GMPグレードの溶解性多孔質マイクロキャリアに基づく大規模セル生産

要約

ここでは、GMPグレードの溶解性マイクロキャリアに基づく完全クローズドシステムによる接着細胞の大規模製造を実現するためのプロトコルを紹介します。ヒト間葉系幹細胞、HEK293T細胞、およびVero細胞の培養は検証され、細胞および遺伝子治療業界の量的要求と品質基準の両方を満たしました。

要約

細胞・遺伝子治療(CGT)業界の研究者は、細胞を効率的かつ大規模に増殖させるという手ごわい課題に長い間直面してきました。2次元(2D)平面培養システムの主な欠点に対処するために、ヒト間葉系幹細胞/間質細胞(hMSC)、HEK293T細胞、Vero細胞などの接着細胞の3D培養用に、GMPグレードの溶解性多孔質マイクロキャリアに基づく自動クローズド工業スケール細胞生産(ACISCP)プラットフォームを革新的に開発しました。大規模な拡張を達成するために、5 Lおよび15 Lの攪拌タンクバイオリアクターで2段階の拡張を行い、1.1 x 10^{10 hMSC} を9日以内に全体で128倍に拡大しました。細胞は、マイクロキャリアを完全に溶解して回収し、濃縮、洗浄し、連続フロー遠心分離機ベースの細胞処理システムで調製した後、細胞充填システムで分注しました。2D平面培養と比較して、3D培養から採取したhMSCの品質に有意差はありません。また、これらの溶解性多孔質マイクロキャリアをCGT分野で人気のある他の細胞タイプにも適用しています。具体的には、HEK293T細胞とVero細胞をそれぞれ1.68 x 10⁷ cells/mLおよび1.08 x 10⁷ cells/mLのピーク細胞密度まで培養しました。本研究では、GMPグレードの溶解性マイクロキャリアと高度なクローズド機器の特性を利用して、接着細胞の工業規模の製造を実現するためのバイオプロセスエンジニアリングプラットフォームを使用するためのプロトコルを提供します。

概要

CGT業界は、過去20年間で指数関数的な拡大を目の当たりにしてきました。次世代医薬品の進化により、多くの難治性疾患の治療・治癒が期待されています¹。2017年に食品医薬品局(FDA)がCGT製品「キムリア」を初めて承認して以来、世界のCGT関連の研究開発は急速に成長を続けており、FDAはCGTの積極的な治験薬申請が2018年に500件に増加したことを確認し^{ています2。}2030年までに米国でのCGT製品の承認数は54〜74件になると予測^{されていました2。}

CGTの研究とイノベーションの急速な成長は喜ばしいことですが、これらの有望な医薬品を手頃な価格で必要なだけ多くの患者に届けることができるラボ研究と工業規模の製造の間には、まだ大きな技術的ギャップがあります。これらの臨床試験に採用されている現在のプロセスは、小規模な実験のために実験室で確立されたものであり、CGT製造の改善と革新には多大な努力が必要です³。CGT製品には多くの種類があり、そのほとんどは生細胞に基づいており、同種、自家、人工、または天然のものがあります。これらの生きた医薬品は、低分子の実体や生物学的製剤よりもはるかに複雑であるため、大規模な製造は大きな課題となっています^4,5,6。本研究では、CGTに広く適用されている3つの足場依存性細胞の大規模細胞産生プロトコルを実証する。これらには、細胞ベースの治療に使用されているヒト間葉系幹細胞/間質細胞(hMSC)や、最終的な治療用細胞製品の遺伝子操作のためのウイルスの産生に使用されるHEK293T細胞およびVero細胞が含まれます。足場依存性細胞は、通常、手作業による処理を必要とする平面系で培養されます。しかし、手作業による培養法は多大な労力を必要とし、汚染されやすく、最終製品の品質を損なう可能性があります。さらに、インラインプロセス制御がないため、バッチ間の品質に大きなばらつきが生^じます7。幹細胞治療を例にとると、200を超える幹細胞治療候補の有望なパイプラインがあり、臨床応用の需要を満たすためには、年間300兆個のhMSCが必要になると推定されています⁸。したがって、治療用細胞の大規模製造は、このような高い^{細胞需要で}これらの治療的介入を実施するための前提条件となっています9。

