Ensayo de trombosis venosa en un modelo de cáncer en ratones

Resumen

Este artículo tiene como objetivo presentar un método optimizado para evaluar la trombosis venosa en un modelo de cáncer de ratón, utilizando clips vasculares para lograr la ligadura venosa. La optimización minimiza la variabilidad en las mediciones relacionadas con la trombosis y mejora la relevancia para la trombosis venosa asociada al cáncer humano.

Resumen

En este trabajo metodológico se destacan los matices quirúrgicos de un modelo de trombosis venosa en roedores, específicamente en el contexto de la trombosis asociada al cáncer (TAC). La trombosis venosa profunda es una complicación común en los sobrevivientes de cáncer y puede ser potencialmente mortal. Los modelos actuales de trombosis venosa murina suelen implicar una oclusión mecánica completa o parcial de la vena cava inferior (VCI) mediante una sutura. Este procedimiento induce una estasis total o parcial de la sangre y daño endotelial, desencadenando la trombogénesis. Los modelos actuales tienen limitaciones, como una mayor variabilidad en el peso de los coágulos, una tasa de mortalidad significativa y una curva de aprendizaje prolongada. Este informe presenta mejoras quirúrgicas utilizando clips vasculares para abordar algunas de estas limitaciones. Utilizando un modelo de ratón de xenoinjerto de cáncer de colon singénico, empleamos clips vasculares personalizados para ligar la vena cava infrarrenal. Estos clips permiten un espacio labial residual similar a una sutura de polipropileno 5-0 después de las ligaduras de VCI. Los ratones con el método de sutura sirvieron como controles. El método de clip vascular dio lugar a una oclusión vascular parcial consistente y reproducible y a un mayor peso de los coágulos con menos variabilidad que el método de sutura. Se esperaba que los pesos de coágulos más grandes, la mayor masa de coágulos y el coágulo en el área de superficie luminal de la VCI se deban al perfil de presión más alto de los clips vasculares en comparación con una sutura de polipropileno 6-0. El abordaje se validó mediante ecografía en escala de grises, que reveló una masa de coágulo consistentemente mayor en la vena cava infrarrenal con clips vasculares en comparación con el método de sutura. Estas observaciones se corroboraron aún más con la tinción de inmunofluorescencia. Este estudio ofrece un método mejorado para generar un modelo de trombosis venosa en ratones, que puede emplearse para profundizar en la comprensión mecanicista de la TAC y en la investigación traslacional, como el descubrimiento de fármacos.

Introducción

Tromboembolismo venoso asociado al cáncer (TEV)
El riesgo de tromboembolismo venoso (TEV) es de 4 a 7 veces mayor en los supervivientes de cáncer en comparación con la población general ^1,2,3. Esta afección resulta mortal en uno de cada siete pacientes con cáncer. La incidencia de TEV varía según el tipo de cáncer y la carga tumoral, y es mayor entre los pacientes con cáncer de páncreas y gástrico⁴.

El TEV asociado al cáncer en pacientes con cáncer tiene importancia pronóstica. Se asocia con una supervivencia general desfavorable en el primer año después de un diagnóstico de cáncer, incluso después de ajustar por edad, raza y estadio del cáncer subyacente⁵. Estos hallazgos ponen de relieve la importancia de examinar el TEV asociado al cáncer y la necesidad de investigar su mecanismo utilizando un modelo animal. La relevancia traslacional de esta área se acentúa aún más por el hecho de que el TEV en pacientes con cáncer es prevenible y tratable con tromboprofilaxis y terapia antitrombótica⁶.

Modelos animales de cáncer y trombosis venosa
Los modelos de cáncer se denominan convencionalmente xenoinjertos, que implican la inyección de células cancerosas en ratones. La inyección de células cancerosas en un sitio similar a su origen se conoce como modelo ortotópico, mientras que en un sitio diferente (plano subcutáneo sobre el flanco) se conoce como modelo heterotópico. La especie de origen de las células cancerosas las determina como modelo alogénico, como la línea celular HT-29 (cáncer de colon humano)^7,8,9. Por el contrario, los modelos singénicos utilizan las líneas celulares de cáncer murino, incluidas las líneas celulares RenCa y MC-38 ^3,10.

