A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשגת ייצור בקנה מידה גדול של תאים דבקים באמצעות מערכת סגורה לחלוטין המבוססת על מיקרו-נשאים נמסים ברמת GMP. הטיפוח של תאי גזע מזנכימליים אנושיים, תאי HEK293T ותאי ורו אומת ועמד הן בדרישות הכמות והן בקריטריוני האיכות של תעשיית התרפיה התאית והגנטית.
חוקרים בתעשיית התרפיה התאית והגנטית (CGT) מתמודדים זה זמן רב עם אתגר עצום בהתרחבות יעילה ובקנה מידה גדול של תאים. כדי להתמודד עם החסרונות העיקריים של מערכת הטיפוח המישורית הדו-ממדית (2D), פיתחנו באופן חדשני פלטפורמה אוטומטית לייצור תאים בקנה מידה תעשייתי סגור (ACISCP) המבוססת על מיקרו-נשא בדרגה GMP, נמס ונקבובי עבור תרבית תלת-ממדית של תאים דבקים, כולל תאי גזע/סטרומה מזנכימליים אנושיים (hMSCs), תאי HEK293T ותאי ורו. כדי להשיג הרחבה בקנה מידה גדול, בוצעה הרחבה דו-שלבית עם ביוריאקטורים של 5 ליטר ו-15 ליטר עם מיכלי ערבוב כדי להניב 1.1 x10 10 hMSCs עם הרחבה כוללת של פי 128 תוך 9 ימים. התאים נקצרו על ידי המסה מוחלטת של המיקרו-נשאים, רוכזו, נשטפו ונוסחו באמצעות מערכת עיבוד תאים מבוססת צנטריפוגות בזרימה רציפה, ולאחר מכן הותאמו למערכת מילוי תאים. בהשוואה לתרבית מישורית דו-ממדית, אין הבדלים משמעותיים באיכות של hMSCs שנקטפו מתרבית תלת-ממדית. יישמנו גם מיקרו-נשאים נקבוביים נמסים אלה על סוגי תאים פופולריים אחרים במגזר CGT; באופן ספציפי, תאי HEK293T ותאי Vero טופחו לשיא צפיפות תאים של 1.68 x 10 7 תאים / מ"ל ו 1.08 x 107 תאים / מ"ל, בהתאמה. מחקר זה מספק פרוטוקול לשימוש בפלטפורמה של הנדסת תהליכים ביולוגיים הרותמת את המאפיינים של מיקרו-נשאים מתמוססים ברמת GMP וציוד סגור מתקדם להשגת ייצור בקנה מידה תעשייתי של תאים דבקים.
תעשיית CGT הייתה עדה להתרחבות אקספוננציאלית בשני העשורים האחרונים. האבולוציה של תרופות הדור הבא צפויה לטפל ולרפא מחלות עקשנות רבות1. מאז האישור הראשון של מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) למוצר CGT, Kymriah, בשנת 2017, המחקר והפיתוח הקשורים ל-CGT בעולם המשיכו לצמוח בקצב מהיר, כאשר ה-FDA ראה בקשות לתרופות ניסיוניות חדשות פעילות עבור CGT גדל ל-500 בשנת 20182. על פי התחזיות, מספר האישורים של מוצרי CGT יעמוד ככל הנראה על 54-74 בארה"ב עד שנת 20302.