平面システムの挫折を防ぐために、従来の非溶解性マイクロキャリアを備えた攪拌タンクバイオリアクターでの大規模な製造プロセスの開発が努力されてきました10,11,12,13が、これらは複雑な調製手順と低い細胞回収効率に悩まされています¹⁴.最近、我々は幹細胞増殖のための溶解性マイクロキャリアを革新し、従来の非溶解性商用マイクロキャリアからの細胞採取の課題を回避することを目指している¹⁵。この新規で市販されているGMPグレードの3D溶解性多孔質マイクロキャリアである3D TableTrixは、大規模な細胞生産に大きな可能性を示しています。実際、これらの多孔質マイクロキャリアに基づく3D培養は、細胞の接着、増殖、遊走、および活性化を促進するために、好ましい生体模倣微小環境を再現する可能性があります¹⁶。マイクロキャリアの多孔質構造と相互接続された細孔ネットワークは、より大きな細胞接着領域を作り出し、酸素、栄養素、および代謝産物の交換を促進し、したがって、in vitro細胞増殖のための最適な基質を作り出すことができる¹⁷。これらのGMPグレードの3D溶解性多孔質マイクロキャリアの高い多孔性は、hMSCの大規模な増殖を可能にし、細胞を完全に溶解する能力により、これらの増殖した細胞の効率的な収穫を可能にする¹⁸。また、GMPグレードの製品であり、中国医薬品評価センター(出願番号:F20210000003およびF20200000496)¹⁹および米国FDA(FDA、USA;ドラッグマスターファイル番号:35481)²⁰。

本稿では、hMSC、HEK293T細胞、およびVero細胞増殖のために、これらの分散性および溶解性多孔性マイクロキャリアを用いた自動閉鎖型工業スケール細胞生産(ACISCP)システム¹⁸を例示する。5 L バイオリアクターから 15 L バイオリアクターへの hMSC の 2 層拡張 (9 日間で 128 倍の累積増殖) に成功し、最終的に 1 つのバッチの生産から最大 1.1 x 10¹⁰ hMSC を取得しました。細胞は、マイクロキャリアを完全に溶解して回収し、濃縮、洗浄し、連続フロー遠心分離機ベースの細胞処理システムで調製した後、細胞充填システムで分注しました。さらに、hMSC製品の品質を評価し、適合性を確認しました。また、CGT産業で広く適用されている他の2種類の足場細胞、HEK293T細胞とVero細胞のスケールアップ生産へのこれらの溶解性マイクロキャリアの応用を実証しました。HEK293T細胞のピーク細胞密度は1.68 x 10 7 cells/mLに達し、Vero細胞のピーク密度は1.08 x 10⁷ cells/mLに達しました。ACISCPシステムは、様々な接着細胞の培養に応用でき、CGTの工業化促進に寄与する強力なプラットフォームとなる可能性があります。

プロトコル

ヒトのへその緒は北京清華長源病院から入手した。ヒト臍帯間葉系幹細胞(UCMSC)の取得、単離、培養に関するすべての手順とプロトコルは、インフォームドコンセントと北京清華長源病院の倫理委員会(出願番号22035-4-02)の承認を得て実施され、手順とプロトコルは1964年のヘルシンキ宣言およびその後の改正または同等の倫理基準に準拠していました。

1. hMSC、HEK293T細胞、Vero細胞の単層培養

1. 報告された方法²¹に従って、ウォートンゼリーから初代ヒトUCMSCを分離します。初代UCMSCの単離および増殖には無血清(SF)hMSC培地を使用し、継代2で細胞を回収し、マスターセルバンク(MCB)として凍結保存します。
2. 15 mLの完全なSF hMSC培地で単層培養のために、1つのT75フラスコ(すなわち、2D平面血管上の播種密度は8,000細胞/cm 2)に6 x 10⁵ 個のヒトUCMSC(できれば継代²または継代3細胞)を接種します。フラスコを8の字に動かして均一に播種します。5%_CO2 細胞培養インキュベーターで37°Cで80%〜90%のコンフルエントまで培養します。
3. 回収するには、細胞培養培地をデカントし、3〜5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を2回すすぎます。次に、2 mLの0.25%トリプシン-EDTAを加え、4倍対物レンズの明視野倒立顕微鏡で観察したように、ほとんどの細胞が丸くなり、フラスコから剥離するまで、37°Cで1〜2分間インキュベートします。3 mLのSF hMSC培地を添加して消化を終了します。
4. 細胞懸濁液を15 mLのコニカル遠心チューブに移し、179 x g で5分間遠心分離します。上清をデカントし、細胞ペレットをPBSで2回すすぎ、約3〜5 mLのSF hMSC培地に再懸濁して、バイオリアクターのマイクロキャリアに播種します。
   注:細胞の生存率をチェックし、細胞が>90%生存可能であることを確認してください。バイオリアクターのすべての調製作業が完了した後にのみ、細胞を調製します(ステップ2.1-3.6)。
5. HEK293T細胞とVero細胞の単層培養では、各T75フラスコに2 x 10 6-3 x 10⁶細胞を接種し、それぞれ10%のウシ胎児血清(FBS)と10%のウシ新生児血清(NBS)を含むDMEMで培養します。
6. ステップ1.3〜1.4に従って細胞を採取します。10%FBSを含む3〜5 mLのDMEMに再懸濁します。

