癌症小鼠模型中的静脉血栓形成测定

摘要

本文旨在提出一种优化的评估小鼠癌症模型中静脉血栓形成的方法，使用血管夹实现静脉结扎。优化可最大限度地减少血栓形成相关测量的变异性，并增强与人类癌症相关静脉血栓形成的相关性。

摘要

本文重点介绍了静脉血栓形成啮齿动物模型的手术细微差别，特别是在癌症相关血栓形成 （CAT） 的背景下。深静脉血栓形成是癌症幸存者的常见并发症，可能致命。目前的小鼠静脉血栓形成模型通常涉及使用缝合线完全或部分机械闭塞下腔静脉 （IVC）。该过程会引起血液和内皮损伤的全部或部分淤滞，从而引发血栓形成。目前的模型存在局限性，例如凝块重量的变异性较高、死亡率高和学习曲线延长。本报告介绍了使用血管夹的手术改进，以解决其中一些局限性。使用同基因结肠癌异种移植小鼠模型，我们采用定制的血管夹来结扎肾下腔静脉。这些夹子允许残留唇部空间，类似于 IVC 结扎后的 5-0 聚丙烯缝合线。用缝合法的小鼠作为对照。与缝合法相比，血管夹法可产生一致的可重复的部分血管闭塞和更大的凝块重量，且变异性更小。由于与 6-0 聚丙烯缝合线相比，血管夹的压力分布更高，因此预计会出现更大的凝块重量、更大的凝块质量和 IVC 管腔表面积的凝块。该方法通过灰度超声检查得到验证，与缝合方法相比，使用血管夹显示肾下腔静脉中的凝块质量始终更大。免疫荧光染色进一步证实了这些观察结果。本研究提供了一种改进的方法来生成小鼠静脉血栓形成模型，可用于加深对CAT的机制理解和药物发现等转化研究。

引言

癌症相关性静脉血栓栓塞症 （VTE）
与一般人群相比，癌症幸存者的静脉血栓栓塞 （VTE） 风险高 ^4-7 倍 ^1,2,3。这种情况在七分之一的癌症患者中被证明是致命的。静脉血栓栓塞的发病率因癌症类型和肿瘤负荷而异，在胰腺癌和胃癌患者中最高⁴.

癌症患者癌症相关性静脉血栓栓塞具有预后意义。它与癌症诊断后第一年的不良总生存期有关，即使在调整了^{潜在癌症的}年龄、种族和分期后也是如此5。这些发现强调了检查癌症相关VTE的重要性，以及使用动物模型探索其机制的必要性。癌症患者的静脉血栓栓塞可以通过血栓预防和抗血栓治疗来预防和治疗，这一事实进一步强调了该领域的转化相关性⁶。

癌症和静脉血栓形成的动物模型
癌症模型通常被称为异种移植物，需要在小鼠体内注射癌细胞。癌细胞在其起源部位的注射被称为原位模型，而在不同的部位（侧腹的皮下平面）被称为异位模型。癌细胞的起源物种将它们确定为同种异体模型，例如 HT-29 细胞系（人结肠癌）^7,8,9。相反，同基因模型使用小鼠癌细胞系，包括 RenCa 和 MC-38 细胞系 ^3,10。

文献描述了啮齿动物的动脉、静脉和毛细血管血栓形成模型。下腔静脉血栓形成由机械损伤（导丝）或完全 IVC 结扎、化学（氯化铁）或电解损伤诱发。氯化铁诱导的血栓形成或IVC结扎术代表了完整的闭塞模型。后者导致血液淤滞和静脉中的炎症浸润^11,12,13。完整的结扎模型导致95%至100%小鼠的高血栓形成率。部分 IVC 结扎模型可能包括髂外侧分支的中断，并且通过在 IVC¹² 的远端靶点进行缝合结扎来消除静脉回流。有时，使用空间支架来部分中断静脉回流。然而，血栓重量在当前的部分闭塞模型中不一致，导致凝块重量和高度的高度变化^12,14。

这两种大静脉力学模型（部分和完整）都有局限性。首先，IVC结扎（淤滞模型）通常会导致低血压。血液通过椎静脉分流。虽然在有经验的人手中，但该模型的死亡率在 5%-30% 之间，预计在学习曲线期间的死亡率会更高。重要的是，完整的闭塞模型不会在人类中重现深静脉血栓形成 （DVT），其中血栓通常是非闭塞性的。完全闭塞可能会改变血液流变学因素和药效学参数，从而改变局部部位化合物的生物利用度。由于这些局限性，完整的闭塞模型可能不是测试用于治疗目的和药物发现的新型化合物的最佳选择¹²。

