Herstellung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf einem automatisierten Zellprozessor

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt den Herstellungsprozess für chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen für den klinischen Einsatz, insbesondere unter Verwendung eines automatisierten Zellprozessors, der in der Lage ist, virale Transduktion und Kultivierung von T-Zellen durchzuführen. Wir geben Empfehlungen und beschreiben Fallstricke, die bei der Prozessentwicklung und Durchführung einer frühen klinischen Studie berücksichtigt werden sollten.

Zusammenfassung

Chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen stellen einen vielversprechenden immuntherapeutischen Ansatz für die Behandlung verschiedener maligner und nicht-maligner Erkrankungen dar. CAR-T-Zellen sind genetisch veränderte T-Zellen, die ein chimäres Protein exprimieren, das ein Ziel auf der Zelloberfläche erkennt und daran bindet, was zur Abtötung der Zielzelle führt. Herkömmliche Methoden zur Herstellung von CAR-T-Zellen sind arbeitsintensiv, teuer und können das Risiko einer Kontamination bergen. Der CliniMACS Prodigy, ein automatisierter Zellprozessor, ermöglicht die Herstellung von Zelltherapieprodukten im klinischen Maßstab in einem geschlossenen System, wodurch das Risiko einer Kontamination minimiert wird. Die Verarbeitung erfolgt halbautomatisch unter der Steuerung eines Computers und minimiert so die menschliche Beteiligung am Prozess, was Zeit spart und Variabilität und Fehler reduziert.

Dieses Manuskript und Video beschreibt den T-Zell-Transduktionsprozess (TCT) zur Herstellung von CAR-T-Zellen mit diesem Prozessor. Der TCT-Prozess umfasst die Anreicherung, Aktivierung, Transduktion mit einem viralen Vektor, Expansion und Ernte von CD4+/CD8+ T-Zellen. Mit Hilfe der Activity Matrix, einer Funktionalität, die die Reihenfolge und das Timing dieser Schritte ermöglicht, kann der TCT-Prozess umfangreich angepasst werden. Wir bieten einen Überblick über die Herstellung von CAR-T-Zellen in Übereinstimmung mit der aktuellen Good Manufacturing Practice (cGMP) und besprechen die erforderlichen Freisetzungstests und präklinischen Experimente, die einen IND-Antrag (Investigational New Drug) unterstützen. Wir demonstrieren die Machbarkeit und diskutieren die Vor- und Nachteile eines halbautomatischen Prozesses für die klinische Herstellung von CAR-T-Zellen. Abschließend beschreiben wir eine laufende, von Prüfärzten initiierte klinische Studie, die auf pädiatrische B-Zell-Malignome abzielt [NCT05480449] als Beispiel dafür, wie dieses Herstellungsverfahren in einem klinischen Umfeld angewendet werden kann.

Einleitung

Der adoptive Transfer von T-Zellen, die einen chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren, hat eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei der Behandlung von Patienten mit refraktären B-Zell-Malignomen gezeigt 1,2,3,4,5. Die traditionellen Herstellungsmethoden für CAR-T-Zellen sind jedoch arbeitsintensiv, zeitaufwändig und erfordern hochqualifizierte Techniker, um hochspezialisierte Schritte durchzuführen. Der traditionelle Herstellungsprozess eines autologen CAR-T-Zellprodukts umfasst beispielsweise Dichtegradiente....

Protokoll

Alle Forschungsarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien mit Genehmigung durch das Institutional Review Board (IRB) des Krankenhauses durchgeführt, und alle Probanden haben ihre Einwilligung zur Veröffentlichung der im Rahmen der Studie gesammelten Daten gegeben.
ANMERKUNG: Der erste Abschnitt des Protokolls bietet einen allgemeinen Überblick über den CAR-T-Herstellungsprozess. Die restlichen Abschnitte enthalten die Schritt-für-Schritt-Anleitungen. Das Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf unter Verwendung der TCT-Softwareversion 1.4, der aktuellen Version zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Artikels. Die Benutzeroberfläche anderer V....