2. 細胞播種前の撹拌槽式バイオリアクターの調製

1. -1日目に、ガラス容器を流水脱イオン(DI)水で1回完全にすすぎます。
2. すべてのステンレスチューブとインペラをヘッドプレートから分解し、脱イオン水に浸し、超音波洗浄機で40kHz、60°Cで1時間超音波処理して完全に洗浄します。
   注:準備と手順は、5 L バイオリアクターの第 1 層の拡張と 15 L バイオリアクターの第 2 層の拡張で同じです。15 Lバイオリアクターのパラメータは、括弧内に示されています。括弧内にパラメータが指定されていない場合、これらのパラメータは 5 L と 15 L のバイオリアクターで同じです。
3. すべてのOリングに損傷がなく、所定の位置にあることを注意深く確認してから、製造元の指示に従って分解した部品をヘッドプレートに戻します。
   注意: 必要に応じて、組み立てる前に摩耗または破れたOリングを交換してください。摩耗したOリングは気密性を損なうため、容器の無菌性が損なわれます。
4. 5Lの容器に7L(15Lバイオリアクターは18L)の0.5M NaOH溶液を加え、チューブを組み立てたヘッドプレートを容器の縁に置き、チューブをNaOH溶液に浸します。12時間または一晩放置して、チューブとガラス容器からエンドトキシンを取り除きます。
   注意: 7 L(18 L)は5 L(15 L)のガラス容器の最大容量であるため、超えないでください。NaOH溶液は腐食性があるため、取り扱うときは適切な個人用保護具を着用してください。
5. ヘッドプレートを取り外し、NaOH溶液を適切な廃液ボトルにデカントします。ラボの安全規制に従って廃棄してください。容器、ヘッドプレート、およびその部品をエンドトキシンを含まない純水または注射用水で十分にすすぎ、残留アルカリ性を除去します。
6. 容器にPBSを2L(5L)加え、すべての部品を組み立て直し、メーカーの指示に従ってヘッドプレートを容器の金属フレームにボルトで固定します。
7. クローズドシステム消耗パックは、製造元の指示に従って、ヘッドプレートの適切なステンレス鋼(SS)部品/チューブ/ポートに取り付けます。チューブにすべてのロバートクランプをクランプし、止血剤でクランプして補強することをお勧めします。コンデンサーに接続されている端に0.22 μmのエアベントフィルターが付いたチューブの1つをクランプを外したままにします。
   注意: シリコンチューブに穴を開けないように、シリコンチューブを止血剤の先端に滑り込ませます。シリコンチューブのみをクランプし、このキットに含まれているCフレックスチューブのクランプは避けてください。コンデンサーの1本のチューブをクランプを外したままにしておくと、オートクレーブ中に圧力を解放できます。
8. オートクレーブ可能な 500 mL GL 45 ガラスボトルに 250 mL の 0.1 M NaOH 溶液を調製し、2 つのポートを備えた GL 45 マルチポートコネクタスクリューキャップを取り付けます。長さ 180 mm、0.13 インチ x 0.25 インチ (内径 x 外径) のシリコン チューブをキャップの下側にあるポートの 1 つに接続します。長さは、ボトルの底に触れるのに十分な長さである必要があります。
9. 前のものより長さが500mm長い別のシリコンチューブをキャップの上側の同じポートに接続し、もう一方の端を5L容器ヘッドプレートのドリップフィードポートに接続します。0.22μmのエアベントフィルターをスクリューキャップのもう一方のポートに接続します。