应该注意的是，为了提供更具临床相关性的静脉血栓形成小鼠模型，该模型具有内皮损伤导致的血流减少，引入了静脉血栓形成模型，其中在没有内皮破坏的情况下，血流受限引发了DVT。通过扫描电子显微镜对模型^{进行了验证 15}.首选的临床相关血栓形成模型是具有近乎完全血栓形成的模型，以便能够发现药物。当前部分闭塞模型中的凝块形成不一致，导致凝块重量和高度的高度变化很大^12,16。此外，凝块重量与常规方法不同，每项研究需要更多的小鼠¹²。

既往癌症相关血栓形成模型主要集中在结肠癌、胰腺癌和肺癌，均为完全闭塞模型¹⁷、^18、19。该手稿修改了部分闭塞血栓形成模型，以提供具有较低变异性和小鼠死亡率的凝块（图1）。以前的研究在免疫功能低下的无胸腺小鼠背景中使用同种异体癌细胞系19,20,21。该手稿在 C57Bl6/J 小鼠中使用了 MC-38 细胞同源异种移植物，这允许使用免疫功能正常的小鼠并检查血栓形成的免疫成分。

研究方案

在这项研究中，使用了 16 只雌性 C57Bl6/J 小鼠，年龄为 8-12 周龄，体重为 20-25 g。小鼠在标准条件下饲养，并 随意喂食食物和水。这项研究是在波士顿大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准下进行的。这里描述的开放程序是在无菌条件下进行的。

1. 异种移植模型

1. 细胞培养
   1. 在异位皮下植入之前，将 MC-38 细胞作为单层培养至 80% 汇合度。
   2. 胰蛋白酶消化并重悬于含10%FBS的培养基中后，将细胞在277× g，4°C下离心5分钟。然后，将细胞重悬于无血清培养基中，浓度为 1 x 10⁴ MC-38 个细胞/μL 无血清培养基。
      1. 对于胰蛋白酶消化，培养MC-38细胞，直到它们达到所需的汇合度（通常约为70%-80%），然后从培养皿中吸出培养基。
      2. 加入1mL胰蛋白酶-EDTA溶液，并将细胞与胰蛋白酶在37°C下孵育1分钟以使其分离。轻轻敲击或摇晃培养皿以确保均匀分离。
      3. 加入含有血清或胰蛋白酶抑制剂的培养基以中和活性并防止进一步的细胞解离。收集分离的细胞以及中和的胰蛋白酶溶液。
      4. 对于重悬，一旦细胞通过胰蛋白酶消化分离，就准备移植或进一步实验。将收集的细胞悬液以277× g 离心以沉淀细胞。
      5. 小心地除去上清液（细胞沉淀上方的液体）。向细胞沉淀中加入 9 mL 培养基、缓冲液或溶液，以达到移植或实验所需的细胞浓度。
      6. 通过上下移液或使用培养瓶振荡器轻轻地重悬细胞。避免可能损坏细胞的大力移液。
         注：根据所使用的变体或细胞系，细胞可以以 1：1 的比例重悬于溶解的基底膜基质和无血清培养基中，以减缓植入后高度侵袭性的小鼠细胞生长和扩散。所有细胞培养步骤都应在完全无菌罩中，在专门分配的细胞培养空间中进行，并定期进行支原体检测。
   3. 按照提供的手动方案，使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
2. 细胞植入
   1. 将8只小鼠随机分配到实验组，将8只小鼠随机分配到对照组，如下所示。在对照组中，使用具有MC38异种移植物的小鼠，并用聚丙烯5-0缝合线进行IVC结扎。在实验组中，使用具有MC38异种移植物的小鼠，并用定制的血管夹进行IVC结扎。
   2. 将鼠标置于左侧卧位，并在前肢和后肢之间剃除右侧。沿腰背区域涂抹酒精和碘，以无菌方式准备注射区域。
   3. 使用 27G 针头在动物最远端肋骨和骨盆隆起之间的两侧皮下注射 2 x 10⁶ MC-38 细胞，在 200 μL 培养基中制备，同时用非惯用手轻轻握住动物。
   4. 注射后，仔细检查动物并将它们放回笼子里。应检查动物的以下情况;1.小鼠行为、活动水平和整体活动度的变化。任何重大变化都可能表明不适或健康问题。2. 小鼠的整体身体状况，包括皮毛质量、梳理习惯以及任何可见的痛苦或异常迹象 3.恢复食物消耗和饮水量 4.他们的活动水平、姿势或与笼友互动的任何变化。嗜睡或攻击性增加可能是痛苦的迹象。

