Essai de thrombose veineuse dans un modèle murin de cancer

Résumé

Cet article vise à présenter une méthode optimisée pour évaluer la thrombose veineuse dans un modèle de cancer de souris, en utilisant des clips vasculaires pour réaliser une ligature veineuse. L’optimisation minimise la variabilité des mesures liées à la thrombose et améliore la pertinence pour la thrombose veineuse associée au cancer humain.

Résumé

Cet article méthodologique met en évidence les nuances chirurgicales d’un modèle de thrombose veineuse chez le rongeur, en particulier dans le contexte de la thrombose associée au cancer (CAT). La thrombose veineuse profonde est une complication fréquente chez les survivants du cancer et peut être potentiellement mortelle. Les modèles actuels de thrombose veineuse murine impliquent généralement une occlusion mécanique complète ou partielle de la veine cave inférieure (IVC) à l’aide d’une suture. Cette procédure induit une stase totale ou partielle du sang et des lésions endothéliales, déclenchant une thrombogenèse. Les modèles actuels présentent des limites telles qu’une plus grande variabilité du poids des caillots, un taux de mortalité important et une courbe d’apprentissage prolongée. Ce rapport présente des améliorations chirurgicales à l’aide de clips vasculaires pour remédier à certaines de ces limitations. À l’aide d’un modèle murin de xénogreffe de cancer du côlon syngénique, nous avons utilisé des clips vasculaires personnalisés pour ligaturer la veine cave infrarouge. Ces clips permettent un espace résiduel des lèvres similaire à celui d’une suture en polypropylène 5-0 après une ligature IVC. Des souris avec la méthode de suture ont servi de témoins. La méthode du clip vasculaire a permis d’obtenir une occlusion vasculaire partielle reproductible et cohérente et un poids de caillot plus important avec moins de variabilité que la méthode de suture. On s’attendait à ce que le poids du caillot soit plus important, la plus grande masse du caillot et la plus grande surface luminale de l’IVC en raison du profil de pression plus élevé des clips vasculaires par rapport à une suture en polypropylène 6-0. L’approche a été validée par échographie en niveaux de gris, qui a révélé une masse de caillot systématiquement plus importante dans la veine cave infrarouge avec des clips vasculaires par rapport à la méthode de suture. Ces observations ont été corroborées par la coloration par immunofluorescence. Cette étude propose une méthode améliorée pour générer un modèle de thrombose veineuse chez la souris, qui peut être utilisé pour approfondir la compréhension mécanistique de la tomodensitométrie et dans la recherche translationnelle telle que la découverte de médicaments.

Introduction

Thromboembolie veineuse associée au cancer (TEV)
Le risque de thromboembolie veineuse (TEV) est 4 à 7 fois plus élevé chez les survivants du cancer que dans la population générale ^1,2,3. Cette affection s’avère mortelle chez un patient sur sept atteint d’un cancer. L’incidence de la TEV varie en fonction du type de cancer et de la charge tumorale et est la plus élevée chez les patients atteints de cancers du pancréas et de l’estomac⁴.

La TEV associée au cancer chez les patients cancéreux a une signification pronostique. Il est associé à une survie globale défavorable au cours de la première année suivant un diagnostic de cancer, même après ajustement en fonction de l’âge, de la race et du stade du cancer sous-jacent⁵. Ces résultats soulignent l’importance d’examiner la TEV associée au cancer et la nécessité de sonder son mécanisme à l’aide d’un modèle animal. La pertinence translationnelle de ce domaine est encore soulignée par le fait que la TEV chez les patients cancéreux peut être évitée et traitée par thromboprophylaxie et traitement antithrombotique⁶.

