Анализ венозного тромбоза на мышиной модели рака

Резюме

Целью данной статьи является представление оптимизированного метода оценки венозного тромбоза в мышиной модели рака с использованием сосудистых зажимов для достижения венозной лигации. Оптимизация сводит к минимуму вариабельность измерений, связанных с тромбозом, и повышает актуальность для связанного с раком венозного тромбоза человека.

Аннотация

В данной методологической работе освещаются хирургические нюансы модели венозного тромбоза на грызунах, особенно в контексте рак-ассоциированного тромбоза (КПП). Тромбоз глубоких вен является распространенным осложнением у людей, перенесших рак, и может привести к летальному исходу. Современные модели мышиного венозного тромбоза, как правило, включают полную или частичную механическую окклюзию нижней полой вены (IVC) с помощью шва. Эта процедура вызывает полный или частичный застой крови и повреждение эндотелия, запуская тромбогенез. Существующие модели имеют ограничения, такие как более высокая вариабельность веса сгустков, значительный уровень смертности и длительная кривая обучения. В этом отчете представлены хирургические усовершенствования с использованием сосудистых зажимов для устранения некоторых из этих ограничений. Используя модель сингенного ксенотрансплантата рака толстой кишки у мышей, мы использовали индивидуальные сосудистые зажимы для перевязки полой вены инфраренала. Эти клипсы обеспечивают остаточное пространство губы, аналогичное полипропиленовому шовному материалу 5-0 после лигирования IVC. Контрольной группой служили мыши с шовным методом. Метод зажима сосудов привел к последовательной воспроизводимой частичной окклюзии сосудов и большему весу сгустка с меньшей вариабельностью, чем метод наложения швов. Больший вес сгустка, большая масса сгустка и сгусток на поверхности просвета IVC были ожидаемы из-за более высокого профиля давления сосудистых зажимов по сравнению с полипропиленовым шовным материалом 6-0. Подход был подтвержден с помощью УЗИ в оттенках серого, которая выявила стабильно большую массу тромба в инфраренальной полой вене с сосудистыми зажимами по сравнению с шовным методом. Эти наблюдения были дополнительно подтверждены иммунофлуоресцентным окрашиванием. Это исследование предлагает усовершенствованный метод создания модели венозного тромбоза у мышей, который может быть использован для углубления механистического понимания CAT и в трансляционных исследованиях, таких как разработка лекарств.

Введение

Рак-ассоциированная венозная тромбоэмболия (ВТЭ)
Риск венозной тромбоэмболии (ВТЭ) в 4–7 раз выше у пациентов, перенесших рак, по сравнению с общей популяцией ^1,2,3. Это состояние приводит к летальному исходу у каждого седьмого пациента с раком. Частота ВТЭ варьируется в зависимости от типа рака и опухолевой нагрузки и наиболее высока среди пациентов с раком поджелудочной железы и желудка⁴.

Рак-ассоциированная ВТЭ у онкологических больных имеет прогностическое значение. Это связано с неблагоприятной общей выживаемостью в течение первого года после постановки диагноза рака, даже с поправкой на возраст, расу и стадию^{основного рака}. Эти результаты подчеркивают важность изучения ВТЭ, ассоциированной с раком, и необходимость изучения ее механизма на животной модели. Трансляционная значимость этого направления дополнительно подчеркивается тем фактом, что ВТЭ у онкологических больных можно предотвратить и лечить с помощью тромбопрофилактики и антитромботической терапии⁶.

Животные модели рака и венозного тромбоза
Модели рака условно называются ксенотрансплантатами, которые влекут за собой инъекцию раковых клеток мышам. Инъекция раковых клеток в том же месте, что и их источник, называется ортотопической моделью, в то время как в другом месте (подкожная плоскость над боком) известна как гетеротопическая модель. Вид происхождения раковых клеток определяет их как аллогенную модель, такую как клеточная линия HT-29 (рак толстой кишки человека)^7,8,9. Напротив, в сингенных моделях используются линии мышиных раковых клеток, в том числе клеточные линии RenCa и MC-38 ^3,10.