10. 製造元の指示に従って、pHプローブで2点校正を実行します。次に、pH、溶存酸素(DO)、および生細胞数プローブを容器の適切なPG13,5ポートに挿入し、ヘッドプレートにしっかりとねじ込みます。
11. 完全に組み立てられた容器の気密性チェックは、メーカーの指示に従って行ってください。0.4バール±0.01バールの圧力を少なくとも30分間維持します。システムがテストに合格したら、ゆっくりと圧力を解放します。気密性試験に失敗した場合は、漏れ箇所を注意深く探し、容器アセンブリを補強します。
12. 消耗部品キットで完全に組み立てられた容器を、15 psi および 121 °C で 60 分間オートクレーブします。オートクレーブ後、すべての通気孔フィルターをチェックして、それらが無傷で乾燥していることを確認します。すべての止血剤を取り外します。
    注:湿式エアベントフィルターはガスを効率的にろ過できず、細胞培養中に容器の無菌性を損なう可能性があります。エアベントフィルターが濡れている場合は交換し、容器全体を再度オートクレーブします。
13. オートクレーブした容器をクリーンルームに移し、室温まで完全に冷えるのを待ちます。温度プローブをサーモウェルチューブに挿入し、モーター、pHプローブ、DOプローブのケーブルをコントローラーから容器のそれぞれの部品に接続します。ヒートマットを容器にしっかりと巻き付けます。
14. 排気ガスコンデンサー、リングスパージャー、NaOH用ドリップ供給ポート、およびエアオーバーレイポートのフレキシブルチューブのRobertクランプを外します。コントローラの電源を入れてログインし、製造元の指示に従って、 表 1 に示すパラメータをシステムに入力します。これらのチューブは、培養プロセス中にクランプしないでください。
15. [開始]をクリックし、実験に名前を付けてバイオリアクターを開始します。バイオリアクターをこれらの設定で少なくとも12時間、または一晩運転してPBSを酸素で飽和させ、後でDOプローブのワンポイントキャリブレーションを実行します。
16. バイオリアクターコントローラーでポンプ1とポンプ2のリキッドハンドリング容量速度を校正します。各ポンプに0.13インチx0.25インチのシリコンチューブを個別に取り付け、一方の端を水のボトルに浸し、チューブのもう一方の端をメスシリンダーに挿入します。
17. ポンプの回転数を300rpm、時間を1分に設定します。両方のポンプのメスシリンダーに分配される水の量に注意してください。これらの番号は、以降の手順で必要になります。
18. メーカーの指示に従って500 mLのSF hMSC培地を調製し、細胞培養培地ボトルのキャップを使い捨てのC-Flex EZ Topコンテナクロージャーと互換性のあるキャップと交換します。キャップの交換は、バイオセーフティキャビネット(BSC)内で行ってください。
19. 培地のボトルの出口チューブを、MSC用の滅菌済みW01マイクロキャリア10gのボトルの入口Cフレックスチューブに溶接します。チューブの一部をバイオリアクターコントローラーのポンプ1に取り付け、ポンプの回転数を300rpmに設定し、ボトルからマイクロキャリアのボトルにすべての培地をポンプで送り込みます。これらのマイクロキャリアは、0日目に使用するまで4°Cで保管してください。
    注:マイクロキャリアは、-1日目に準備する必要があります。15 Lのバイオリアクター培養の場合は、合計4本のボトル(すなわち、40 g、4 x 500 mLのSF培地)を準備します。

