaman noktalarında, genellikle günde bir kez bağlayarak ve numune alma torbasına her seferinde 10 mL ekleyerek numuneleri numune alma tüpünden alın. 2-3 mL numuneyi ilk numune alma torbasına alın, atın ve ardından gerçek 10 mL numuneyi her seferinde yeni bir numune alma torbasına alın.
    NOT: İlk 2-3 mL numune, önceki numune alma zaman noktasından tüpte kalan sıvı olabilir ve kaptaki durumu doğru bir şekilde temsil etmeyebilir. Bu adımları her zaman %75 etanol ile bağlantı yapmadan veya kestikten önce ve sonra Luer konektörlerini sterilize ederek ekstra aseptik önlemlerle gerçekleştirin.
14. Alınan numuneleri 15 mL'lik konik santrifüj tüpüne aktarın. Numuneler üzerinde aşağıdaki testleri gerçekleştirin.
    1. 200 μL hücre yüklü mikro taşıyıcı süspansiyonu alın ve üreticinin talimatlarına göre Calcein-/PI Hücre Çift Boyama ile boyayın. Floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
    2. Mikro taşıyıcıları, genellikle 5-10 dakika süren yerçekimi ile çökeltin. Süpernatanı aspire edin ve üreticinin talimatlarına göre glikoz konsantrasyonunu bir glikoz ölçer ile test edin. Bir glikoz seviyesi grafiği çizin.
    3. Çökeltilmiş hücre yüklü mikro taşıyıcıları, mikro taşıyıcıları tamamen çözmek için taze hazırlanmış 3-5 mL 1 mg / mL sindirim solüsyonu ile 37 ° C'de 20-30 dakika inkübe edin. Otomatik bir floresan hücre analizörü ile AO / PI ile boyamadan sonra hücreleri sayın. Bir hücre büyüme eğrisi çizin. Kontrolörde oluşturulan gerçek zamanlı canlı hücre büyüme eğrisi ile ilişkilendirin.
15. Kültürün 4. gününde veya 5. gününde, 30 mg / mL'de 50 mL (200 mL) sindirim çözeltisi hazırlayın. Sindirim çözeltisi ile çözünebilir mikro taşıyıcılar arasındaki çalışma kütlesi oranı 3:20 ila 5:20 arasında değişir. 0.22 μm'lik bir kapsül filtre ile steril filtre uygulayın ve ayrıca 500 mL (2 L) Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) kalsiyum ve magnezyum ile seyreltin. 3 L'lik tek kullanımlık saklama torbasına aktarın.
    NOT: Sindirim solüsyonunu yalnızca hücre hasadından hemen önce hazırlayın. Birinci katman genişletme için en az 1,0 x 10 9-1,2 x 10⁹ hücre ve ikinci katman genişletme için 1,0 x 10¹⁰ hücre hedeflemeye çalışın. Hücreler daha hızlı büyürse, 4. günde hasat edin; Değilse, 5. günde hasat edin. 5. günden sonra gidilmesi tavsiye edilmez.
16. Mikro taşıyıcıların yerleşmesi için kontrolörde çalkalama hızını 0'a ayarlayın, bu genellikle 20 dakika içinde gerçekleşir. Otomatik ortam değişim protokolünü kapatın ve biyoreaktör kontrolöründeki sıcaklık, pH ve DO kontrolünü durdurun. Pompa 2'yi kontrolörde 300 rpm'de manuel olarak çalıştırın ve kapta yaklaşık 1 L (2 L) kültür süspansiyonu bırakmak için süpernatanı besleme rejimine dağıtın (adım 2.17'de belirtilen hacim dağıtım hızını kullanarak veya teknenin gövdesindeki mezuniyet işaretlerinden ölçerek). Besleme torbasını kapatın ve tamamen ayırın.