Modèles animaux de cancer et de thrombose veineuse
Les modèles de cancer sont conventionnellement appelés xénogreffes, qui impliquent l’injection de cellules cancéreuses chez la souris. L’injection de cellules cancéreuses à un site comme son origine est appelée modèle orthotopique, tandis qu’à un site différent (plan sous-cutané sur le flanc) est connue sous le nom de modèle hétérotopique. L’espèce d’origine des cellules cancéreuses les détermine en tant que modèle allogénique, comme la lignée cellulaire HT-29 (cancer du côlon humain)^7,8,9. Au contraire, les modèles syngéniques utilisent les lignées cellulaires cancéreuses murines, y compris les lignées cellulaires RenCa et MC-38 ^3,10.

La littérature a décrit des modèles de thrombose artérielle, veineuse et capillaire chez les rongeurs. La thrombose veineuse est induite dans la veine cave inférieure (IVC) par une lésion mécanique (fil guide) ou une ligature IVC complète, chimique (chlorure ferrique) ou électrolytique. La thrombose induite par le chlorure ferrique ou la ligature IVC représentent des modèles d’occlusion complets. Ce dernier se traduit par la stase du sang et des infiltrats inflammatoires dans les veines^11,12,13. Le modèle de ligature complète entraîne un taux élevé de formation de thrombose chez 95 % à 100 % des souris. Le modèle de ligature partielle de l’IVC peut inclure l’interruption des branches latérales ilio-lombaires, et le retour veineux est abrogé par l’application de ligature de suture dans les points cibles distaux de l’IVC¹². Parfois, un support d’espace est utilisé pour interrompre partiellement le retour veineux. Cependant, le poids du thrombus est incohérent dans le modèle actuel d’occlusion partielle, ce qui entraîne une grande variabilité du poids et de la taille des caillots^12,14.

Ces deux modèles mécaniques de grandes veines (partiels et complets) ont des limites. Tout d’abord, la ligature IVC (modèle de stase) entraîne souvent une hypotension. Le sang est dévié dans les veines vertébrales. Bien qu’entre des mains expérimentées, la mortalité avec ce modèle varie de 5 % à 30 %, le taux le plus élevé étant attendu au cours de la courbe d’apprentissage. Il est important de noter que le modèle d’occlusion complète ne reproduit pas la thrombose veineuse profonde (TVP) chez l’homme, où un thrombus est généralement non occlusif. L’occlusion complète est susceptible d’altérer les facteurs hémorhéologiques et les paramètres pharmacodynamiques, modifiant la biodisponibilité des composés sur le site local. En raison de ces limitations, les modèles d’occlusion complète peuvent ne pas être optimaux pour tester de nouveaux composés chimiques à des fins thérapeutiques et pour la découverte de médicaments¹².

Il convient de noter que pour fournir un modèle murin plus pertinent sur le plan clinique de la thrombose veineuse avec diminution du débit avec lésions endothéliales, un modèle de thrombose veineuse a été introduit, où la TVP est déclenchée par la restriction du flux sanguin en l’absence de perturbation endothéliale. Le modèle a été validé par microscopie électronique^{à balayage 15}. Un modèle de thrombose cliniquement pertinent privilégié est celui avec une thrombose presque complète qui permet la découverte de médicaments. La formation de caillots dans les modèles actuels d’occlusion partielle est incohérente, ce qui entraîne une grande variabilité du poids et de la hauteur du caillot^12,16. De plus, le poids du caillot est variable avec les méthodes conventionnelles, ce qui nécessite plus de souris par étude¹².

Les modèles précédents de thrombose associée au cancer se concentraient sur le cancer du côlon, du pancréas et du poumon et étaient tous des modèles d’occlusion complète^17,18,19. Ce manuscrit modifie le modèle de thrombose d’occlusion partielle afin de réduire la variabilité et la mortalité des souris dans les caillots (Figure 1). Des études antérieures ont utilisé des lignées cellulaires cancéreuses allogéniques sur des souris athymiques immunodéprimées 19,20,21. Ce manuscrit utilise une xénogreffe syngénique de cellules MC-38 chez des souris C57Bl6/J, ce qui permet l’utilisation de souris immunocompétentes et l’examen des composants immunitaires de la thrombogenèse.