3. 5 L攪拌タンクバイオリアクターでの細胞播種、培養、回収

1. 0日目に、製造元の指示に従って、バイオリアクターコントローラーのDOプローブの1点校正(特に100%)を実行します。攪拌タンク式バイオリアクターは、細胞培養の準備が整いました。
2. 廃棄物収集用の2 L(5 L)ガラスボトルを準備し、2つのポートを備えたGL 45マルチポートコネクタスクリューキャップを取り付け、30 mm、0.25インチ x 0.44インチのC-Flexチューブを両方のポートに接続し、オートクレーブで滅菌します。C-flexチューブを廃液ボトルのポートの1つからバイオリアクター容器のヘッドプレート上のハーベストチューブまでチューブ溶接機で溶接します。
3. バイオリアクターコントローラーの温度、pH、DO制御を一時的に停止し、ハーベストチューブに取り付けられたシリコンチューブを正しい液体の流れ方向にペリスタルティックポンプ2に取り付け、容器からすべてのPBSを廃液ボトルに完全に分注します。チューブをポンプから外し、廃液ボトルを密封して外します。
   注:各ステップで、液体の流れに関与するフレキシブルチューブのロバートクランプは、常にクランプを外してください。密封して外す前に、液体の移送が完了した後、クランプバックします。クランプ ヘッドプレート側に近づきます。クランプ解除とクランプは、特に明記されていない限り、後続のすべてのステップで実行する必要があります。
4. 7 L(30 L)の完全なSF hMSC培地を準備し、各元のボトルキャップを使い捨てのC-Flex EZ Topコンテナクロージャーと互換性のあるキャップと交換します。10 L(50 L)の使い捨て収納袋のポートの1つに使い捨てろ過モジュールを溶接します。BSC 内のキャップを交換する操作を実行します。
5. 細胞培養培地のボトルをカプセルフィルターのもう一方の端に溶接し、バイオリアクターコントローラーのポンプを使用して、培養液を一度に1本ずつろ過して保存袋に移します。フィードバッグとして指定します。
6. フィードバッグからの1つの出口ポートをヘッドプレートのフィードチューブのCフレックスチューブに溶接し、バイオリアクターコントローラーのポンプ1にチューブを取り付けます。フィードバッグからブリードチューブへのもう一方の出口ポートを溶接し、チューブをポンプ2にバイオリアクターコントローラーの正しい液体の流れの方向に取り付けます。
   注意: C-Flexチューブと比較して耐摩耗性を高めるために、シリコンチューブで作られた流体フローラインのセクションをポンプに取り付けます。チューブが正しい方向に取り付けられていることを確認してください。
7. ポンプ1の回転数を300rpmに設定し、ステップ2.17で示した容量吐出速度に基づいて、フィードバッグから5L(5L)の培地を容器に分注した後、ポンプを停止します。ステップ2.14で説明したのと同じ設定で、温度、pH、およびDO制御を再度開始します。
8. フィードバッグをヘッドプレートのフィードチューブに接続しているチューブを密封して外します。ステップ2.18で調製した分散マイクロキャリアのボトルからC-Flexチューブをフィードチューブに溶接し、ボトルからすべての内容物を容器に送り込みます。マイクロキャリア懸濁液の空のボトルを密封して外します。ボトルの表面全体を75%エタノールで消毒し、BSCに入れて細胞懸濁液トランスファーボトルとして使用します。
   注意: 使い捨てアクセサリを密封して取り外すときは、次の手順で同じチューブに対して複数の溶接および切断手順が実行されるため、ヘッドプレート側に長いC-Flexチューブを残してください。
9. コントローラーに表示されている温度が37°Cの定常状態(通常は約30分)に達していることを確認してから、手順1.3〜1.4のようにシードセルの調製に進みます。2.5 x 10⁸ hMSCを500 mLのSF培地に再懸濁し、マイクロキャリア懸濁液を事前に入っていた空のボトルに移します。
   注:15 Lバイオリアクター拡張用のシード細胞は、500 mLに1.0 x 10⁹ 細胞を接種することを目的として、ステップ3.21に従って調製する必要があります。
10. 細胞懸濁液が入ったボトルからヘッドプレートのフィードポートにC-Flexチューブを溶接し、ボトルから容器にすべての内容物を送り込んで、マイクロキャリアへの細胞接種を開始します。空のボトルを密封して外します。フィードバッグからヘッドプレートのフィードチューブにフィードポートを再溶接します。
11. 次のパラメータを設定することにより、hMSCの接種効率を高めるために断続的な攪拌を可能にするようにコントローラーの撹拌設定を調整します:V1 = 35(30)rpm / 5分。V2 = 0 rpm/25 分;サイクル数= 12(24);最終攪拌速度=35(30)rpm。
    注:培養プロセス中にマイクロキャリアの不均一な分布または沈降が観察される場合は、攪拌速度を40(35)rpmまたは45(40)rpmに調整できます。
12. 培地交換インターフェースのバイオリアクターコントローラーで、自動化された培地のサプリメントと交換レジームを設定します。hMSC培養のパラメータを 表2に示すように設定します。
    注意: この段階では、特にフィードチューブとブリードチューブの場合、液体の流れに関与するフレキシブルチューブのロバートクランプのクランプを外します。これらを培養プロセス全体を通してクランプを外したままにしてください。