2. 肿瘤生长的随访

1. 每两周监测动物的肿瘤生长趋势3-4周。用卡尺测量肿瘤并记录肿瘤尺寸。
   1. 沿其最长轴（L）和垂直于长轴（W）的轴测量肿瘤。使用公式L x（W²）= V计算肿瘤体积（V）。如果肿瘤大小在每个维度上超过20毫米，并且/或肿瘤有溃疡的证据，则在实验终止前对动物实施安乐死。
2. 一旦肿瘤体积达到400mm³，计划使用小鼠进行IVC结扎。

3. 麻醉和准备

1. 在异氟烷室中麻醉小鼠并皮下注射镇痛剂：从尾巴底部握住动物。将动物放在非惯用手的背侧。
2. 将动物转移到装有3%-4%异氟烷的连续麻醉诱导室中。确认全身麻醉充分，无脚趾捏反射。使用1%-3%异氟醚的维持剂量。在双眼上涂抹兽医软膏。
3. 皮下注射丁丙诺啡（用于缓解疼痛的阿片类药物）：将浓度为 0.3 mg/mL 的丁丙诺啡原液溶解在 0.9% 氯化钠 （NaCl） 中，以达到 0.03 mg/mL 的浓度。
4. 手术前皮下注射剂量为 0.05-0.1 mg/kg 的 0.03 mg/mL 丁丙诺啡和 500 μL 无菌 0.9% NaCl。在 20 g 小鼠中，需要 2 μg 或 66 μL 的 0.03 mg/mL 丁丙诺啡。
5. 皮肤准备：将完全麻醉的小鼠仰卧放在加热毯上。用 0.5% 氯己定酊剂 2 次对前腹部进行消毒。在手术过程中经常检查加热毯的温度，确保温度不会下降。

4. IVC结扎

1. 中线剖腹手术
   1. 用细剪刀切开腹部皮肤，从剑突隆起到膀胱。用无创伤镊子沿着皮肤切口捏住腹膜的一半。确保切口和上覆肠道之间有足够的空间（图2A）。
   2. 纵向打开腹膜以及无血管白线。
2. 将肠道外侧至右腹部
   1. 用湿棉签拉肠子。用完全湿润的无菌纱布覆盖肠道。确保覆盖的肠道处于无牵引方向，肠系膜血管没有任何过度牵引。
3. IVC和分支的完全暴露，包括左肾静脉与IVC的汇合处（图2B）。
   1. 滴注 200-300 μL 生理盐水。探索输尿管、IVC、主动脉和肾静脉的病程（图2）。
4. 肾下IVC与左肾静脉汇合点交汇处的缺血血管平面。
   1. 用闭合的尖端无创伤镊子将聚丙烯 6-0 缝合线轻轻穿过缺血平面 2x-3 次，并进行尾部到头侧运动。
   2. 确保用棉尖填塞轻轻按压控制任何最小的渗出。通过轻柔的尾部到颅骨运动通过 6-0 聚丙烯缝合线来加宽提供的平面。
5. 烧灼性腺和腰枝（图2D）
   1. 可能存在多达 4 个后支或腰支。为避免脊髓缺血和跛行的潜在并发症，请在当前方案中保持腰椎分支完好无损。
   2. 检查是否存在 2 至 3 个侧支，包括双侧子宫角动脉供应和下腹部血管。确保对第一个双边分支的持续破坏。烧灼左肾静脉和IVC汇合处远端的双侧分支（肾下IVC）。确保子宫角的静脉引流血管不受干扰。
      注意：选择侧支烧灼是因为这种方法提供了光滑且不间断的表面，减少了任何不受控制的出血的可能性。此外，烧灼比 10-0 缝合线的缝合结扎更快、更可行。因此，动物将暴露于更短、更安全的程序中。
6. 仔细检查输尿管的路线和脉管系统，以确保没有任何渗出或无意的烧灼（图2C）。
7. 实验组IVC用血管夹结扎
   1. 通过无创伤镊子定制宽度为 2-0 尼龙缝合线的血管夹。在实验组中围绕肾下IVC周围沿圆周应用定制的血管夹。
   2. 将血管夹套在缝合线上。初级缝合通道提供足够的缺血平面，具有两到三次细致的尾部到颅骨运动（图 2E-F）。
   3. 进一步将血管夹穿过准备好的平面。在左肾静脉和IVC的汇合处准备足够宽的平面，以允许平安无事的夹子通过（图2E）。
   4. 将定制的血管夹水平放置，垂直于IVC课程，穿过准备好的平面。将血管夹放在5-0聚丙烯缝合线上，以确保有足够的剩余空间（图2G）。
   5. 确保轻柔地执行上述步骤，以防止血管夹部位出现任何血管损伤或出血。观察手术区域是否有潜在的渗出。用棉尖轻轻按压手术区域，以防渗出。
8. 对照组IVC缝合结扎术
   1. 用 6-0 聚丙烯缝合线缝合。在准备好的平面上用 5-0 丝线缝合线在肾下 IVC 周围进行手术方结缝合。
   2. 缝合完成后，轻轻取下真丝缝合线以确保有足够的剩余空间。
9. 皮下注射 200 μL 生理盐水。
   注意：为了提供与钳夹应用的部分 IVC 闭塞的可比技术，在当前研究中定制了血管夹以在嘴唇之间提供空间。然后将血管夹放置在左肾静脉和IVC汇合处的准备好的无血管平面中。
10. 用连续运行的 4-0 vicryl 缝合线关闭剖腹手术。

