Ensaio de Trombose Venosa em Modelo de Câncer em Camundongos

Resumo

Este artigo tem como objetivo apresentar um método otimizado para avaliação da trombose venosa em modelo de câncer em camundongos, utilizando clipes vasculares para a ligadura venosa. A otimização minimiza a variabilidade nas medidas relacionadas à trombose e aumenta a relevância para a trombose venosa associada ao câncer humano.

Resumo

Este artigo metodológico destaca as nuances cirúrgicas de um modelo de trombose venosa em roedores, especificamente no contexto da trombose associada ao câncer (TAC). A trombose venosa profunda é uma complicação comum em sobreviventes de câncer e pode ser potencialmente fatal. Os modelos atuais de trombose venosa murina tipicamente envolvem uma oclusão mecânica completa ou parcial da veia cava inferior (VCI) usando uma sutura. Esse procedimento induz estase total ou parcial de sangue e dano endotelial, desencadeando trombogênese. Os modelos atuais apresentam limitações, como maior variabilidade no peso dos coágulos, taxa de mortalidade significativa e curva de aprendizado prolongada. Este relato apresenta refinamentos cirúrgicos usando clipes vasculares para abordar algumas dessas limitações. Usando um modelo de xenoenxerto de câncer de cólon singênico em camundongos, empregamos clipes vasculares personalizados para ligar a veia cava infrarrenal. Esses clipes permitem espaço labial residual semelhante a uma sutura de polipropileno 5-0 após ligaduras da VCI. Camundongos com o método de sutura serviram como controles. O método do clipe vascular resultou em oclusão vascular parcial reprodutível consistente e maiores pesos de coágulos com menor variabilidade do que o método de sutura. Os maiores pesos do coágulo, maior massa do coágulo e área luminal do coágulo na VCI eram esperados devido ao maior perfil de pressão dos clipes vasculares em comparação com uma sutura de polipropileno 6-0. A abordagem foi validada pela ultrassonografia em escala de cinza, que revelou consistentemente maior massa de coágulos na veia cava infrarrenal com clipes vasculares em comparação com o método de sutura. Essas observações foram corroboradas com a coloração de imunofluorescência. Este estudo oferece um método aprimorado para gerar um modelo de trombose venosa em camundongos, que pode ser empregado para aprofundar a compreensão mecanicista da TAC e em pesquisas translacionais como a descoberta de drogas.

Introdução

Tromboembolismo venoso (TEV) associado ao câncer
O risco de tromboembolismo venoso (TEV) é 4 a 7 vezes maior em sobreviventes de câncer em comparação com a população geral ^1,2,3. Esta condição revela-se fatal em um em cada sete pacientes com câncer. A incidência de TEV varia dependendo do tipo de câncer e da carga tumoral e é maior entre pacientes com câncer de pâncreas e gástrico⁴.

O TEV associado ao câncer em pacientes com câncer tem significado prognóstico. Está associada à sobrevida global desfavorável no primeiro ano após o diagnóstico de câncer, mesmo após ajuste para idade, raça e estágio do câncer de base⁵. Esses achados destacam a importância de examinar o TEV associado ao câncer e a necessidade de investigar seu mecanismo usando um modelo animal. A relevância translacional dessa área é ainda mais enfatizada pelo fato de que o TEV em pacientes com câncer é evitável e tratável com tromboprofilaxia e terapia antitrombótica⁶.

Modelos animais de câncer e trombose venosa
Os modelos de câncer são convencionalmente denominados xenoenxertos, que envolvem a injeção de células cancerígenas em camundongos. A injeção de células cancerosas em um local como sua origem é referida como um modelo ortotópico, enquanto em um local diferente (plano subcutâneo sobre o flanco) é conhecida como um modelo heterotópico. A espécie de origem das células cancerosas as determina como um modelo alogênico, como a linhagem celular HT-29 (human colon cancer)^7,8,9. Ao contrário, os modelos singênicos utilizam as linhagens celulares de câncer murino, incluindo^{as linhagens} RenCa e MC-383,10.

A literatura tem descrito modelos de trombose arterial, venosa e capilar em roedores. A trombose venosa é induzida na veia cava inferior (VCI) por lesão mecânica (fio-guia) ou ligadura completa da VCI, química (cloreto férrico) ou lesão eletrolítica. A trombose induzida por cloreto férrico ou ligadura da VCI representa modelos de oclusão completa. Esta última resulta em estase de sangue e infiltrados inflamatórios nas veias^11,12,13. O modelo de ligadura completa resulta em uma alta taxa de formação de trombose em 95% a 100% dos camundongos. O modelo de ligadura parcial da VCI pode incluir a interrupção dos ramos iliolombares laterais, e o retorno venoso é revogado pela aplicação de ligaduras de sutura nos pontos-alvo distais da VCI¹². Às vezes, um suporte de espaço é usado para interromper parcialmente o retorno venoso. Entretanto, o peso do trombo é inconsistente no atual modelo de oclusão parcial, resultando em alta variabilidade no peso e altura do^{coágulo12,14}.

Ambos os modelos mecânicos de veias grandes (parciais e completas) apresentam limitações. Primeiro, a ligadura da VCI (modelo de estase) geralmente resulta em hipotensão. O sangue é desviado através das veias vertebrais. Embora em mãos experientes, a mortalidade com esse modelo varia de 5% a 30%, com a maior taxa esperada durante a curva de aprendizado. É importante ressaltar que o modelo de oclusão completa não reproduz trombose venosa profunda (TVP) em humanos, onde um trombo tipicamente é não-oclusivo. A oclusão completa pode alterar fatores hemorreológicos e parâmetros farmacodinâmicos, alterando a biodisponibilidade dos compostos no local. Devido a essas limitações, modelos de oclusão completa podem não ser ideais para testar novos compostos químicos para fins terapêuticos e descobertas de fármacos¹².

Deve-se notar que, para fornecer um modelo murino de trombose venosa mais relevante clinicamente com diminuição do fluxo com dano endotelial, um modelo de trombose venosa foi introduzido, onde a TVP é desencadeada pela restrição do fluxo sanguíneo na ausência de ruptura endotelial. O modelo foi validado por microscopia eletrônica de varredura¹⁵. Um modelo de trombose clinicamente relevante preferido é aquele com trombose quase completa que permite a descoberta de drogas. A formação de coágulos nos modelos atuais de oclusão parcial é inconsistente, resultando em alta variabilidade no peso e altura do coágulo^12,16. Além disso, o peso do coágulo é variável com os métodos convencionais, necessitando de mais camundongos por estudo¹².

Modelos prévios de trombose associada ao câncer focavam em câncer de cólon, pâncreas e pulmão e eram todos modelos de oclusão completa^17,18,19. Este manuscrito modifica o modelo de trombose oclusal parcial para proporcionar coágulos com menor variabilidade e mortalidade em camundongos (Figura 1). Estudos anteriores utilizaram linhagens de células cancerosas alogênicas em camundongos atímicos imunocomprometidos 19,20,21. Este manuscrito utiliza um xenoenxerto singênico de células MC-38 em camundongos C57Bl6/J, que permite o uso de camundongos imunocompetentes e o exame de componentes imunes à trombogênese.

Protocolo

Para este estudo, foram utilizados 16 camundongos fêmeas C57Bl6/J, com 8-12 semanas de idade e peso corporal de 20 a 25 g. Os camundongos foram alojados em condições padrão e alimentados com ração e água ad libitum. Este estudo foi realizado com a aprovação do Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Boston. Os procedimentos abertos aqui descritos foram realizados em condições estéreis.

1. Modelo de xenoenxerto

1. Cultura celular
   1. Antes do implante subcutâneo heterotópico, crescer células MC-38 como uma monocamada para 80% de confluência.
   2. Após tripsinização e ressuspensão em meio contendo FBS a 10%, centrifugar as células a 277 x g, 4 °C por 5 min. Em seguida, ressuspender as células em meio livre de soro para uma concentração de 1 x 10⁴ células MC-38/μL de meio livre de soro.
      1. Para tripsinização, cultivar as células MC-38 até atingirem a confluência desejada (geralmente em torno de 70%-80%) e, em seguida, aspirar o meio de cultura da placa de Petri.
      2. Adicionar 1 ml de solução de tripsina-EDTA e incubar as células com tripsina durante 1 min a 37 °C para permitir o descolamento. Bata ou agite suavemente a placa de Petri para garantir um desprendimento uniforme.
      3. Adicionar um meio de cultura contendo soro ou um inibidor de tripsina para neutralizar a atividade e evitar a dissociação celular adicional. Coletar as células destacadas juntamente com a solução de tripsina neutralizada.
      4. Para a ressuspensão, uma vez que as células são destacadas através de tripsinização, prepará-las para transplante ou experimentos posteriores. Centrifugar a suspensão celular coletada a 277 x g para peletizar as células.
      5. Remova cuidadosamente o sobrenadante (líquido acima do pellet de células). Adicionar 9 mL de meio de cultura, tampão ou solução ao pellet celular para atingir a concentração celular desejada para transplante ou experimentação.
      6. Ressuspenda suavemente as células pipetando para cima e para baixo ou usando um agitador de frascos de cultura. Evite pipetagem vigorosa que possa danificar as células.
         NOTA: Dependendo da variante ou linhagem celular usada, as células podem ser ressuspensas em uma proporção de 1:1 de matriz de membrana basal solubilizada e meio livre de soro para retardar o crescimento e a disseminação de células de camundongo altamente agressivas após a implantação. Todas as etapas de cultura celular devem ser realizadas em uma capa asséptica completa em um espaço alocado especificamente para cultura de células e foram testadas para micoplasma regularmente.
   3. Conte as células com um contador de células automatizado de acordo com o protocolo manual fornecido.
2. Implantação celular
   1. Atribua aleatoriamente oito camundongos ao grupo experimental e oito camundongos ao grupo controle, da seguinte forma. No grupo controle, utilizar camundongos com xenoenxerto MC38 e realizar ligadura da VCI com fio de polipropileno 5-0. No grupo experimental, utilizar camundongos com xenoenxerto MC38 e realizar ligadura da VCI com clipe vascular personalizado.
   2. Coloque o mouse em decúbito lateral esquerdo e raspe o lado direito entre os membros anteriores e posteriores. Aplique álcool e iodo ao longo da área lombar dorsal para preparar assepticamente a área para injeção.
   3. Injetar 2 x 10⁶ células MC-38 preparadas em 200 μL de meio subcutâneo no flanco, a meio caminho entre a costela mais distal do animal e a eminência pélvica, utilizando uma agulha 27G, segurando o animal suavemente na mão não dominante.
   4. Após a injeção, inspecione cuidadosamente os animais e coloque-os de volta na gaiola. Os animais devem ser inspeccionados quanto aos seguintes aspectos: 1. Mudanças no comportamento, níveis de atividade e mobilidade geral dos camundongos. Qualquer alteração significativa pode indicar desconforto ou problemas de saúde. 2. A condição física geral dos camundongos, incluindo a qualidade dos pelos, hábitos de higiene e quaisquer sinais visíveis de sofrimento ou anormalidades 3. Retorno ao consumo alimentar e ingestão hídrica 4. Quaisquer mudanças em seu nível de atividade, postura ou interações com companheiros de gaiola. Letargia ou aumento da agressividade podem ser sinais de angústia.

2. Acompanhamento do crescimento tumoral

1. Monitorar os animais quinzenalmente quanto às tendências de crescimento tumoral por 3-4 semanas. Meça os tumores com um paquímetro e registre as dimensões do tumor.
   1. Medir os tumores ao longo de seu maior eixo (L) e o eixo perpendicular ao longo eixo (W). Calcular o volume tumoral (V) utilizando a equação L x (W²) = V. Se o tamanho do tumor ultrapassar 20 mm em cada dimensão e ou o tumor tiver evidência de ulceração, sacrificar os animais antes do término do experimento.
2. Quando o volume tumoral atingir 400^mm3, planeje usar os camundongos para ligadura da VCI.

3. Anestesia e preparo

1. Anestesiar o camundongo em uma câmara de isoflurano e injetar o analgésico por via subcutânea: Segure o animal da base da cauda. Manter o animal na superfície dorsal da mão não dominante.
2. Transferir o animal para a câmara de indução anestésica contínua preenchida com isoflurano a 3%-4%. Confirme a anestesia geral adequada com a ausência de um reflexo de pinça dos dedos. Use uma dose de manutenção de isoflurano a 1%-3%. Aplique pomada veterinária em ambos os olhos.
3. Injeção subcutânea com buprenorfina (opioide para atenuar a dor): Dissolver o estoque de buprenorfina na concentração de 0,3 mg/mL em cloreto de sódio (NaCl) a 0,9% para atingir a concentração de 0,03 mg/mL.
4. Injetar uma dose de 0,05-0,1 mg/kg de buprenorfina 0,03 mg/mL juntamente com 500 μL de NaCl 0,9% estéril por via subcutânea antes da cirurgia. Em um camundongo de 20 g é necessária uma quantidade de 2 μg ou 66 μL de 0,03 mg/mL de buprenorfina.
5. Preparo da pele: Coloque o rato totalmente anestesiado em decúbito dorsal sobre a manta de aquecimento. Desinfetar a região abdominal anterior com tintura de clorexidina a 0,5%, 2x. Verifique frequentemente a temperatura da manta de aquecimento durante o procedimento e certifique-se de que a temperatura não caia.

4. Ligadura da VCI

1. Laparotomia mediana
   1. Incisar a pele abdominal com uma tesoura fina a partir da eminência xifoidal até a bexiga. Apertar o peritônio na metade da incisão da pele com pinça atraumática. Garantir espaço adequado entre a incisão e os intestinos sobrejacentes (Figura 2A).
   2. Abrir o peritônio longitudinalmente junto com a linha alba avascular.
2. Exteriorizando os intestinos para o lado abdominal direito
   1. Puxe os intestinos com pontas de algodão molhadas. Cubra os intestinos em uma gaze estéril completamente úmida. Certifique-se de que os intestinos cobertos estejam em uma direção livre de tração sem qualquer tração excessiva nos vasos mesentéricos.
3. Exposição completa da VCI e ramos, incluindo a confluência da veia renal esquerda com a VCI (Figura 2B).
   1. Gota 200-300 μL de soro fisiológico. Explorar o trajeto dos ureteres, VCI, aorta e veias renais (Figura 2).
4. Plano avascular no ponto de confluência da VCI infra-renal e confluência da veia renal esquerda.
   1. Passar a sutura de polipropileno 6-0 pelo plano avascular suavemente 2x-3x com movimentos caudais a cefálicos com pinça atraumática de ponta fechada.
   2. Certifique-se de que qualquer exsudação mínima seja controlada com uma pressão suave fornecida com um tamponamento de ponta de algodão. Amplie o plano fornecido passando a sutura de polipropileno 6-0 com movimentos caudais a cranianos suaves.
5. Cauterização dos ramos gonadais e lombares (Figura 2D)
   1. Até 4 ramos posteriores ou lombares podem estar presentes. Para evitar possíveis complicações de isquemia e claudicação da coluna vertebral, deixar os ramos lombares intactos no protocolo atual.
   2. Verificar a presença de 2 a 3 ramos laterais, incluindo o suprimento arterial bilateral do corno uterino e vasos hipogástricos. Garantir a interrupção consistente das primeiras ramificações presentes bilateralmente. Cauterizar os ramos bilaterais apenas distais à confluência da veia renal esquerda e VCI (VCI infrarrenal). Certifique-se de que os vasos de drenagem venosa do corno uterino não sejam interrompidos.
      OBS: Opta-se pela cauterização de ramo lateral, pois proporciona uma superfície lisa e ininterrupta, reduzindo qualquer potencial de sangramento descontrolado. Além disso, a cauterização é mais rápida e viável do que a ligadura com sutura 10-0. Portanto, os animais serão expostos a um procedimento mais curto e seguro.
6. Verifique o trajeto dos ureteres e a vasculatura para garantir a ausência de qualquer exsudação ou cauterização inadvertida (Figura 2C).
7. Ligadura da VCI com clipes vasculares no grupo experimental
   1. Personalizar os clipes vasculares com uma sutura de náilon de largura 2-0 por pinça atraumática. Aplicar os clipes vasculares personalizados no grupo experimental circunferencialmente ao redor da VCI infrarrenal.
   2. Aplicar os clipes vasculares sobre a sutura. A passagem da sutura primária fornece um plano avascular suficiente com dois a três movimentos caudais a cranianos meticulosos (Figura 2E-F).
   3. Passe os clipes vasculares através do plano preparado. Preparar o plano na confluência da veia renal esquerda e VCI suficientemente larga para permitir a passagem do clipe sem intercorrências (Figura 2E).
   4. Coloque o clipe vascular personalizado horizontalmente, perpendicularmente ao curso da VCI, através do plano preparado. Posicionar os clipes vasculares sobre a sutura de polipropileno 5-0 para garantir espaço remanescente adequado (Figura 2G).
   5. Certifique-se de que as etapas acima sejam executadas suavemente para evitar qualquer dano vascular ou sangramento no local dos clipes vasculares. Observar o campo cirúrgico para possíveis oozing. Aplique uma pressão suave com a ponta do algodão no campo cirúrgico em caso de oozing.
8. Ligadura da VCI com sutura no grupo controle
   1. Ligadura de sutura com fio de polipropileno 6-0. Fazer uma sutura cirúrgica de nó quadrado ao redor da VCI infra-renal no plano preparado sobre uma sutura de seda 5-0.
   2. Uma vez que a sutura esteja completa, remova suavemente a sutura de seda para garantir o espaço remanescente adequado.
9. Realizar injeção subcutânea de 200 μL de soro fisiológico.
   NOTA: Para fornecer uma técnica comparável para oclusão parcial da VCI com aplicação de pinça, o clipe vascular é personalizado no presente estudo para fornecer espaço entre os lábios. O clipe vascular é então colocado no plano avascular preparado na confluência da veia renal esquerda e da VCI.
10. Fechar a laparotomia com sutura contínua de vicryl 4-0.

5. Seguimento após a cirurgia índice

1. Monitorar o animal continuamente no pós-operatório por 1 h ou até que o equilíbrio e a capacidade de endireitamento sejam recuperados, o que vier primeiro em uma gaiola limpa isolada até a recuperação total.
2. Monitorar o animal diariamente por 2 dias. Se o animal parecer angustiado, monitore-o duas vezes ao dia por 2 dias. Administrar analgesia pós-operatória e fluidos por protocolo.
   1. Dissolver o estoque de buprenorfina com uma concentração de 0,3 mg/mL em cloreto de sódio (NaCl) a 0,9% para atingir a concentração de 0,03 mg/mL.
   2. Injetar uma dose de 0,05-0,1 mg/kg de buprenorfina 0,03 mg/mL por via subcutânea juntamente com 500 μL de NaCl 0,9% estéril, a cada 8 a 12 h durante as primeiras 48 h após a cirurgia índice. Em um camundongo de 20 g, seriam necessários 2 μg ou 66 μL de 0,03 mg/mL de buprenorfina.

6. Eutanásia e colheita da VCI contendo o coágulo

1. Anestesiar o camundongo em uma câmara de isoflurano, segurar o animal a partir da base da cauda e manter o animal na superfície dorsal de sua mão.
2. Transferir o animal para a câmara de indução anestésica contínua preenchida com isoflurano a 3%-4%. Coloque o animal em decúbito dorsal.
3. Realizar uma laparotomia longa na linha média a partir do xifoide até a bexiga, conforme descrito.
4. Exteriorizar o intestino para o lado direito do abdome e retirar a VCI pinçada distal à bifurcação ilíaca até a extensão da VCI infrarrenal (Figura 2G).
5. Após a colheita do coágulo e do tumor, eutanasiar o animal com luxação cervical.

7. Análise estatística

1. Apresentar análise estatística como média, mediana e desvio padrão (DP) ou erro padrão da média (EPM), percentil 25 ou 75, ou toda a faixa de valores, incluindo valores mínimos e máximos, conforme apropriado. Realize um teste t de Student e o teste F, conforme apropriado. Avaliou-se a significância estatística ao nível de p <0,05.

Resultados

Um grupo de camundongos fêmeas C57Bl6/J, com 8-12 semanas de idade, foi injetado com células MC-38 na fase logarítmica do crescimento celular. Os xenoenxertos cresceram rapidamente entre a terceira e a quarta semanas pós-injeção¹⁸. Uma vez que os tumores atingiram um volume médio de 400 mm³, os camundongos foram randomizados para os grupos controle e experimental. O grupo controle foi submetido à ligadura da VCI com sutura, enquanto os camundongos experimentais foram submetidos ...

Discussão

Em um modelo singênico de câncer de cólon xenoenxerto, observamos maior trombogenicidade e expressão de marcadores de coagulação no grupo experimental em relação ao grupo controle. É importante ressaltar que a variância em todos esses parâmetros foi menor no grupo experimental em relação ao grupo controle. A modificação envolveu a introdução de um clipe vascular com perfil pressórico específico no ponto de confluência da VCI com a veia renal esquerda. O clipe foi colocado sobre um espaçador, que era ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
Caliper	VWR International, Radnor, PA	12777-830
CD31	Abcam	Ab9498
Cell Counter	MOXIE	MXZ000
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose,	Accurate Surgical & Scientific Instruments	PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Fibrin	Millipore	MABS2155-100UG
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
MC-38 cell	Sigma Aldrich	SCC172
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Suture- Vicryl	AD-Surgical	#L-G330R24
Suture-Nylon 2-0	Ethilon	664H
Suture-Prolene 5-0	Ethicon	8661G
Suture-Prolene 6-0	Ethicon	PDP127
VEV03100	VisualSonics	FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix	The Well Bioscience	VHM01