13. ディスポーザブルサンプリングバッグをルアーコネクタ を介して 、通常は毎日1回、希望の時点で接続し、サンプリングバッグに毎回10 mLを分注することにより、サンプルをサンプリングチューブに通します。2〜3 mLのサンプルを最初のサンプリングバッグに分注し、廃棄してから、実際の10 mLのサンプルを毎回新しいサンプリングバッグに分注します。
    注:最初の2〜3 mLのサンプルは、以前のサンプリング時点からチューブ内に残っている液体である可能性があり、容器内の状態を正確に表していない可能性があります。これらのステップは、75%エタノールとの接続を確立または切断する前後にルアーコネクタを消毒することにより、常に追加の無菌対策を講じて実行してください。
14. 採取したサンプルを15 mLのコニカル遠心チューブに移します。サンプルに対して次のテストを実行します。
    1. 細胞を含んだマイクロキャリア懸濁液200 μLを採取し、メーカーの指示に従ってCalcein-AM/PI Cell Double Stainingで染色します。蛍光顕微鏡で観察します。
    2. 重力によってマイクロキャリアを沈殿させるが、これには通常5〜10分かかる。上澄み液を吸引し、製造元の指示に従ってグルコースメーターでグルコース濃度をテストします。グルコース レベル グラフをプロットします。
    3. 沈降した細胞を含むマイクロキャリアを、新たに調製した3〜5 mLの1 mg/mL消化液と37°Cで20〜30分間インキュベートし、マイクロキャリアを完全に溶解します。AO/PIで染色した後、自動蛍光細胞分析装置で細胞をカウントします。細胞増殖曲線をプロットします。コントローラで生成されたリアルタイムの生細胞増殖曲線と相関します。
15. 培養の4日目または5日目に、50 mL(200 mL)の消化液を30 mg/mLで調製します。消化液と溶解性マイクロキャリアの作動質量比は、3:20から5:20の範囲です。0.22 μmカプセルフィルターを備えた滅菌フィルターを使用し、カルシウムおよびマグネシウムを含む500 mL(2 L)のハンク平衡塩溶液(HBSS)でさらに希釈します。3Lの使い捨て保存袋に移します。
    注:消化液は、細胞回収の直前にのみ調製してください。第 1 層の拡張では少なくとも 1.0 x 10 9-1.2 x 10⁹ セル、第 2 層の拡張では 1.0 x 10¹⁰ セルを目指すようにしてください。細胞の成長が早い場合は、4日目に収穫します。そうでない場合は、5日目に収穫します。5日目以降はお勧めしません。
16. マイクロキャリアが沈降するように、コントローラーで撹拌速度を0に設定します(通常は20分以内に発生します)。自動培地交換プロトコルをオフにし、バイオリアクターコントローラーの温度、pH、およびDO制御を停止します。コントローラーでポンプ 2 を 300 rpm で手動で始動し、上清を供給領域に分注して、容器内に約 1 L (2 L) の培養懸濁液を残します (ステップ 2.17 で示した容量分注速度を使用するか、容器本体の目盛りマークから測定します)。フィードバッグを密封して完全に外します。
17. ステップ3.15で調製したばかりの消化液の袋をフィードチューブに溶接し、すべての内容物を容器に送り込みます。攪拌速度を45(40)rpmで開始します。温度制御が温度を37°Cに維持していることを確認してください。 マイクロキャリアは40〜60分以内に溶解します。滅菌ルアーロックシリンジで30分後に1 mLのサンプルを採取し、その後5〜10分ごとに明視野顕微鏡で観察し、マイクロキャリアの溶解を確認します。
18. マイクロキャリアが溶解した後、1つの3 L保存バッグ(15 Lバイオリアクター用の3 L保存バッグ2つ)をハーベストチューブに溶接し、ポンプ2を使用して300rpmで細胞懸濁液を完全にポンプで排出します。洗浄バッファーとして1%ヒト血清アルブミン(HSA)を含む生理食塩水1L(3.5L)と500 mLの完全SF培地(500 mLの細胞凍結保存バッファー、10%硫酸ジメチル(DMSO)の製剤および90%SF培地を例として取り上げます)を、他の液体移送の前のステップで述べた方法および付属品を使用して、別々の使い捨て保存袋に調製します。
19. 細胞処理システムの電源を入れ、メーカーの指示に従ってディスポーザブル細胞処理キットを装置に取り付け、細胞懸濁液、洗浄バッファー、およびSF培地(凍結保存バッファー)の袋をディスポーザブル細胞処理キットに溶接し、ユーザーインターフェースに表示されるすべての指示に注意深く従って、キットの完全性と適切なインストールを初期化および確認します。
20. インストールが完了したら、洗浄バッファーによる細胞洗浄とSF培地(凍結保存バッファー)への再懸濁に関する 表3 に記載されているパラメーターをソフトウェアに入力して、洗浄および再懸濁プロセスを開始します。手順全体は、いくつかの手動チェックポイントで自動的に実行されます。
21. 細胞処理システムの指示に従って遠心分離チャンバーから細胞のサンプルを採取し、メーカーの指示に従って自動細胞分析装置で細胞密度を計算します。再懸濁量を密度 2 x 10⁶ cells/mL、または最大総容量 250 mL に調整します。
22. システムが細胞をチャンバーから吸引した後、細胞転写バッグをディスポーザブル細胞処理キットから密封して外します。必要に応じて、細胞密度を2 x 10⁶ cells/mLに再調整し、SF培地を大きめの細胞移送バッグ/培地保存バッグに入れます。これらは、15 Lバイオリアクターの第2層膨張用のシードセルになります。