5.指数手术后的随访

1. 术后连续监测动物1小时或直到恢复平衡和扶正能力，无论先在隔离的干净笼子中发生，直到完全恢复。
2. 每天监测动物 2 天。如果动物看起来很痛苦，每天监测两次，持续 2 天。按照方案进行术后镇痛和补液。
   1. 将浓度为0.3mg / mL的丁丙诺啡溶解在0.9%氯化钠（NaCl）中，以达到0.03mg / mL的浓度。
   2. 在指数手术后的前 48 小时内，每 8 至 12 小时皮下注射 0.05-0.1 mg/kg 的 0.03 mg/mL 丁丙诺啡和 500 μL 无菌 0.9% NaCl。在 20 g 小鼠中，需要 2 μg 或 66 μL 的 0.03 mg/mL 丁丙诺啡。

6. 安乐死和收获含有血凝块的 IVC

1. 在异氟烷室中麻醉小鼠，从尾巴底部握住动物，并将动物保持在手的背面。
2. 将动物转移到装有3%-4%异氟烷的连续麻醉诱导室中。将动物置于仰卧位。
3. 如上所述，从剑突到膀胱进行长中线剖腹手术。
4. 将肠外化至腹部右侧，并收获髂骨分叉远端的夹紧IVC，直至肾下IVC的程度（图2G）。
5. 在凝块和肿瘤收获后，对颈椎脱位的动物实施安乐死。

7. 统计分析

1. 将统计分析呈现为平均值、中位数和标准差 （SD） 或平均值 （SEM） 的标准误差、第 25 个或第 75 个百分位数，或整个值范围，包括最小值和最大值（视情况而定）。执行学生 t 检验，并酌情执行 F 检验。评估 p <0.05 水平的统计显着性。

结果

一组8-12周龄的雌性C57Bl6/J小鼠在细胞生长的对数期注射MC-38细胞。异种移植物在注射后第三周和第四周之间迅速生长¹⁸.一旦肿瘤达到平均体积400mm³，小鼠随机分配到对照组和实验组。对照组采用缝合线进行IVC结扎，实验小鼠采用血管夹进行IVC结扎。对照组和实验组的肿瘤体积相当，无显著差异（353 ± 100 mm 3 vs. 367 ± 46.2 mm^3，p = 0.445）。48 小时后收集到含有...

讨论

在同基因异种移植结肠癌模型中，与对照组相比，我们观察到实验组的血栓形成性和凝血标志物的表达更高。重要的是，与对照组相比，实验组所有这些参数的方差都较低。修改涉及在 IVC 和左肾静脉的汇合点引入具有特定压力分布的血管夹。将夹子放置在垫片上，垫片是 5-0 聚丙烯缝合线。这种修改减少了凝块大小和血栓形成标志物的变异性。所有小鼠都经历了100%的存活率。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
Caliper	VWR International, Radnor, PA	12777-830
CD31	Abcam	Ab9498
Cell Counter	MOXIE	MXZ000
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose,	Accurate Surgical & Scientific Instruments	PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Fibrin	Millipore	MABS2155-100UG
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
MC-38 cell	Sigma Aldrich	SCC172
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Suture- Vicryl	AD-Surgical	#L-G330R24
Suture-Nylon 2-0	Ethilon	664H
Suture-Prolene 5-0	Ethicon	8661G
Suture-Prolene 6-0	Ethicon	PDP127
VEV03100	VisualSonics	FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix	The Well Bioscience	VHM01