בעוד הצמיחה המהירה במחקר ובחדשנות של CGT מרגשת, עדיין קיים פער טכנולוגי גדול בין מחקר מעבדה לייצור בקנה מידה תעשייתי שיכול לספק תרופות מבטיחות אלה כדי להגיע לחולים רבים ככל שיידרש בעלויות סבירות. התהליכים הנוכחיים שאומצו עבור ניסויים קליניים אלה הוקמו במעבדות לניסויים בקנה מידה קטן, ונדרשים מאמצים משמעותיים כדי לשפר ולחדש בייצור CGT3. ישנם סוגים רבים של מוצרי CGT, רובם מבוססים על תאים חיים, שיכולים להיות אלוגנים, אוטולוגיים, מהונדסים או טבעיים. תרופות חיות אלה מורכבות הרבה יותר מישויות מולקולריות קטנות או ביולוגיות, ולכן הופכות ייצור בקנה מידה גדול לאתגר משמעותי 4,5,6. בעבודה זו, אנו מדגימים פרוטוקול ייצור תאים בקנה מידה גדול עבור שלושה תאים תלויי עיגון המיושמים באופן נרחב ב- CGTs. אלה כוללים תאי גזע מזנכימליים אנושיים / סטרומה (hMSCs), אשר שימשו לטיפול מבוסס תאים, ותאי HEK293T ותאי ורו, שניהם משמשים לייצור וירוסים להנדסה גנטית של המוצר הטיפולי הסופי. תאים תלויי עיגון מגודלים בדרך כלל בתרבית על מערכות מישוריות, הדורשות עיבוד ידני. עם זאת, שיטות תרבות ידנית דורשות כמות משמעותית של עבודה והן נוטות לזיהום, אשר יכול לסכן את איכות המוצר הסופי. יתר על כן, אין בקרת תהליך בתוך השורה, מה שמוביל לשונות משמעותית באיכות בין אצוות7. אם ניקח את הטיפול בתאי גזע כדוגמה, עם צנרת מבטיחה של מעל 200 מועמדים לטיפול בתאי גזע, ההערכה היא כי 300 טריליון hMSCs יהיה צורך בשנה כדי לענות על הדרישות של יישומים קליניים8. לפיכך, הייצור בקנה מידה גדול של תאים טיפוליים הפך לתנאי מוקדם לביצוע התערבויות טיפוליות אלה עם ביקוש תאים כה גבוה9.
כדי למנוע את המכשולים של מערכות מישוריות, נעשו מאמצים בפיתוח תהליכי ייצור בקנה מידה גדול בביוריאקטורים של מיכלי ערבוב עם מיקרו-נשאים קונבנציונליים שאינם ניתנים לפירוק 10,11,12,13, אך אלה סובלים מהליכי הכנה מסובכים ומיעילות קצירת תאים נמוכה 14. לאחרונה, חידשנו מיקרו-נשא נמס להרחבת תאי גזע, במטרה לעקוף את האתגרים של קצירת תאים ממיקרו-נשאים מסחריים קונבנציונליים שאינם נמסים15. 3D TableTrix זה, מיקרו-נשא נקבובי תלת-ממדי נמס בתקן GMP (תנאי ייצור נאותים), הראה פוטנציאל גדול לייצור תאים בקנה מידה גדול. ואכן, תרבית תלת-ממדית המבוססת על מיקרו-נשאים נקבוביים אלה עשויה ליצור מחדש מיקרו-סביבות ביומימטיות חיוביות כדי לקדם הידבקות, התפשטות, נדידה והפעלה של תאים16. המבנים הנקבוביים ורשתות הנקבוביות המחוברות זו לזו של מיקרו-נשאים יכולים ליצור שטח היצמדות תאים גדול יותר ולקדם את חילופי החמצן, חומרי המזון והמטבוליטים, ובכך ליצור מצע אופטימלי להתרחבות תאי מבחנה 17. הנקבוביות הגבוהה של מיקרו-נשאים נקבוביים תלת-ממדיים מומסים אלה בתקן GMP מאפשרת הרחבה בקנה מידה גדול של hMSCs, והיכולת של התאים להיות מומסים במלואם מאפשרת קציר יעיל של תאים מורחבים אלה18. זהו גם מוצר בדירוג GMP (תנאי ייצור נאותים) והוא נרשם כמוצר פרמצבטי במרכז הסיני להערכת תרופות (מספרי הגשה: F20210000003 ו-F20200000496)19 וב-FDA של ארה"ב (FDA, ארה"ב; מספר תיק מאסטר לסמים: 35481)20.