В литературе описаны модели артериального, венозного и капиллярного тромбоза у грызунов. Венозный тромбоз индуцируется в нижней полой вене (НПВ) механическим повреждением (проводник) или полным лигированием НПВ, химическим (хлорид железа) или электролитическим повреждением. Тромбоз, индуцированный хлоридом железа, или лигирование IVC, представляет собой полную окклюзионную модель. Последнее приводит к застою крови и воспалительным инфильтратам в венах^11,12,13. Модель полного лигирования приводит к высокой скорости образования тромбозов у 95–100% мышей. Модель частичного лигирования IVC может включать прерывание латеральных подвздошно-поясничных ветвей, а венозный возврат отменяется путем наложения шовных лигаторов в дистальных точках-мишенях IVC¹². Иногда для частичного прерывания венозного возврата используется спейсхолдер. Тем не менее, вес тромба непостоянен в текущей модели частичной окклюзии, что приводит к высокой вариабельности веса и высоты тромба^12,14.

Обе эти модели механической обработки крупных вен (частичная и полная) имеют ограничения. Во-первых, лигирование IVC (стазисная модель) часто приводит к гипотензии. Кровь шунтируется по позвоночным венам. Несмотря на то, что в опытных руках смертность с этой моделью колеблется от 5% до 30%, причем более высокий уровень ожидается во время кривой обучения. Важно отметить, что модель полной окклюзии не воспроизводит тромбоз глубоких вен (ТГВ) у людей, где тромб обычно является неокклюзионным. Полная окклюзия, вероятно, изменяет гемореологические факторы и фармакодинамические параметры, изменяя биодоступность соединений в локальном очаге. Из-за этих ограничений полные модели окклюзии могут быть неоптимальными для тестирования новых химических соединений в терапевтических целях и открытия лекарств¹².

Следует отметить, что для получения более клинически значимой мышиной модели венозного тромбоза со сниженным током при повреждении эндотелия была введена модель венозного тромбоза, где ТГВ запускается ограничением кровотока при отсутствии эндотелиального разрушения. Валидацию модели проводили методом сканирующей электронной микроскопии¹⁵. Предпочтительной клинически значимой моделью тромбоза является модель с почти полным тромбозом, которая позволяет разрабатывать лекарственные препараты. Образование тромба в современных моделях частичной окклюзии непоследовательно, что приводит к высокой вариабельности веса и высоты сгустка^12,16. Кроме того, вес сгустка варьируется при использовании традиционных методов, что требует большего количества мышей в исследованиях¹².

Предыдущие модели тромбоза, ассоциированного с раком, были сосредоточены на раке толстой кишки, поджелудочной железы и легких и представляли собой модели полной окклюзии^17,18,19. В данной рукописи модифицирована модель тромбоза частичной окклюзии, чтобы обеспечить более низкую вариабельность тромбов и смертность мышей (рис. 1). В предыдущих исследованиях использовались аллогенные линии раковых клеток на фоне 19,20,21 мышей с ослабленным иммунитетом. В данной работе используется сингенный ксенотрансплантат клеток MC-38 у мышей линии C57Bl6/J, что позволяет использовать иммунокомпетентных мышей и исследовать иммунные компоненты для тромбогенеза.

протокол

Для этого исследования были использованы 16 самок мышей C57Bl6/J в возрасте 8-12 недель с массой тела от 20 до 25 г. Мышей содержали в стандартных условиях и кормили кормом и водой вволю. Это исследование было проведено с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Бостонском университете. Описанные здесь открытые процедуры проводились в стерильных условиях.