La literatura ha descrito modelos de trombosis arterial, venosa y capilar en roedores. La trombosis venosa es inducida en la vena cava inferior (VCI) por lesión mecánica (alambre guía) o ligadura completa de la VCI, química (cloruro férrico) o lesión electrolítica. La trombosis inducida por cloruro férrico o ligadura de VCI representa modelos de oclusión completa. Esto último resulta en la estasis de la sangre y los infiltrados inflamatorios en las venas^11,12,13. El modelo de ligadura completa da como resultado una alta tasa de formación de trombosis en el 95% al 100% de los ratones. El modelo de ligadura parcial de la VCI puede incluir la interrupción de las ramas iliolumbares laterales, y el retorno venoso se anula mediante la aplicación de ligaduras de sutura en los puntos diana distales de la VCI¹². A veces, se utiliza un soporte de espacio para interrumpir parcialmente el retorno venoso. Sin embargo, el peso del trombo es inconsistente en el modelo actual de oclusión parcial, resultando en una alta variabilidad en el peso de los coágulos y en las alturas^12,14.

Ambos modelos mecánicos de vetas grandes (parcial y completa) tienen limitaciones. En primer lugar, la ligadura de la VCI (modelo de estasis) suele provocar hipotensión. La sangre se desvía a través de las venas vertebrales. Aunque en manos experimentadas, la mortalidad con este modelo oscila entre el 5% y el 30%, y la tasa más alta se espera durante la curva de aprendizaje. Es importante destacar que el modelo de oclusión completa no reproduce la trombosis venosa profunda (TVP) en humanos, donde un trombo suele ser no oclusivo. Es probable que la oclusión completa altere los factores hemorreológicos y los parámetros farmacodinámicos, alterando la biodisponibilidad de los compuestos en el sitio local. Debido a estas limitaciones, los modelos de oclusión completa pueden no ser óptimos para probar nuevos compuestos químicos con fines terapéuticos y descubrimientos de fármacos¹².

Cabe señalar que para proporcionar un modelo murino clínicamente más relevante de trombosis venosa con flujo disminuido con daño endotelial, se ha introducido un modelo de trombosis venosa, donde la TVP se desencadena por la restricción del flujo sanguíneo en ausencia de disrupción endotelial. El modelo fue validado por microscopía electrónica de barrido¹⁵. Un modelo de trombosis clínicamente relevante preferido es aquel con trombosis casi completa que permite el descubrimiento de fármacos. La formación de coágulos en los modelos actuales de oclusión parcial es inconsistente, resultando en una alta variabilidad en el peso y la altura del coágulo^12,16. Además, el peso del coágulo es variable con los métodos convencionales, requiriendo más ratones por estudio¹².

Los modelos anteriores de trombosis asociada al cáncer se centraron en el cáncer de colon, páncreas y pulmón y todos fueron modelos de oclusión completa^17,18,19. Este manuscrito modifica el modelo de trombosis de oclusión parcial para proporcionar coágulos con menor variabilidad y mortalidad en ratones (Figura 1). Estudios anteriores utilizaron líneas celulares de cáncer alogénico en ratones atímicos inmunodeprimidos 19,20,21. Este manuscrito utiliza un xenoinjerto singénico de células MC-38 en ratones C57Bl6/J, que permite el uso de ratones inmunocompetentes y el examen de componentes inmunes a la trombogénesis.

Protocolo

Para este estudio, se utilizaron 16 ratones hembra C57Bl6/J, de 8 a 12 semanas de edad y un peso corporal de 20 a 25 g. Los ratones fueron alojados en condiciones estándar y fueron alimentados con comida y agua ad libitum. Este estudio se realizó con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Boston. Los procedimientos abiertos descritos aquí se llevaron a cabo en condiciones estériles.