Protocole

Pour cette étude, 16 souris femelles C57Bl6/J, âgées de 8 à 12 semaines et pesant entre 20 et 25 g, ont été utilisées. Les souris ont été logées dans des conditions standard et ont été nourries avec de la nourriture et de l’eau ad libitum. Cette étude a été réalisée avec l’approbation de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Boston. Les procédures ouvertes décrites ici ont été entreprises dans un état stérile.

1. Modèle de xénogreffe

1. Culture cellulaire
   1. Avant l’implantation sous-cutanée hétérotopique, faire croître les cellules MC-38 en monocouche jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence.
   2. Après trypsinisation et remise en suspension dans un milieu contenant 10 % de FBS, centrifuger les cellules à 277 x g, 4 °C pendant 5 min. Ensuite, remettre les cellules en suspension dans un milieu sans sérum à une concentration de 1 x 10⁴ cellules MC-38/μL de milieu sans sérum.
      1. Pour la trypsinisation, cultivez les cellules MC-38 jusqu’à ce qu’elles atteignent la confluence souhaitée (généralement autour de 70 % à 80 %), puis aspirez le milieu de culture de la boîte de Pétri.
      2. Ajouter 1 mL de solution de trypsine-EDTA et incuber les cellules avec de la trypsine pendant 1 min à 37 °C pour permettre le décollement. Tapotez ou secouez doucement la boîte de Pétri pour assurer un décollement uniforme.
      3. Ajouter un milieu de culture contenant du sérum ou un inhibiteur de trypsine pour neutraliser l’activité et empêcher une dissociation cellulaire supplémentaire. Recueillir les cellules détachées avec la solution de trypsine neutralisée.
      4. Pour la remise en suspension, une fois que les cellules sont détachées par trypsinisation, préparez-les pour la transplantation ou d’autres expériences. Centrifuger la suspension cellulaire recueillie à 277 x g pour granuler les cellules.
      5. Retirez délicatement le surnageant (liquide au-dessus de la pastille de la cellule). Ajouter 9 mL de milieu de culture, de tampon ou de solution à la pastille cellulaire pour obtenir la concentration cellulaire souhaitée pour la transplantation ou l’expérimentation.
      6. Remettre doucement les cellules en suspension en pipetant de haut en bas ou à l’aide d’un agitateur de flacon de culture. Évitez les pipetages vigoureux qui pourraient endommager les cellules.
         REMARQUE : Selon la variante ou la lignée cellulaire utilisée, les cellules peuvent être remises en suspension dans un rapport de 1 :1 de matrice membranaire basale solubilisée et de milieu sans sérum pour ralentir la croissance et la dissémination des cellules de souris hautement agressives après l’implantation. Toutes les étapes de la culture cellulaire doivent être entreprises dans une hotte aseptique complète dans un espace spécifiquement alloué à la culture cellulaire et ont été testées régulièrement pour les mycoplasmes.
   3. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé selon le protocole manuel fourni.
2. Implantation cellulaire
   1. Assignez au hasard huit souris au groupe expérimental et huit souris au groupe témoin comme suit. Dans le groupe témoin, utilisez des souris avec une xénogreffe MC38 et effectuez une ligature IVC avec une suture en polypropylène 5-0. Dans le groupe expérimental, utilisez des souris avec une xénogreffe MC38 et effectuez une ligature IVC avec un clip vasculaire personnalisé.
   2. Placez la souris en décubitus latéral gauche et rasez le côté droit entre les membres antérieurs et postérieurs. Appliquez de l’alcool et de l’iode le long de la région lombaire dorsale pour préparer de manière aseptique la zone pour l’injection.
   3. Injecter 2 x 10⁶ cellules MC-38 préparées dans 200 μL de milieu par voie sous-cutanée dans le flanc, à mi-chemin entre la côte la plus distale et l’éminence pelvienne de l’animal à l’aide d’une aiguille 27G tout en tenant doucement l’animal dans la main non dominante.
   4. Après l’injection, inspectez soigneusement les animaux et remettez-les dans la cage. Les animaux doivent être inspectés pour les éléments suivants : 1. Changements dans le comportement, les niveaux d’activité et la mobilité globale des souris. Tout changement significatif pourrait indiquer un inconfort ou des problèmes de santé. 2. L’état physique général des souris, y compris la qualité de la fourrure, les habitudes de toilettage et tout signe visible de détresse ou d’anomalie 3. Retour à la consommation alimentaire et à la consommation d’eau 4. Tout changement dans leur niveau d’activité, leur posture ou leurs interactions avec leurs compagnons de cage. Une léthargie ou une agressivité accrue pourraient être des signes de détresse.