17. Taze hazırlanmış sindirim solüsyonu torbasını adım 3.15'ten besleme borusuna kaynaklayın ve tüm içeriği kaba pompalayın. Çalkalama hızını 45 (40) rpm'de başlatın. Sıcaklık kontrolünün sıcaklığı hala 37 °C'de tuttuğundan emin olun. Mikro taşıyıcılar 40-60 dakika içinde çözülür. Mikrotaşıyıcıların çözünmesini kontrol etmek için parlak alan mikroskobu altında gözlemlemek için 30 dakikada bir steril bir Luer kilit şırıngası ile numunenin 1 mL'sini alın ve daha sonra her 5-10 dakikada bir.
18. Mikro taşıyıcılar çözüldükten sonra, bir adet 3 L'lik saklama torbasını (15 L'lik biyoreaktör için iki adet 3 L'lik saklama torbası) hasat borusuna kaynaklayın ve 300 rpm'de pompa 2'yi kullanarak hücre süspansiyonunu tamamen dışarı pompalayın. Yıkama tamponu olarak %1 insan serum albümini (HSA) içeren 1 L (3.5 L) salin ve 500 mL tam SF ortamı (500 mL hücre kriyoprezervasyon tamponu, %10 dimetil sülfat formülasyonu (DMSO) ve %90 SF ortamı örnek olarak alınır) diğer sıvı transferleri için önceki adımlarda belirtilen yöntemleri ve aksesuarları kullanarak ayrı tek kullanımlık saklama torbalarında.
19. Hücre işleme sistemini açın, üreticinin talimatlarına göre cihaza bir Tek Kullanımlık Hücre İşleme Kiti takın, hücre süspansiyonu, yıkama tamponu ve SF ortamı (kriyoprezervasyon tamponu) torbalarını Tek Kullanımlık Hücre İşleme Kitine kaynaklayın ve kitin bütünlüğünü ve doğru kurulumunu başlatmak ve kontrol etmek için kullanıcı arayüzünde görüntülenen tüm talimatları dikkatlice izleyin.
20. Kurulum tamamlandıktan sonra, yıkama ve yeniden süspansiyon işlemini başlatmak için yıkama tamponu ile hücre yıkama ve SF ortamında (kriyoprezervasyon tamponu) yeniden süspansiyon için Tablo 3'te listelenen parametreleri yazılıma girin. Tüm prosedür, birkaç manuel kontrol noktası ile otomatik olarak gerçekleştirilecektir.
21. Hücre işleme sistemi tarafından belirtildiği gibi santrifüj odasından hücrelerin bir örneğini alın ve üreticinin talimatlarına göre otomatik bir hücre analizörü ile hücre yoğunluğunu hesaplayın. Yeniden süspansiyon hacmini 2 x 10⁶ hücre/mL yoğunluk veya maksimum toplam hacim 250 mL olacak şekilde ayarlayın.
22. Sistem, hücreleri hazneden dışarı aspire ettikten sonra hücre transfer torbasını Tek Kullanımlık Hücre İşleme Kitinden kapatın ve ayırın. Hücre yoğunluğunu, gerekirse daha büyük bir hücre transfer torbasında/orta boy saklama torbasında tam SF ortamı ile 2 x 10⁶ hücre/mL olarak yeniden ayarlayın. Bunlar, 15 L'lik biyoreaktördeki ikinci kademe genişleme için tohum hücreleri olacak.

4. Hücre formülasyonu, doldurma ve bitirme

1. 15 L'lik biyoreaktörden hücre hasadından 1 gün önce 5 L'lik biyoreaktörü hazırlamaya başlayın. Parantez içinde belirtilen 2 L parametreleri dışında protokol bölüm 3 ve 15'teki adımları tamamen izleyin.
2. Hücreleri 250 mL kriyoprezervasyon tamponunda yeniden süspanse edin ve sistem hücreleri hazneden aspire ettikten sonra hücre transfer torbasını Tek Kullanımlık Hücre İşleme Kitinden kapatın ve ayırın.
3. 2.000 mL kriyoprezervasyon tamponunu, 250 mL yeniden süspanse hücrelerle birlikte adım 4.2'den 3 L'lik bir hücre transfer torbasına aktarın. Bu transfer torbasını Tek Kullanımlık Doldurma ve Bitirme Sarf Malzemesine kaynaklayın.
   NOT: Burada kullanılan ek kriyoprezervasyon tamponu hacmi, adım 3.21'de elde edilen sayım sonuçlarına göre formülasyonun spesifikasyonu ve toplam hücre sayısı hesaplaması ile belirlenmelidir.
4. Tek Kullanımlık Doldurma ve Bitirme Sarf Malzemesini hücre doldurma sistemine monte edin ve üreticinin talimatlarına göre ön soğutma sistemini açın. Sistemdeki talimatları izleyin ve parti başına toplam 20 torba ile 20 mL/torba dolduracak şekilde ayarlayın. Bu torbaları kapatın ve kitten ayırın ve standart kriyoprezervasyon prosedürlerini izleyin. Kriyo saklama torbaları kullanın.
5. Tek Kullanımlık Doldurma ve Bitirme Sarf Malzemesine yeni bir 20 kriyoprezervasyon torbası seti kaynaklayın ve tüm hücreler ayrılana kadar doldurma ve bitirme prosedürünü tekrarlayın. Bu hücreleri dondurarak saklamak için standart prosedürleri izleyin.

5. Hücre kalitesinin karakterizasyonu

1. Hasat edilen hMSC'leri çözünebilir mikro taşıyıcılardan örnekleyin ve literatür^18'de açıklanan yöntemleri izleyerek hücre kimliğinin belirlenmesi için akış sitometrisi ile karakterizasyon için bir hücre işleme sistemi kullanın.
2. Kriyoprezervasyonlu hücreleri çözün ve literatür^18'de açıklanan yöntemleri izleyerek hücre morfolojisi ve üç soy farklılaşma yeteneği dahil olmak üzere hücre özelliklerinin daha fazla karakterizasyonu için geleneksel 2D şişeler veya mikroplakalar üzerinde yeniden plakalayın.

6. Karıştırılmış tank biyoreaktöründeki G02 mikro taşıyıcılarında HEK293T genişleme

1. 5. adımda belirtildiği gibi 2 L'lik bir biyoreaktör hazırlayın. HEK293T hücreler için, hücreleri W01 yerine steril G02 mikro taşıyıcıları ile kültürleyin. Kültür işlemi, aşağıdaki adımlarda detaylandırılacağı gibi bazı parametreler farklı olsa da, protokol bölüm 3'tekine benzer. HEK293T hücrelerinin kültürü için perfüzyon gerektiğinden, kanama tüpünün yerine biyoreaktöre özel bir perfüzyon tüpü takın.
2. Protokol bölüm 3'te detaylandırılan protokolden farklı olarak, 5 L biyoreaktör için% 10 FBS ile DMEM'de 20 g G02 mikro taşıyıcısı (yani iki şişe) hazırlayın, gün 0 kültür hacmi 3.5 L'ye ayarlanmıştır (yani, yaklaşık 5.71 g / L'lik bir nihai konsantrasyon). İki şişe G02 mikro taşıyıcıdan önce kaba 2 L ortam dağıtın ve 500 mL 1.75 x 10⁹ HEK293T hücreyi (yani 5 x 10⁵ hücre / mL'lik bir nihai yoğunlukta) aşılayın.
3. Protokol bölüm 3'ten farklı olan ve Tablo 4'te detaylandırılan bir ajitasyon rejimi ve ortam değişim rejimi (günlük olarak değiştirilmesi gereken ortam miktarına göre, günlük kültür hacmi, CVD olarak ifade edilir) gerçekleştirin.
   NOT: Perfüzyonun gerçekleşmesi için her ikisinin de sürekli pompalayabilmesi için pompa 1 ve pompa 2'yi manuel olarak etkinleştirin. Pompaların hacim dağıtım hızının kalibrasyonuna bağlı olarak perfüzyon hızını karşılamak için pompa hızını her gün ayarlayın. Genellikle, bu tek haneli aralıkta olacaktır. HEK293T hücreleri için, yem olarak taze ortam kullanın ve ortamın sirküle edildiği hMSC'lerin aksine, kullanılmış ortamı tamamen bir atık şişesine atın.
4. 15 L'lik biyoreaktöre ikinci kademe genişletme için, hMSC'lerde kullanıldığı gibi mikro taşıyıcıların tamamen çözünmesi yerine HEK293T hücrelerinin boncuktan boncuk transferini kullanın. Spesifik olarak, istenen hücre yoğunluğuna ulaşıldıktan sonra mikro taşıyıcıları çökeltmek için çalkalamayı durdurun ve daha sonra perfüzyon tüpünden mümkün olduğunca fazla süpernatan aspire edin, mikro taşıyıcıları yıkamak için PBS'yi kalan süspansiyon hacminin 3 katı ile besleyin ve üç kez tekrarlayın. Son yıkamada mümkün olduğunca çok PBS'yi aspire edin ve atın.
5. G02 mikro taşıyıcıları bozulmadan kalırken hücreleri mikro taşıyıcılardan ayırmak için 3,5 L 1x rekombinant tripsin besleyin. Sıcaklığı 37 °C'ye ve çalkalama hızını 60 rpm'ye ayarlayın. Hücrelerin %80'inden fazlası ayrıldığında, eşit miktarda tam ortamla 45 dakika içinde ayırma işlemini sonlandırın.
6. İkinci kademe genişletme için doğrudan hasat limanından hazırlanmış 15 L'lik bir gemiye aktarın.