1. Модель ксенотрансплантата

1. Клеточная культура
   1. Перед гетеротопической подкожной имплантацией вырастить клетки MC-38 в виде монослоя до 80% слияния.
   2. После трипсинизации и ресуспензии в 10%-ной среде, содержащей ФБС, центрифужные ячейки при 277 x g, 4 °C в течение 5 мин. Затем ресуспендируют клетки в бессывороточных средах до концентрации 1 x 10⁴ MC-38 клеток/мкл безсывороточной среды.
      1. Для трипсинизации культивируют клетки MC-38 до тех пор, пока они не достигнут желаемого слияния (обычно около 70%-80%), а затем аспирируют питательную среду из чашки Петри.
      2. Добавьте 1 мл раствора трипсина-ЭДТА и инкубируйте клетки с трипсином в течение 1 мин при 37 °C, чтобы обеспечить отслоение. Осторожно постучите или встряхните чашку Петри, чтобы обеспечить равномерное отделение.
      3. Добавьте питательную среду, содержащую сыворотку или ингибитор трипсина, чтобы нейтрализовать активность и предотвратить дальнейшую диссоциацию клеток. Соберите отделившиеся клетки вместе с нейтрализованным раствором трипсина.
      4. Для ресуспензии, после отделения клеток путем трипсинизации, подготовьте их к трансплантации или дальнейшим экспериментам. Центрифугируйте собранную клеточную суспензию при 277 x g , чтобы гранулировать клетки.
      5. Осторожно удалите надосадочную жидкость (жидкость над клеточной гранулой). Добавьте 9 мл питательной среды, буфера или раствора к клеточной грануле, чтобы достичь желаемой концентрации клеток для трансплантации или экспериментов.
      6. Осторожно ресуспендируйте клетки, пипетируя вверх и вниз или используя встряхиватель колб для культивирования. Избегайте энергичного пипетирования, которое может повредить клетки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от используемого варианта или клеточной линии, клетки могут быть ресуспендированы в соотношении 1:1 из солюбилизированного матрикса базальной мембраны и безсывороточной среды, чтобы замедлить очень агрессивный рост и распространение клеток мыши после имплантации. Все этапы культивирования клеток должны выполняться в полном асептическом колпаке в специально отведенном для клеточных культур пространстве и регулярно проверяться на микоплазму.
   3. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек в соответствии с предоставленным ручным протоколом.
2. Клеточная имплантация
   1. Случайным образом распределите восемь мышей в экспериментальную группу и восемь мышей в контрольную группу следующим образом. В контрольной группе использовали мышей с ксенотрансплантатом MC38 и выполняли лигирование IVC полипропиленовым шовным материалом 5-0. В опытной группе использовали мышей с ксенотрансплантатом MC38 и выполняли лигирование IVC с помощью индивидуального сосудистого зажима.
   2. Поместите мышь в левое боковое положение лежа и побрейте правый бок между передними и задними конечностями. Нанесите спирт и йод вдоль спинной поясничной области, чтобы асептически подготовить область для инъекции.
   3. Ввести 2 x 10⁶ клеток MC-38, приготовленных в 200 мкл среды, подкожно в бок, на полпути между самым дистальным ребром животного и тазовым возвышением, с помощью иглы 27G, осторожно держа животное в недоминантной руке.
   4. После инъекции внимательно осмотрите животных и посадите их обратно в клетку. Животные должны быть осмотрены на наличие следующего: 1. Изменения в поведении, уровнях активности и общей подвижности мышей. Любые значительные изменения могут указывать на дискомфорт или проблемы со здоровьем. 2. Общее физическое состояние мышей, включая качество шерсти, привычки ухода и любые видимые признаки стресса или аномалий 3. Вернуться к потреблению пищи и воды 4. Любые изменения в уровне активности, позе или взаимодействии с соседями по клетке. Вялость или повышенная агрессия могут быть признаками дистресса.

2. Наблюдение за ростом опухоли

1. Наблюдайте за животными раз в две недели на предмет тенденций роста опухоли в течение 3-4 недель. Измерьте опухоли штангенциркулем и запишите размеры опухоли.
   1. Измерьте опухоли вдоль их самой длинной оси (L) и оси, перпендикулярной длинной оси (W). Рассчитайте объем опухоли (V) по формуле L x (W²) = V. Если размер опухоли превышает 20 мм в каждом измерении и/или опухоль имеет признаки изъязвления, усыпьте животных до окончания эксперимента.
2. Как только объем опухоли достигнет 400^мм3, запланируйте использование мышей для лигирования IVC.

3. Анестезия и подготовка

1. Обезболивайте мышь в изофлурановой камере и вводите анальгетик подкожно: держите животное за основание хвоста. Держите животное на тыльной поверхности недоминантной руки.
2. Переведите животное в индукционную камеру непрерывного действия, заполненную 3%-4% изофлураном. Подтвердить адекватную общую анестезию при отсутствии пальцевого рефлекса. Используйте поддерживающую дозу 1%-3% изофлурана. Нанесите ветеринарную мазь на оба глаза.
3. Подкожная инъекция бупренорфина (опиоид для облегчения боли): Растворите запас бупренорфина в концентрации 0,3 мг/мл в 0,9% хлорида натрия (NaCl) до достижения концентрации 0,03 мг/мл.
4. Перед операцией введите 0,05-0,1 мг/кг 0,03 мг/мл бупренорфина вместе с 500 мкл стерильного 0,9% NaCl перед операцией. В 20 г мыши требуется 2 мкг или 66 мкл 0,03 мг/мл бупренорфина.
5. Подготовка кожи: Поместите мышь под полным наркозом в положение лежа на спине поверх одеяла с подогревом. Дезинфицировать переднюю область живота 0,5% настойкой хлоргексидина, 2 раза. Во время процедуры часто проверяйте температуру одеяла с подогревом и следите за тем, чтобы температура не падала.