2. Suivi de la croissance tumorale

1. Surveillez les animaux toutes les deux semaines pour détecter les tendances de croissance tumorale pendant 3 à 4 semaines. Mesurez les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse et notez les dimensions de la tumeur.
   1. Mesurez les tumeurs le long de leur axe le plus long (L) et de l’axe perpendiculaire au grand axe (W). Calculer le volume de la tumeur (V) à l’aide de l’équation L x (W²) = V. Si la taille de la tumeur dépasse 20 mm dans chaque dimension et/ou que la tumeur présente des signes d’ulcération, euthanasiez les animaux avant la fin de l’expérience.
2. Une fois que le volume de la tumeur atteint 400 mm³, prévoyez d’utiliser les souris pour la ligature IVC.

3. Anesthésie et préparation

1. Anesthésier la souris dans une chambre isoflurane et injecter l’analgésique par voie sous-cutanée : Tenez l’animal à partir de la base de la queue. Gardez l’animal sur la surface dorsale de la main non dominante.
2. Transférez l’animal dans la chambre d’induction d’anesthésie continue remplie d’isoflurane à 3 à 4 %. Confirmer l’anesthésie générale adéquate avec l’absence d’un réflexe de pincement des orteils. Utilisez une dose d’entretien de 1 % à 3 % d’isoflurane. Appliquez une pommade vétérinaire sur les deux yeux.
3. Injection sous-cutanée de buprénorphine (opioïde pour atténuer la douleur) : Dissoudre le bouillon de buprénorphine à une concentration de 0,3 mg/mL dans du chlorure de sodium (NaCl) à 0,9 % pour atteindre la concentration de 0,03 mg/mL.
4. Injecter une dose de 0,05 à 0,1 mg/kg de buprénorphine à 0,03 mg/mL avec 500 μL de NaCl stérile à 0,9 % par voie sous-cutanée avant la chirurgie. Dans une quantité de 20 g de souris de 2 μg ou 66 μL de 0,03 mg/mL de buprénorphine est nécessaire.
5. Préparation de la peau : Placez la souris entièrement anesthésiée en position couchée sur le dos sur la couverture chauffante. Désinfecter la zone abdominale antérieure avec de la teinture de chlorhexidine à 0,5 %, 2x. Vérifiez fréquemment la température de la couverture chauffante pendant la procédure et assurez-vous que la température ne baisse pas.