4. 細胞の調合、充填、仕上げ

1. 5 L バイオリアクターから細胞を採取する 1 日前に 15 L バイオリアクターの準備を開始します。プロトコルセクション2および3の手順に完全に従いますが、括弧内に示されている15 Lのパラメータは除きます。
2. 細胞を250 mLの凍結保存バッファーに再懸濁し、システムが細胞をチャンバーから吸引した後、細胞転写バッグを密封してディスポーザブル細胞処理キットから外します。
3. 2,000 mLの凍結保存バッファーと、ステップ4.2で再懸濁した細胞250 mLを3 Lの細胞トランスファーバッグに移します。このトランスファーバッグをディスポーザブルフィル&フィニッシュ消耗品キットに溶接します。
   注:ここで使用する凍結保存バッファーの追加容量は、ステップ3.21で得られた計数結果に従って、製剤の仕様と総細胞数の計算によって決定される必要があります
4. 使い捨て充填&仕上げ消耗部品キットをセル充填システムに組み立て、製造元の指示に従って予冷システムをオンにします。システムの指示に従い、20 mL/袋をバッチあたり合計20袋充填するように設定します。これらのバッグを密封してキットから外し、標準的な凍結保存手順に従ってください。凍結保存バッグを使用してください。
5. 新しい20個の凍結保存バッグのセットをDisposable Fill&Finish Consumable Kitに溶接し、すべての細胞が分注されるまで充填と仕上げの手順を繰り返します。標準的な手順に従って、これらの細胞を凍結保存します。

5. 細胞品質の特性評価

1. 溶解性マイクロキャリアから回収したhMSCをサンプリングし、文献¹⁸に記載の方法に従って細胞同一性を決定するために、フローサイトメトリーによる特性評価のために細胞プロセシングシステムを使用する。
2. 凍結保存された細胞を融解し、文献¹⁸に記載されている方法に従って、細胞形態および三系統分化能を含む細胞の特徴をさらに特徴付けるために、従来の2Dフラスコまたはマイクロプレートに再播種します。

6. 攪拌槽バイオリアクターにおけるG02マイクロキャリアのHEK293T拡大

1. ステップ2で説明したように、5Lのバイオリアクターを準備します。HEK293T細胞の場合は、W01の代わりに滅菌G02マイクロキャリアで細胞を培養します。培養プロセスはプロトコルセクション3と似ていますが、次の手順で詳述するように、いくつかのパラメータが異なります。HEK293T細胞の培養には灌流が必要なため、ブリードチューブの代わりに特殊な灌流チューブをバイオリアクターに取り付けます。
2. プロトコルセクション 3 で詳述したプロトコールとは異なり、5 L バイオリアクター用に 10% FBS を含む DMEM で 20 g の G02 マイクロキャリア(つまり、2 本のボトル)を調製し、0 日目の培養容量を 3.5 L(つまり、最終濃度約 5.71 g/L)に設定します。G02マイクロキャリアのボトル2本の前で2Lの培地を容器に分注し、500 mLの1.75 x 10⁹ HEK293T細胞を接種します(つまり、最終密度は5 x 10⁵ cells/mL)。
3. 撹拌レジームおよび培地交換レジーム(1日あたりの交換に必要な培地の量、1日あたりの培養量、CVDとして表される)を行うが、これはプロトコルセクション3とは異なり、 表4に詳述されている。
   注意: ポンプ1とポンプ2を手動で作動させて、両方が灌流が発生するために連続的にポンプで送ることができるようにします。ポンプの吐出速度のキャリブレーションに基づいて、灌流速度を満たすようにポンプ速度を毎日調整します。通常、これは 1 桁の範囲になります。HEK293T細胞の場合は、培地を循環させるhMSCとは異なり、新鮮な培地を飼料として使用し、使用済みの培地を完全に廃液ボトルに廃棄します。
4. 15 Lバイオリアクターへの第2層の拡張では、hMSCで使用されるマイクロキャリアの完全な溶解ではなく、HEK293T細胞のビーズ間転写を使用します。具体的には、所望の細胞密度に達した後、撹拌を停止してマイクロキャリアを沈殿させ、その後、できるだけ多くの上清を灌流チューブから吸引し、残りの懸濁液の3倍の容量でPBSを供給してマイクロキャリアを洗浄し、これを3回繰り返す。最終洗浄でできるだけ多くのPBSを吸引して廃棄します。
5. 3.5 L の 1x 組換えトリプシンを投入し、G02 マイクロキャリアをそのまま残したまま、細胞をマイクロキャリアから分離します。温度を37°C、撹拌速度を60rpmに設定します。細胞の80%以上が剥離したら、45分以内に同量の完全培地で剥離を終了します。
6. 収穫港から準備された15Lの容器に直接移し替えて、2段目の拡張を行います。

7. 撹拌槽バイオリアクターにおけるV01マイクロキャリア上のVero細胞の増殖

1. 凍結乾燥したマイクロキャリアをPBSとともにバイオリアクター容器に移し、20 mg/mLの濃度でV01マイクロキャリアを調製します。プロトコルセクション2に記載されているように容器を組み立てて滅菌しますが、代わりに30分間オートクレーブします。
2. 滅菌後、V01マイクロキャリアは自然に沈降します。ブリードチューブとフィードチューブを使用して上清を塩基性DMEMと2回交換し、10%NBSを含む完全なDMEMを容器容量の50%〜75%に添加してから、細胞接種および培養のためのプロトコルセクション3に進みます。
3. プロトコルセクション3に詳述されているプロトコールとは異なり、Vero細胞の4 L培養(すなわち、最終濃度6 g/L)に24 gのV01マイクロキャリアを使用し、4 x 10⁹ Vero細胞の500 mLを接種します(すなわち、1 x 10⁶ cells/mLの最終密度で)。
4. ステップ 6.3-6.6 に従って、培養プロセスパラメータと 15 L 攪拌タンクバイオリアクターでの 2 層目の膨張への継代を行います。

結果

ACISCPプラットフォームは、スケールアップ拡張のための一連の攪拌タンクバイオリアクター、自動細胞回収および製剤のための細胞処理システム、および細胞充填システムを採用した完全閉鎖システムです(図1)。接着細胞は多孔質マイクロキャリアに付着し、バイオリアクター内に分散させることで、接着細胞の懸濁培養を実現します。

記載のプ?...

ディスカッション

免疫療法と幹細胞療法はどちらも、生細胞を薬剤として利用します。ただし、それらの最終生成物は、低分子やウイルスと同じ方法で精製または滅菌されるべきではありません。したがって、Quality by Design(QbD)の原則を常に念頭に置き、セル製造中の化学品製造および制御(CMC)プロセスに実際に適用する必要があります²³。完全閉鎖細胞培養システム、ならびに処理システム?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin EDTA	BasalMedia	S310JV	Used for 2D cell harvest.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free Medium	CytoNiche Biotech	RMZ112	This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration Module	CytoNiche Biotech	R020-00-10	This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cells	CytoNiche Biotech	vivaPACK	This system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing system	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	This system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing Kit	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (single-use packaging); W01-200 (tablets)	These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 Antibody	BioLegend	368512	Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining Kit	Dojindo	C542	Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)	Saint-Gobain	374-250-3	Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Used for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Used for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)	DWK life sciences	218016357	Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)	DWK life sciences	218017353	Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior quality	Wisent	086-150	Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 Antibody	BioLegend	301804	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 Antibody	BioLegend	343504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometry	Beckman Coulter	CytoFLEX	Used for cell identity assessment.
Fluorescence Cell Analyzer	Alit life science	Countstar Rigel S2	Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports	DWK life sciences	292632806	Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose Meter	Sinocare	6243578	Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesium	Gibco	14025092	Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Used for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscope	OLYMBUS	CKX53SF	Used for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Used for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfine	MINHAI BIO	SC101.02	Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90031	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90041	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kit	Cyagen	HUXUC-90021	Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 Antibody	BioLegend	800504	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 Antibody	BioLegend	302208	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344004	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307605	Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Wisent	311-010-CL	Used in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Used for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile Saline	Hopebiol	HBPP008-500	Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant Trypsin	BasalMedia	S342JV	This reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube Sealer	Yingqi Biotech	Tube Sealer I	This sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubing	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Used for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubing	Yingqi Biotech	Tube Welder I-V2	Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.