כאן, אנו מדגימים מערכת אוטומטית לייצור תאים בקנה מידה תעשייתי סגור (ACISCP)18 באמצעות מיקרו-נשאים נקבוביים אלה הניתנים לפיזור ולמסה עבור hMSC, תא HEK293T והרחבת תאי Vera. השגנו הרחבה דו-שכבתית מוצלחת של hMSCs (הרחבה של פי 128 במצטבר תוך 9 ימים) מביוריאקטור של 5 ליטר לביוריאקטור של 15 ליטר ולבסוף השגנו עד 1.1 x10 10 hMSCs מאצווה אחת של ייצור. התאים נקצרו על ידי המסה מוחלטת של המיקרו-נשאים, רוכזו, נשטפו ונוסחו באמצעות מערכת עיבוד תאים מבוססת צנטריפוגות בזרימה רציפה, ולאחר מכן הותאמו למערכת מילוי תאים. יתר על כן, הערכנו את האיכות של מוצרי hMSC כדי לאשר תאימות. הדגמנו גם את היישום של מיקרו-נשאים נמסים אלה לייצור מורחב של שני סוגים אחרים של תאי עיגון, תאי HEK293T ותאי ורו, המיושמים באופן נרחב בתעשיית ה-CGT. צפיפות השיא של תאי HEK293T הגיעה ל 1.68 x 10 7 תאים / מ"ל, ואילו צפיפות השיא של תאי Vero הגיעה ל 1.08 x 107 תאים / מ"ל. מערכת ACISCP יכולה להיות מותאמת לתרבית של מגוון תאים דבקים, והיא עשויה להפוך לפלטפורמה רבת עוצמה שתתרום לזירוז התיעוש של CGT.
חבל הטבור האנושי התקבל מבית החולים צינגהואה צ'אנג-גנג בבייג'ינג. כל ההליכים והפרוטוקולים הנוגעים לרכישה, בידוד ותרבית של תאי גזע מזנכימליים מזנכימליים מחבל הטבור האנושיים (UCMSCs) נערכו בהסכמה מדעת ובאישור ועדת האתיקה של בית החולים צינגהואה צ'אנג-גנג בבייג'ינג (מספר הגשה 22035-4-02), והנהלים והפרוטוקולים עמדו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ותיקוניה המאוחרים יותר או בסטנדרטים אתיים דומים.
1. תרבית חד-שכבתית של hMSCs, תאי HEK293T ותאי Vero
2. הכנת הביוריאקטור המעורבב לפני זריעת התאים
3. זריעת תאים, תרבית וקציר בביוריאקטור 5 ליטר מיכל ערבוב
4. ניסוח תאים, מילוי וגימור
5. אפיון איכות התא
6. הרחבה HEK293T על מיקרו-נשאים G02 בביוריאקטור המוקפץ
7. התפשטות תאי Vero על מיקרו-נשאים V01 בביוריאקטור המיכל המעורבב
פלטפורמת ACISCP היא מערכת סגורה לחלוטין שמשתמשת בסדרה של ביוריאקטורים מוקפצים להרחבת קנה מידה, מערכת עיבוד תאים לקצירת תאים וניסוח אוטומטיים, ומערכת מילוי תאים (איור 1). תאים דבקים נצמדים למיקרו-נשאים הנקבוביים, אשר יכולים להתפזר לתוך הביוריאקטור, ובכך להשיג את הטיפוח המושעה ...
הן אימונותרפיה והן טיפול בתאי גזע משתמשים בתאים חיים כתרופות; עם זאת, המוצרים הסופיים שלהם לא צריך להיות מטוהר או מעוקר באותו אופן כמו מולקולות קטנות או וירוסים. לכן, העיקרון של איכות על ידי עיצוב (QbD) צריך תמיד לזכור מיושם בפועל על תהליך ייצור כימי ובקרה (CMC) במהלך ייצור תאים23. מ?...