4. Ligature IVC

1. Laparotomie médiane
   1. Inciser la peau abdominale avec des ciseaux fins en partant de l’éminence xiphoïdale jusqu’à la vessie. Pincez le péritoine à mi-chemin de l’incision cutanée avec une pince atraumatique. Assurez-vous d’avoir suffisamment d’espace entre l’incision et les intestins sus-jacents (figure 2A).
   2. Ouvrir le péritoine de manière longitudinale avec la linea alba avasculaire.
2. Extériorisation des intestins vers le côté droit de l’abdomen
   1. Tirez sur les intestins avec des cotons-tiges humides. Couvrir les intestins d’une gaze stérile complètement humide. Assurez-vous que les intestins couverts sont dans une direction sans traction sans traction excessive sur les vaisseaux mésentériques.
3. Exposition complète de la CIV et des branches, y compris la confluence de la veine rénale gauche à la CIV (Figure 2B).
   1. Déposer 200 à 300 μL de solution saline normale. Explorez l’évolution des uretères, de l’IVC, de l’aorte et des veines rénales (Figure 2).
4. Plan avasculaire au point de confluence de la IVC infra-rénale et de la confluence de la veine rénale gauche.
   1. Passez doucement la suture en polypropylène 6-0 à travers le plan avasculaire 2x-3x avec des mouvements caudaux à céphalés avec la pince atraumatique à pointe fermée.
   2. Assurez-vous que tout suintement minimal est contrôlé avec une légère pression munie d’un tampon coton. Élargissez le plan fourni en passant la suture en polypropylène 6-0 avec de légers mouvements caudaux à crâniens.
5. Cautérisation des branches gonadique et lombaire (Figure 2D)
   1. Jusqu’à 4 branches postérieures ou lombaires peuvent être présentes. Pour éviter les complications potentielles de l’ischémie spinale et de la claudication, laissez les branches lombaires intactes dans le protocole actuel.
   2. Vérifiez que 2 à 3 branches latérales, y compris l’alimentation artérielle bilatérale de la corne utérine et les vaisseaux hypogastriques, sont présentes. Assurer une perturbation constante des premières succursales bilatéralement présentes. Cautériser les branches bilatérales juste distales à la confluence de la veine rénale gauche et de la CVI (IVC infra-rénale). Assurez-vous que les vaisseaux de drainage veineux de la corne utérine ne sont pas perturbés.
      REMARQUE : La cautérisation des branches latérales est choisie car cette méthode fournit une surface lisse et ininterrompue, réduisant tout risque de saignement incontrôlé. De plus, la cautérisation est plus rapide et plus réalisable que la ligature des sutures avec des sutures 10-0. Par conséquent, les animaux seront exposés à une procédure plus courte et plus sûre.
6. Vérifiez le trajet des uretères et le système vasculaire pour vous assurer qu’il n’y a pas de suintement ou de cautérisation accidentelle (Figure 2C).
7. Ligature IVC avec clips vasculaires dans le groupe expérimental
   1. Personnalisez les clips vasculaires avec une largeur de suture en nylon 2-0 à l’aide d’une pince atraumatique. Appliquez les clips vasculaires personnalisés dans le groupe expérimental sur la circonférence autour de la IVC infrarouge.
   2. Appliquez les clips vasculaires sur la suture. Le passage de suture primaire fournit un plan avasculaire suffisant avec deux à trois mouvements caudaux à crâniens méticuleux (Figure 2E-F).
   3. Passez ensuite les clips vasculaires à travers le plan préparé. Préparez le plan à la confluence de la veine rénale gauche et de la veine intraveineuse suffisamment large pour permettre un passage sans incident (Figure 2E).
   4. Placez le clip vasculaire personnalisé horizontalement, perpendiculairement à la trajectoire IVC, à travers le plan préparé. Placez les clips vasculaires sur la suture en polypropylène 5-0 pour assurer un espace restant suffisant (Figure 2G).
   5. Assurez-vous que les étapes ci-dessus sont effectuées en douceur pour éviter tout dommage aux vaisseaux ou saignement au site des clips vasculaires. Observez le champ chirurgical pour détecter d’éventuels suintements. Appliquez une légère pression avec le coton-tige sur le champ chirurgical en cas de suintement.
8. Ligature IVC avec suture dans le groupe témoin
   1. Ligature de suture avec suture en polypropylène 6-0. Faites une suture chirurgicale à nœud carré autour de la CIV infra-rénale dans le plan préparé sur une suture en soie 5-0.
   2. Une fois la suture terminée, retirez délicatement la suture en soie pour assurer un espace suffisant pour les restes.
9. Effectuer une injection sous-cutanée de 200 μL de solution saline normale.
   REMARQUE : Pour fournir une technique comparable pour l’occlusion partielle IVC avec application de pince, le clip vasculaire est personnalisé dans la présente étude pour fournir de l’espace entre les lèvres. Le clip vasculaire est ensuite placé dans le plan avasculaire préparé à la confluence de la veine rénale gauche et de la CIV.
10. Fermer la laparotomie avec une suture de vicryle 4-0 en cours continu.