1. Modelo de xenoinjerto

1. Cultivo celular
   1. Antes de la implantación subcutánea heterotópica, cultivar células MC-38 como una monocapa hasta una confluencia del 80%.
   2. Después de la tripsinización y la resuspensión en medios que contienen FBS al 10%, centrifugue las células a 277 x g, 4 °C durante 5 min. A continuación, vuelva a suspender las células en medios sin suero hasta una concentración de 1 x 10⁴ células MC-38/μL de medios sin suero.
      1. Para la tripsinización, cultive las células MC-38 hasta que alcancen la confluencia deseada (generalmente alrededor del 70%-80%) y luego aspire el medio de cultivo de la placa de Petri.
      2. Añadir 1 ml de solución de tripsina-EDTA e incubar las células con tripsina durante 1 min a 37 °C para permitir el desprendimiento. Golpee o agite suavemente la placa de Petri para asegurar un desprendimiento uniforme.
      3. Añadir un medio de cultivo que contenga suero o un inhibidor de tripsina para neutralizar la actividad y evitar una mayor disociación celular. Recoja las células desprendidas junto con la solución de tripsina neutralizada.
      4. Para la resuspensión, una vez que las células se desprenden a través de la tripsinización, prepáralas para el trasplante o otros experimentos. Centrifugar la suspensión celular recolectada a 277 x g para granular las células.
      5. Retire con cuidado el sobrenadante (líquido sobre el gránulo de la célula). Agregue 9 ml de medio de cultivo, tampón o solución al gránulo celular para lograr la concentración celular deseada para trasplante o experimentación.
      6. Resuspenda suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo o usando un agitador de matraz de cultivo. Evite el pipeteo vigoroso que podría dañar las células.
         NOTA: Dependiendo de la variante o línea celular utilizada, las células pueden resuspenderse en una proporción de 1:1 de matriz de membrana basal solubilizada y medios libres de suero para ralentizar el crecimiento y la diseminación de células de ratón altamente agresivas después de la implantación. Todos los pasos del cultivo celular deben llevarse a cabo en una campana aséptica completa en un espacio específicamente asignado al cultivo celular y se sometieron a pruebas periódicas para detectar micoplasma.
   3. Cuente las celdas con un contador de celdas automatizado según el protocolo manual proporcionado.
2. Implantación celular
   1. Asigne aleatoriamente ocho ratones al grupo experimental y ocho ratones al grupo de control de la siguiente manera. En el grupo control, utilizar ratones con xenoinjerto MC38 y realizar la ligadura de la VCI con una sutura de polipropileno 5-0. En el grupo experimental, utilizar ratones con xenoinjerto MC38 y realizar la ligadura de la VCI con un clip vascular personalizado.
   2. Coloque al ratón en decúbito lateral izquierdo y afeite el lado derecho entre las extremidades anteriores y traseras. Aplique alcohol y yodo a lo largo de la zona lumbar dorsal para preparar asépticamente la zona para la inyección.
   3. Inyectar 2 x 10⁶ células MC-38 preparadas en 200 μL de medio por vía subcutánea en el flanco, a medio camino entre la costilla más distal del animal y la eminencia pélvica utilizando una aguja de 27G mientras se sujeta suavemente al animal con la mano no dominante.
   4. Después de la inyección, inspeccione cuidadosamente a los animales y vuelva a colocarlos en la jaula. Los animales deben ser inspeccionados para lo siguiente; 1. Cambios en el comportamiento, los niveles de actividad y la movilidad general de los ratones. Cualquier cambio significativo podría indicar malestar o problemas de salud. 2. La condición física general de los ratones, incluida la calidad del pelaje, los hábitos de aseo y cualquier signo visible de angustia o anomalías. Volver al consumo de alimentos y a la ingesta de agua 4. Cualquier cambio en su nivel de actividad, postura o interacciones con sus compañeros de jaula. El letargo o el aumento de la agresión pueden ser signos de angustia.

2. Seguimiento del crecimiento tumoral

1. Monitoree a los animales cada dos semanas para detectar las tendencias de crecimiento del tumor durante 3-4 semanas. Mida los tumores con un calibrador y registre las dimensiones del tumor.
   1. Mida los tumores a lo largo de su eje más largo (L) y el eje perpendicular al eje largo (W). Calcular el volumen tumoral (V) mediante la ecuación L x (W²) = V. Si el tamaño del tumor supera los 20 mm en cada dimensión y/o el tumor tiene evidencia de ulceración, sacrificar a los animales antes de la finalización del experimento.
2. Una vez que el volumen tumoral alcance los 400^mm3, planifique el uso de los ratones para la ligadura de la VCI.

3. Anestesia y preparación

1. Anestesiar al ratón en una cámara de isoflurano e inyectar el analgésico por vía subcutánea: Sujetar al animal desde la base de la cola. Mantenga al animal sobre la superficie del dorso de la mano no dominante.
2. Trasladar al animal a la cámara de inducción anestésica continua llena de isoflurano al 3%-4%. Confirmar una anestesia general adecuada con la ausencia de un reflejo de pellizco en los dedos de los pies. Utilizar una dosis de mantenimiento de isoflurano al 1%-3%. Aplica ungüento veterinario en ambos ojos.
3. Inyección subcutánea con buprenorfina (opioide para mitigar el dolor): Disolver el stock de buprenorfina a una concentración de 0,3 mg/ml en cloruro de sodio (NaCl) al 0,9% para alcanzar la concentración de 0,03 mg/ml.
4. Inyectar una dosis de 0,05-0,1 mg/kg de 0,03 mg/ml de buprenorfina junto con 500 μl de NaCl estéril al 0,9% por vía subcutánea antes de la cirugía. En un ratón de 20 g se requiere una cantidad de 2 μg o 66 μL de 0,03 mg/ml de buprenorfina.
5. Preparación de la piel: Coloque el ratón completamente anestesiado en posición supina sobre la manta térmica. Desinfectar la zona abdominal anterior con tintura de clorhexidina al 0,5%, 2x. Verifique con frecuencia la temperatura de la manta térmica durante el procedimiento y asegúrese de que la temperatura no baje.