י.ד. הוא יועץ מדעי, ו-H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. ו-X.Y. הם עובדים של Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. למחברים האחרים אין כל עניין מסחרי, קנייני או פיננסי במוצרים או בחברות המתוארים במאמר זה. כל שאר המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
עבודה זו נתמכה כספית על ידי הקרן הלאומית למדע לחוקרים צעירים מצטיינים (82125018).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% trypsin EDTA | BasalMedia | S310JV | Used for 2D cell harvest. |
3D FloTrix Digest | CytoNiche Biotech | R001-500 | This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers. |
3D FloTrix MSC Serum Free Medium | CytoNiche Biotech | RMZ112 | This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers. |
3D FloTrix Single-Use Filtration Module | CytoNiche Biotech | R020-00-10 | This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution. |
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-03 | Used as feed bag for 5 L bioreactor. |
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-01 | Used as cell seeding or transfer bags. |
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-04 | Used as feed bag for 15 L bioreactor. |
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit | CytoNiche Biotech | PACK-01-01 | This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system. |
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells | CytoNiche Biotech | vivaPACK | This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch. |
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system | CytoNiche Biotech | vivaPREP PLUS | This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures. |
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit | CytoNiche Biotech | PREP-PLUS-00 | This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing. |
3D FloTrix vivaSPIN bioreactor 15 L | CytoNiche Biotech | FTVS15 | This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available. |
3D FloTrix vivaSPIN bioreactor 5 L | CytoNiche Biotech | FTVS05 | This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available. |
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L) | CytoNiche Biotech | R020-10-10 | This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags. |
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L) | CytoNiche Biotech | R020-05-10 | This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags. |
3D TableTrix microcarriers G02 | CytoNiche Biotech | G02-10-10g | These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors. |
3D TableTrix microcarriers V01 | CytoNiche Biotech | V01-100-10g | These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production. |
3D TableTrix microcarriers W01 | CytoNiche Biotech | W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets) | These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481] |
APC anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 368512 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment |
Calcein-AM/PI Double Staining Kit | Dojindo | C542 | Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively. |
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) | Saint-Gobain | CAP-38 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in) | Saint-Gobain | 374-250-3 | Used for tube welding and disconnection. |
CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit. |
Dimethyl Sulfate (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | Used for preparation of cryopreservation solution. |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | BasalMedia | L120KJ | Used for cultivation of HEK293T and Vero cells. |
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L) | DWK life sciences | 218016357 | Used for waste collection from the 5 L bioreactor. |
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L) | DWK life sciences | 218017353 | Used for waste collection from the 15 L bioreactor. |
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL) | DWK life sciences | 218014459 | Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH. |
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL) | Saint-Gobain | EZ500 ML-38-2 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
Fetal bovine serum (FBS) superior quality | Wisent | 086-150 | Used for cultivation of HEK293T cells. |
FITC anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 301804 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
FITC anti-human CD34 Antibody | BioLegend | 343504 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | BioLegend | 328108 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
Flow cytometry | Beckman Coulter | CytoFLEX | Used for cell identity assessment. |
Fluorescence Cell Analyzer | Alit life science | Countstar Rigel S2 | Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes. |
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports | DWK life sciences | 292632806 | Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands. |
Glucose Meter | Sinocare | 6243578 | Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant. |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium | Gibco | 14025092 | Used for preparation of digest solution. |
Human Albumin 20% Behring (HSA) | CSL Behring | N/A | Used for preparation of wash buffer. |
Inverted fluorescent microscope | OLYMBUS | CKX53SF | Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging. |
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL) | Thermo Scientific | 3662-0500PK | Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps. |
Newborn calf serum (NBS) superfine | MINHAI BIO | SC101.02 | Used for cultivation of Vero cells. |
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90031 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90041 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit | Cyagen | HUXUC-90021 | Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs. |
PE anti-human CD105 Antibody | BioLegend | 800504 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
PE anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302208 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody | BioLegend | 344004 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
PE anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307605 | Used in flow cytometry for MSC identity assessment. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium. |
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in) | Saint-Gobain | ULTRA-C-125-2F | Used for solution transfering driven by peristaltic pumps. |
Sterile Saline | Hopebiol | HBPP008-500 | Used for preparation of wash buffer. |
Trypzyme Recombinant Trypsin | BasalMedia | S342JV | This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells. |
Tube Sealer | Yingqi Biotech | Tube Sealer I | This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing. |
Tube Welder for PVC tubing | Chu Biotech | Tube Welder Micro I | Used for welding of PVC tubing. |
Tube Welder for TPE tubing | Yingqi Biotech | Tube Welder I-V2 | Used for welding of TPE tubing. |
ViaStain AO / PI Viability Stains | Nexcelom | CS2-0106-25mL | Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved