Fabricación de células T con receptor de antígeno quimérico en un procesador celular automatizado

Resumen

En este artículo se detalla el proceso de fabricación de linfocitos T receptores de antígenos quiméricos para uso clínico, concretamente utilizando un procesador celular automatizado capaz de realizar la transducción viral y el cultivo de linfocitos T. Proporcionamos recomendaciones y describimos los escollos que deben tenerse en cuenta durante el desarrollo del proceso y la implementación de un ensayo clínico de fase inicial.

Resumen

Los linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR) representan un enfoque inmunoterapéutico prometedor para el tratamiento de diversas enfermedades malignas y no malignas. Las células CAR-T son células T modificadas genéticamente que expresan una proteína quimérica que reconoce y se une a una diana de la superficie celular, lo que provoca la muerte de la célula diana. Los métodos tradicionales de fabricación de células CAR-T requieren mucha mano de obra, son costosos y pueden conllevar el riesgo de contaminación. El CliniMACS Prodigy, un procesador celular automatizado, permite fabricar productos de terapia celular a escala clínica en un sistema cerrado, minimizando el riesgo de contaminación. El procesamiento se produce de forma semiautomática bajo el control de un ordenador y, por lo tanto, minimiza la participación humana en el proceso, lo que ahorra tiempo y reduce la variabilidad y los errores.

Este manuscrito y video describe el proceso de transducción de células T (TCT) para la fabricación de células CAR-T utilizando este procesador. El proceso TCT implica el enriquecimiento, la activación, la transducción con un vector viral, la expansión y la cosecha de células T CD4+/CD8+. Usando la Matriz de Actividades, una funcionalidad que permite ordenar y cronometrar estos pasos, el proceso TCT se puede personalizar ampliamente. Proporcionamos un recorrido por la fabricación de células CAR-T de conformidad con las Buenas Prácticas de Fabricación (cGMP) actuales y analizamos las pruebas de liberación requeridas y los experimentos preclínicos que respaldarán una solicitud de nuevo fármaco en investigación (IND). Demostramos la viabilidad y discutimos las ventajas y desventajas de utilizar un proceso semiautomático para la fabricación clínica de células CAR-T. Por último, describimos un ensayo clínico en curso iniciado por un investigador que se dirige a las neoplasias malignas de células B pediátricas [NCT05480449] como ejemplo de cómo se puede aplicar este proceso de fabricación en un entorno clínico.

Introducción

La transferencia adoptiva de linfocitos T modificados para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) ha demostrado una eficacia notable en el tratamiento de pacientes con neoplasias malignas de linfocitos B refractarias 1,2,3,4,5. Sin embargo, los métodos tradicionales de fabricación de las células CAR-T requieren mucha mano de obra, mucho tiempo y técnicos altamente capacitados para llevar a cabo pasos altamente especializados. Por ejemplo, el proceso de fabricación tradicional de un producto autólo....

Protocolo

Toda la investigación se realizó de acuerdo con las directrices institucionales con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) del hospital, y todos los sujetos han dado su consentimiento informado para la publicación de los datos recopilados en el contexto del ensayo.
NOTA: La primera sección del Protocolo proporciona una visión general de alto nivel del proceso de fabricación de CAR-T. Las secciones restantes proporcionan las instrucciones paso a paso. El protocolo describe el flujo de trabajo utilizando la versión 1.4 del software TCT, que es la versión actual en el momento de escribir este artículo. La interfaz de usuario de otras versiones del s....

Discusión

La terapia de células CAR-T se ha convertido en un enfoque de tratamiento prometedor para las células B y otras neoplasias malignas. Sin embargo, los métodos tradicionales de fabricación de células CAR-T tienen varias limitaciones, como el alto costo, la producción intensiva en mano de obra y los pasos abiertos que aumentan el riesgo de contaminación. Recientemente, han surgido varias plataformas semiautomatizadas, incluida Miltenyi CliniMACS Prodigy (el "procesador"), para abordar estas limitaciones. El proceso d.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 x 75 borosilicate tubes	Charles River	TL1000
20 mL Reagent Bag	Miltenyi Biotec	170-076-631
50 mL Conical Tube	Fisher	05-539-10
150 mL Transfer Set	Fenwal	4R2001
2,000 mL Transfer Set	Fenwal	4R2041
7AAD	Fisher Scientific	BDB559925
Alcohol Prep	Tyco/Healthcare
Bag Access	Medline	2300E-0500
CD19 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-643
CD19 CAR Detection Reagent Biotin	Miltenyi Biotec	130-129-550
CD19 PE	BD	555413
CD3 APC	BD	340440
CD4 VioBright FITC REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-229
CD45 VioBlue REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-637
CD8 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-681
Cellometer Reference Beads 10um	Nexcelom	B10-02-020
Cellometer Reference Beads 15um	Nexcelom	B15-02-010
Cellometer Reference Beads 5um	Nexcelom	B05-02-050
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
CliniMACS CD4 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	276-01	The CD4 reagent
CliniMACS CD8 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	275-01	The CD8 reagent
CliniMACS PBS/EDTA Buffer	Miltenyi Biotec	130-021-201	The buffer
DMSO	Origen	CP-10
Freezing Bag 50 mL	Miltenyi Biotec	200-074-400
Freezing Vial, 1.8 mL	Nunc	12565171N
Freezing Vial, 4.5 mL	Nunc	12565161N
Human AB serum	Valley Biomedical		Sterile filtered, heat inactivated
Human Serum Albumin 25%	Grifols	68516-5216-1
Human Serum Albumin 5%	Grifols	68516-5214-1
MACS GMP Recombinant Human IL-2	Miltenyi Biotec	170-076-148	The cytokines
MACS GMP T Cell TransAct	Miltenyi Biotec	200-076-202	The activation reagent
MycoSeq Mycoplasma Detection Kit	Life Technologies	4460623
Needles, Hypodermic 14G	Medline	SWD200573
Needles, SlideSafe 18G	BD	B-D305918
Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492209
Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492225
Pipets 10 mL	Fisher	13-678-27F
Pipets 25 mL	Fisher	13-675-30
Pipets 5 mL	Fisher	13-678-27E
Plasmalyte-A	Baxter	2B2544X	The electrolyte solution
Prodigy TS520 Tubing Set	Miltenyi Biotec	170-076- 600	The tubing set
Sterile Field	Medline	NON21001
Streptavidin PE-Vio770	Miltenyi Biotec	130-106-793
Syringe 1 mL	BD	309628
Syringe 10 mL	BD	302995
Syringe 3 mL	BD	309657
Syringe 30 mL	BD	302832
Syringe 50 mL	BD	309653
TexMACS GMP Medium	Miltenyi Biotec	170-076-306	The medium
Triple Sampling Adapter	Miltenyi Biotec	170-076-609
Viral Vector	CHOP Clinical Vector Core		huCART19
Equipment
Biological Safety Cabinet	The Baker Co
Cellometer Auto 2000	Nexcelom
CliniMACS Prodigy	Miltenyi Biotec	200-075-301	The processor
Controlled Rate Freezer	Planer/Kryosave
Endosafe nexgen-PTS150K	Charles River
Mettler Balance	Mettler
Refrigerated Centrifuge	Thermo Fisher
Refrigerated Centrifuge	Fisher Sci
SCD Sterile Tubing Welder	Terumo
Sebra Tube Sealer	Sebra
Varitherm	Barkey		The dry thaw device
XN-330 Hematology Analyzer	Sysmex