4. Лигирование IVC

1. Срединная лапаротомия
   1. Надрезайте кожу живота тонкими ножницами, начиная от мечевидного возвышения к мочевому пузырю. Зажмите брюшину на полпути вдоль разреза кожи атравматическими щипцами. Обеспечьте достаточное расстояние между разрезом и вышележащими кишками (Рисунок 2A).
   2. Вскрывают брюшину продольно вместе с аваскулярной линией белой губы.
2. Экстериоризация кишечника в правую брюшную сторону
   1. Потяните кишки влажными ватными кончиками. Накройте кишечник полностью влажной стерильной марлей. Убедитесь, что покрытый кишечник находится в направлении без тракции без чрезмерного вытяжения брыжеечных сосудов.
3. Полное обнажение НПВ и ветвей, включая слияние левой почечной вены с НПВ (рис. 2Б).
   1. Капните 200-300 мкл физиологического раствора. Исследуйте ход мочеточников, НПВ, аорты и почечных вен (рис. 2).
4. Аваскулярная плоскость в месте слияния инфраренального НПВ и слияния левой почечной вены.
   1. Полипропиленовый шов 6-0 осторожно пропустите через аваскулярную плоскость 2x-3x каудальными движениями к головоломным движениям атравматическими щипцами с закрытым кончиком.
   2. Убедитесь, что любое минимальное выделение жидкости контролируется мягким давлением, обеспечиваемым тампонадой с ватным наконечником. Расширьте предоставленную плоскость, пропустив полипропиленовый шов 6-0 мягкими каудальными и краниальными движениями.
5. Прижигание гонадной и поясничной ветвей (рис. 2D)
   1. Может присутствовать до 4 задних или поясничных ветвей. Чтобы избежать потенциальных осложнений в виде ишемии позвоночника и хромоты, в действующем протоколе оставьте поясничные ветви нетронутыми.
   2. Убедитесь, что присутствуют 2-3 боковые ветви, включая двустороннее артериальное кровоснабжение рога матки и гипогастральные сосуды. Обеспечьте последовательное разрушение первых двусторонних ветвей. Прижигают двусторонние ветви чуть дистальнее слияния левой почечной вены и НПВ (инфраренального НПВ). Следите за тем, чтобы венозные дренирующие сосуды рога матки не были нарушены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прижигание боковых ветвей предпочтительно, потому что этот метод обеспечивает гладкую и непрерывную поверхность, снижая вероятность неконтролируемого кровотечения. Более того, прижигание происходит быстрее и осуществимее, чем перевязка швов 10-0. Таким образом, животные будут подвергнуты более короткой и безопасной процедуре.
6. Дважды проверьте ход мочеточников и сосудистую сеть, чтобы убедиться в отсутствии каких-либо сочащихся или непреднамеренного прижигания (рис. 2C).
7. Лигирование IVC сосудистыми клипсами в опытной группе
   1. Подгоните сосудистые зажимы с помощью нейлонового шва шириной 2-0 с помощью атравматичных щипцов. Наложите индивидуальные сосудистые зажимы в экспериментальной группе по окружности вокруг инфраренальной НПВ.
   2. Наложите сосудистые зажимы поверх шва. Первичный ход шва обеспечивает достаточную аваскулярную плоскость с двумя-тремя тщательными каудальными и краниальными движениями (рис. 2E-F).
   3. Далее пропустите сосудистые зажимы через подготовленную плоскость. Подготовьте плоскость в месте слияния левой почечной вены и НПВ достаточно широкой, чтобы обеспечить беспрепятственное прохождение клипсы (рис. 2E).
   4. Установите индивидуальный сосудистый зажим горизонтально, перпендикулярно ходу НПВ, через подготовленную плоскость. Наложите сосудистые зажимы на полипропиленовый шов 5-0, чтобы обеспечить достаточное оставшееся пространство (Рисунок 2G).
   5. Убедитесь, что вышеуказанные шаги выполняются осторожно, чтобы предотвратить повреждение сосудов или кровотечение в месте наложения сосудистых зажимов. Осмотрите операционное поле на предмет возможного просачивания. Слегка надавите ватным наконечником на операционное поле в случае сочения.
8. IVC Лигирование со швом в контрольной группе
   1. Наложение шовного материала полипропиленовым шовным материалом 6-0. Наложить хирургический квадратный узел вокруг подпочечного НПВ в подготовленной плоскости поверх шелкового шва 5-0.
   2. После того, как шов будет завершен, осторожно снимите шелковый шов, чтобы обеспечить достаточное пространство для остатков.
9. Выполнить подкожную инъекцию 200 мкл физиологического раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить сопоставимую технику частичной окклюзии IVC с наложением зажима, сосудистый зажим в данном исследовании настроен таким образом, чтобы обеспечить пространство между губами. Затем сосудистый зажим помещают в подготовленную аваскулярную плоскость в месте слияния левой почечной вены и НПВ.
10. Закрыть лапаротомию непрерывным швом 4-0 vicryl.

5. Последующее наблюдение после индексной операции

1. Наблюдайте за животным непрерывно после операции в течение 1 часа или до тех пор, пока не будет восстановлено равновесие и способность к выпрямлению, независимо от того, что происходит раньше в изолированной чистой клетке, до полного восстановления.
2. Наблюдайте за животным ежедневно в течение 2 дней. Если животное выглядит расстроенным, наблюдайте за ним два раза в день в течение 2 дней. Вводите послеоперационную анальгезию и жидкости в соответствии с протоколом.
   1. Запас бупренорфина с концентрацией 0,3 мг/мл растворяют в 0,9% хлорида натрия (NaCl) до достижения концентрации 0,03 мг/мл.
   2. Вводят 0,05-0,1 мг/кг 0,03 мг/мл бупренорфина подкожно вместе с 500 мкл стерильного 0,9% NaCl каждые 8-12 ч в течение первых 48 ч после индексной операции. Для мыши весом 20 г потребуется 2 мкг или 66 мкл бупренорфина в дозе 0,03 мг/мл.

6. Эвтаназия и забор НПВ, содержащего сгусток

1. Обезболивайте мышь в изофлурановой камере, держите животное за основание хвоста и держите животное на тыльной поверхности руки.
2. Переведите животное в индукционную камеру непрерывного действия, заполненную 3%-4% изофлураном. Поместите животное в положение лежа на спине.
3. Выполните длинную срединную лапаротомию, начиная от мечевидного ряда до мочевого пузыря, как описано выше.
4. Экстериоризируют кишечник в правую сторону брюшной полости и извлекают зажатый НПВ дистальнее бифуркации подвздошной кости до степени инфраренального НПВ (рис. 2G).
5. После забора тромба и опухоли усыпьте животное при вывихе шейки матки.

7. Статистический анализ

1. Представьте статистический анализ в виде среднего, медианного и стандартного отклонения (SD) или стандартной ошибки среднего значения (SEM), 25-го или 75-го процентиля или всего диапазона значений, включая минимальные и максимальные значения, в зависимости от ситуации. При необходимости выполните t-критерий Стьюдента и F-критерий. Оценивают статистическую значимость на уровне p <0,05.

Результаты

Группе самок мышей C57Bl6/J в возрасте 8-12 недель вводили клетки MC-38 в логарифмическую фазу роста клеток. Ксенотрансплантаты быстро росли между третьей и четвертой неделями после инъекции¹⁸. После того, как опухоли достигали среднего объема 400^мм3, мышей рандомизировали в к?...

Обсуждение

В сингенной модели рака толстой кишки с помощью сингенного ксенотрансплантата мы наблюдаем более высокую тромбогенность и экспрессию маркеров свертывания крови в опытной группе по сравнению с контрольной группой. Важно отметить, что дисперсия по всем этим параметрам была ниже в опыт?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
Caliper	VWR International, Radnor, PA	12777-830
CD31	Abcam	Ab9498
Cell Counter	MOXIE	MXZ000
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose,	Accurate Surgical & Scientific Instruments	PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Fibrin	Millipore	MABS2155-100UG
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
MC-38 cell	Sigma Aldrich	SCC172
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Suture- Vicryl	AD-Surgical	#L-G330R24
Suture-Nylon 2-0	Ethilon	664H
Suture-Prolene 5-0	Ethicon	8661G
Suture-Prolene 6-0	Ethicon	PDP127
VEV03100	VisualSonics	FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix	The Well Bioscience	VHM01