Diskussion

Die CAR-T-Zelltherapie hat sich zu einem vielversprechenden Behandlungsansatz für B-Zell- und andere Malignome entwickelt. Herkömmliche Herstellungsmethoden für CAR-T-Zellen weisen jedoch mehrere Einschränkungen auf, wie z. B. hohe Kosten, arbeitsintensive Produktion und offene Schritte, die das Kontaminationsrisiko erhöhen. In jüngster Zeit sind mehrere halbautomatische Plattformen, darunter der Miltenyi CliniMACS Prodigy (der "Prozessor"), aufgetaucht, um diese Einschränkungen zu beheben. Der T-Zell-Transduktion.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 x 75 borosilicate tubes	Charles River	TL1000
20 mL Reagent Bag	Miltenyi Biotec	170-076-631
50 mL Conical Tube	Fisher	05-539-10
150 mL Transfer Set	Fenwal	4R2001
2,000 mL Transfer Set	Fenwal	4R2041
7AAD	Fisher Scientific	BDB559925
Alcohol Prep	Tyco/Healthcare
Bag Access	Medline	2300E-0500
CD19 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-643
CD19 CAR Detection Reagent Biotin	Miltenyi Biotec	130-129-550
CD19 PE	BD	555413
CD3 APC	BD	340440
CD4 VioBright FITC REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-229
CD45 VioBlue REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-637
CD8 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-681
Cellometer Reference Beads 10um	Nexcelom	B10-02-020
Cellometer Reference Beads 15um	Nexcelom	B15-02-010
Cellometer Reference Beads 5um	Nexcelom	B05-02-050
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
CliniMACS CD4 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	276-01	The CD4 reagent
CliniMACS CD8 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	275-01	The CD8 reagent
CliniMACS PBS/EDTA Buffer	Miltenyi Biotec	130-021-201	The buffer
DMSO	Origen	CP-10
Freezing Bag 50 mL	Miltenyi Biotec	200-074-400
Freezing Vial, 1.8 mL	Nunc	12565171N
Freezing Vial, 4.5 mL	Nunc	12565161N
Human AB serum	Valley Biomedical		Sterile filtered, heat inactivated
Human Serum Albumin 25%	Grifols	68516-5216-1
Human Serum Albumin 5%	Grifols	68516-5214-1
MACS GMP Recombinant Human IL-2	Miltenyi Biotec	170-076-148	The cytokines
MACS GMP T Cell TransAct	Miltenyi Biotec	200-076-202	The activation reagent
MycoSeq Mycoplasma Detection Kit	Life Technologies	4460623
Needles, Hypodermic 14G	Medline	SWD200573
Needles, SlideSafe 18G	BD	B-D305918
Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492209
Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492225
Pipets 10 mL	Fisher	13-678-27F
Pipets 25 mL	Fisher	13-675-30
Pipets 5 mL	Fisher	13-678-27E
Plasmalyte-A	Baxter	2B2544X	The electrolyte solution
Prodigy TS520 Tubing Set	Miltenyi Biotec	170-076- 600	The tubing set
Sterile Field	Medline	NON21001
Streptavidin PE-Vio770	Miltenyi Biotec	130-106-793
Syringe 1 mL	BD	309628
Syringe 10 mL	BD	302995
Syringe 3 mL	BD	309657
Syringe 30 mL	BD	302832
Syringe 50 mL	BD	309653
TexMACS GMP Medium	Miltenyi Biotec	170-076-306	The medium
Triple Sampling Adapter	Miltenyi Biotec	170-076-609
Viral Vector	CHOP Clinical Vector Core		huCART19
Equipment
Biological Safety Cabinet	The Baker Co
Cellometer Auto 2000	Nexcelom
CliniMACS Prodigy	Miltenyi Biotec	200-075-301	The processor
Controlled Rate Freezer	Planer/Kryosave
Endosafe nexgen-PTS150K	Charles River
Mettler Balance	Mettler
Refrigerated Centrifuge	Thermo Fisher
Refrigerated Centrifuge	Fisher Sci
SCD Sterile Tubing Welder	Terumo
Sebra Tube Sealer	Sebra
Varitherm	Barkey		The dry thaw device
XN-330 Hematology Analyzer	Sysmex