4. Ligadura de la VCI

1. Laparotomía de línea media
   1. Incidir la piel abdominal con unas tijeras finas desde la eminencia xifoides hasta la vejiga. Pellizque el peritoneo hasta la mitad de la incisión cutánea con pinzas atraumáticas. Asegure un espacio adecuado entre la incisión y los intestinos suprayacentes (Figura 2A).
   2. Abrir el peritoneo de forma longitudinal junto con la línea alba avascular.
2. Exteriorización de los intestinos hacia el lado abdominal derecho
   1. Tire de los intestinos con puntas de algodón mojadas. Cubra los intestinos con una gasa estéril completamente húmeda. Asegúrese de que los intestinos cubiertos estén en una dirección libre de tracción sin ninguna tracción excesiva en los vasos mesentéricos.
3. Exposición completa de la VCI y las ramas, incluida la confluencia de la vena renal izquierda a la VCI (Figura 2B).
   1. Dejar caer 200-300 μL de solución salina normal. Explorar el curso de los uréteres, la VCI, la aorta y las venas renales (Figura 2).
4. Plano avascular en el punto de confluencia de la VCI infrarrenal y la confluencia de la vena renal izquierda.
   1. Pasar la sutura de polipropileno 6-0 a través del plano avascular suavemente 2x-3x con movimientos caudales a cefálicos con la punta cerrada pinzas atraumáticas.
   2. Asegúrese de que cualquier supuración mínima se controle con una presión suave proporcionada con un taponamiento con punta de algodón. Ensanchar el plano provisto pasando la sutura de polipropileno 6-0 con suaves movimientos caudales a craneales.
5. Cauterización de las ramas gonadal y lumbar (Figura 2D)
   1. Puede haber hasta 4 ramas posteriores o lumbares. Para evitar posibles complicaciones de isquemia espinal y claudicación, deje intactas las ramas lumbares en el protocolo actual.
   2. Verifique que estén presentes de 2 a 3 ramas laterales, incluido el asta uterina bilateral, el suministro arterial y los vasos hipogástricos. Asegurar la interrupción constante de las primeras sucursales bilateralmente presentes. Cauterizar las ramas bilaterales justo distales a la confluencia de la vena renal izquierda y la VCI (VCI infrarrenal). Asegúrese de que los vasos de drenaje venoso del asta uterina no se interrumpan.
      NOTA: Se opta por la cauterización de ramas laterales porque este método proporciona una superficie lisa e ininterrumpida, lo que reduce cualquier posibilidad de sangrado incontrolado. Además, la cauterización es más rápida y factible que la ligadura de suturas con suturas 10-0. Por lo tanto, los animales estarán expuestos a un procedimiento más corto y seguro.
6. Vuelva a verificar el curso de los uréteres y la vasculatura para asegurarse de que no haya supuración o cauterización inadvertida (Figura 2C).
7. Ligadura de VCI con clips vasculares en el grupo experimental
   1. Personaliza las pinzas vasculares con un ancho de sutura de nylon 2-0 mediante pinzas atraumáticas. Aplicar los clips vasculares personalizados en el grupo experimental circunferencialmente alrededor de la VCI infrarrenal.
   2. Aplique las pinzas vasculares sobre la sutura. El pasaje primario de la sutura proporciona un plano avascular suficiente con dos o tres movimientos meticulosos de caudal a craneal (Figura 2E-F).
   3. A continuación, pase los clips vasculares a través del plano preparado. Prepare el plano en la confluencia de la vena renal izquierda y la VCI lo suficientemente ancha como para permitir un paso de clip sin incidentes (Figura 2E).
   4. Coloque la pinza vascular personalizada horizontalmente, perpendicular a la línea de la VCI, a través del plano preparado. Coloque los clips vasculares sobre la sutura de polipropileno 5-0 para asegurar un espacio restante adecuado (Figura 2G).
   5. Asegúrese de que los pasos anteriores se realicen con cuidado para evitar cualquier daño o sangrado en los vasos sanguíneos en el sitio de los clips vasculares. Observe el campo quirúrgico en busca de posibles supuraciones. Aplique una presión suave con la punta de algodón sobre el campo quirúrgico en caso de supuración.
8. Ligadura de VCI con sutura en el grupo control
   1. Ligadura de sutura con sutura de polipropileno 6-0. Realice una sutura quirúrgica de nudo cuadrado alrededor de la VCI infrarrenal en el plano preparado sobre una sutura de seda 5-0.
   2. Una vez que la sutura esté completa, retire suavemente la sutura de seda para asegurar un espacio remanente adecuado.
9. Realizar inyección subcutánea de 200 μL de solución salina normal.
   NOTA: Para proporcionar una técnica comparable para la oclusión parcial de la VCI con la aplicación de pinzas, el clip vascular se personaliza en el estudio actual para proporcionar espacio entre los labios. A continuación, se coloca el clip vascular en el plano avascular preparado en la confluencia de la vena renal izquierda y la VCI.
10. Cerrar la laparotomía con sutura vicryl 4-0 de corrido continuo.

5. Seguimiento después de la cirugía índice

1. Monitoree al animal continuamente después de la operación durante 1 h o hasta que se recupere el equilibrio y la capacidad de enderezamiento, lo que ocurra primero en una jaula limpia aislada hasta que se recupere por completo.
2. Vigile al animal diariamente durante 2 días. Si el animal se ve angustiado, vigílelo dos veces al día durante 2 días. Administrar analgesia postoperatoria y líquidos según protocolo.
   1. Disolver el caldo de buprenorfina con una concentración de 0,3 mg/ml en cloruro de sodio (NaCl) al 0,9% para alcanzar la concentración de 0,03 mg/ml.
   2. Inyectar una dosis de 0,05-0,1 mg/kg de buprenorfina 0,03 mg/ml por vía subcutánea junto con 500 μl de NaCl estéril al 0,9%, cada 8 a 12 h durante las primeras 48 h después de la cirugía índice. En un ratón de 20 g, se necesitarían 2 μg o 66 μL de 0,03 mg/ml de buprenorfina.

6. Eutanasia y extracción de la VCI que contiene el coágulo

1. Anestesia al ratón en una cámara de isoflurano, sostén al animal desde la base de la cola y mantenlo en la superficie dorsum de tu mano.
2. Trasladar al animal a la cámara de inducción anestésica continua llena de isoflurano al 3%-4%. Coloque al animal en decúbito supino.
3. Realice una laparotomía larga de la línea media desde el xifoides hasta la vejiga como se describe.
4. Exteriorizar el intestino hacia el lado derecho del abdomen y extraer la VCI pinzada distal a la bifurcación ilíaca hasta la extensión de la VCI infrarrenal (Figura 2G).
5. Después de la extracción del coágulo y el tumor, eutanasiar al animal con dislocación cervical.

7. Análisis estadístico

1. Presente el análisis estadístico como la media, la mediana y la desviación estándar (DE) o el error estándar de la media (SEM), el percentil 25 o 75, o todo el rango de valores, incluidos los valores mínimos y máximos, según corresponda. Realice una prueba t de Student y la prueba F según corresponda. Evaluar la significación estadística a nivel de p <0,05.

Resultados

A un grupo de ratones hembra C57Bl6/J, de 8 a 12 semanas de edad, se les inyectaron células MC-38 en la fase logarítmica del crecimiento celular. Los xenoinjertos crecieron rápidamente entre la tercera y la cuarta semana después de la inyección¹⁸. Una vez que los tumores alcanzaron un volumen promedio de 400^mm3, los ratones fueron aleatorizados a los grupos control y experimental. El grupo control se sometió a ligadura de la VCI con sutura, mientras que los ratones experimentales ...

Discusión

En un modelo singénico de cáncer de colon con xenoinjerto, observamos una mayor trombogenicidad y expresiones de marcadores de coagulación en el grupo experimental en comparación con el grupo control. Es importante destacar que la varianza en todos estos parámetros fue menor en el grupo experimental en comparación con el grupo control. La modificación consistió en la introducción de un clip vascular con un perfil de presión específico en el punto de confluencia de la VCI y la vena renal izquierda. El clip se c...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
Caliper	VWR International, Radnor, PA	12777-830
CD31	Abcam	Ab9498
Cell Counter	MOXIE	MXZ000
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose,	Accurate Surgical & Scientific Instruments	PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Fibrin	Millipore	MABS2155-100UG
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
MC-38 cell	Sigma Aldrich	SCC172
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Suture- Vicryl	AD-Surgical	#L-G330R24
Suture-Nylon 2-0	Ethilon	664H
Suture-Prolene 5-0	Ethicon	8661G
Suture-Prolene 6-0	Ethicon	PDP127
VEV03100	VisualSonics	FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix	The Well Bioscience	VHM01