7. Karıştırılmış tank biyoreaktöründe V01 mikro taşıyıcıları üzerinde Vero hücre genişlemesi

1. Liyofilize mikro taşıyıcıları PBS ile birlikte 20 mg/mL'lik bir konsantrasyona kadar biyoreaktör kabına aktararak V01 mikro taşıyıcılarını hazırlayın. Kabı protokol bölüm 2'de belirtildiği gibi monte edin ve sterilize edin, ancak bunun yerine 30 dakika otoklavlayın.
2. Sterilizasyondan sonra, V01 mikro taşıyıcıları doğal olarak yerleşir. Süpernatanı, kanama ve besleme tüplerini kullanarak iki kez bazik DMEM ile değiştirin ve hücre aşılaması ve kültürü için protokol bölüm 3'e geçmeden önce damar hacminin %50-75'ine %10 NBS içeren tam DMEM'i ekleyin.
3. Protokol bölüm 3'te ayrıntılı olarak açıklanan protokolden farklı olarak, 4 L'lik bir Vero hücresi kültürü için 24 g V01 mikro taşıyıcıları kullanın (yani, 6 g / L'lik bir nihai konsantrasyon) ve 500 mL 4 x 10⁹ Vero hücresini (yani, 1 x 10⁶ hücre / mL'lik bir nihai yoğunlukta).
4. Kültür prosesi parametreleri ve 15 L karıştırılmış tank biyoreaktöründe ikinci kademe genleşmeye geçiş için 6.3-6.6 adımlarını izleyin.

Sonuçlar

ACISCP platformu, ölçek büyütme genişlemesi için bir dizi karıştırılmış tank biyoreaktörü, otomatik hücre toplama ve formülasyonu için bir hücre işleme sistemi ve bir hücre doldurma sistemi kullanan tamamen kapalı bir sistemdir (Şekil 1). Yapışık hücreler, biyoreaktöre dağılabilen gözenekli mikro taşıyıcılara bağlanır ve böylece yapışık hücrelerin askıya alınmış ekimini sağlar.

Tarif edildiği gibi protokolü takiben, ...

Tartışmalar

Hem immünoterapi hem de kök hücre tedavisi, canlı hücreleri ilaç olarak kullanır; Bununla birlikte, nihai ürünleri, küçük moleküller veya virüslerle aynı şekilde saflaştırılmamalı veya sterilize edilmemelidir. Bu nedenle, Tasarımla Kalite (QbD) ilkesi her zaman akılda tutulmalı ve hücre üretimi sırasında Kimyasal Üretim ve Kontrol (CMC) sürecine pratik olarak uygulanmalıdır²³. Tamamen kapalı bir hücre kültürü sisteminin yanı sıra bir işleme sistemi ve bir dol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.