5. Suivi après la chirurgie de l’index

1. Surveiller l’animal en continu après l’opération pendant 1 h ou jusqu’à ce que l’équilibre et la capacité de redressement soient rétablis, selon ce qui vient en premier dans une cage propre isolée jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli.
2. Surveillez l’animal quotidiennement pendant 2 jours. Si l’animal a l’air en détresse, surveillez-le deux fois par jour pendant 2 jours. Administrer l’analgésie postopératoire et les liquides selon le protocole.
   1. Dissoudre le bouillon de buprénorphine à une concentration de 0,3 mg/mL dans du chlorure de sodium (NaCl) à 0,9 % pour atteindre la concentration de 0,03 mg/mL.
   2. Injecter une dose de 0,05 à 0,1 mg/kg de buprénorphine à 0,03 mg/mL par voie sous-cutanée avec 500 μL de NaCl stérile à 0,9 %, toutes les 8 à 12 h pendant les 48 premières heures suivant la chirurgie index. Chez une souris de 20 g, 2 μg ou 66 μL de buprénorphine à 0,03 mg/mL seraient nécessaires.

6. Euthanasie et prélèvement de la CVI contenant le caillot

1. Anesthésiez la souris dans une chambre isoflurane, tenez l’animal à partir de la base de la queue et gardez l’animal sur la surface dorsale de votre main.
2. Transférez l’animal dans la chambre d’induction d’anesthésie continue remplie d’isoflurane à 3 à 4 %. Placez l’animal en décubitus dorsal.
3. Effectuer une laparotomie longue médiane en partant du xiphoïde jusqu’à la vessie comme décrit.
4. Extérioriser l’intestin sur le côté droit de l’abdomen et prélever la CIV serrée distale à la bifurcation iliaque jusqu’à la mesure de la CIV infra-rénale (Figure 2G).
5. Après le prélèvement du caillot et de la tumeur, euthanasier l’animal présentant une luxation cervicale.

7. Analyse statistique

1. Présenter l’analyse statistique sous la forme de la moyenne, de la médiane et de l’écart-type (ET) ou de l’erreur-type de la moyenne (SEM), du 25e ou du 75e centile, ou de l’ensemble de la plage de valeurs, y compris les valeurs minimales et maximales, selon le cas. Effectuez un test t de Student et le test F, le cas échéant. Évaluer la signification statistique au niveau p <0,05.

Résultats

Un groupe de souris femelles C57Bl6/J, âgées de 8 à 12 semaines, a reçu une injection de cellules MC-38 à la phase logarithmique de la croissance cellulaire. Les xénogreffes se sont développées rapidement entre la troisième et la quatrième semaine après l’injection¹⁸. Une fois que les tumeurs ont atteint un volume moyen de 400 mm³, les souris ont été randomisées dans les groupes témoin et expérimental. Le groupe témoin a subi une ligature IVC avec suture, tandis que l...

Discussion

Dans un modèle de cancer du côlon par xénogreffe syngénique, nous observons une thrombogénicité et des expressions plus élevées des marqueurs de coagulation dans le groupe expérimental par rapport au groupe témoin. Il est important de noter que la variance de tous ces paramètres était plus faible dans le groupe expérimental que dans le groupe témoin. La modification a consisté à introduire un clip vasculaire avec un profil de pression spécifique au point de confluence de l’IVC et de la veine rénale ga...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
Caliper	VWR International, Radnor, PA	12777-830
CD31	Abcam	Ab9498
Cell Counter	MOXIE	MXZ000
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose,	Accurate Surgical & Scientific Instruments	PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Fibrin	Millipore	MABS2155-100UG
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
MC-38 cell	Sigma Aldrich	SCC172
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Suture- Vicryl	AD-Surgical	#L-G330R24
Suture-Nylon 2-0	Ethilon	664H
Suture-Prolene 5-0	Ethicon	8661G
Suture-Prolene 6-0	Ethicon	PDP127
VEV03100	VisualSonics	FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix	The Well Bioscience	VHM01