癌のマウスモデルにおける静脈血栓症アッセイ

要約

本稿では、マウスがんモデルにおける静脈血栓症を評価するための最適化された方法を提示し、血管クリップを使用して静脈結紮を実現します。最適化により、血栓症関連の測定値のばらつきが最小限に抑えられ、ヒトのがん関連静脈血栓症との関連性が高まります。

要約

この方法論の論文は、静脈血栓症のげっ歯類モデルの外科的ニュアンス、特に癌関連血栓症(CAT)の文脈で強調しています。深部静脈血栓症は、がん生存者によくみられる合併症であり、致命的となる可能性がある。現在のマウス静脈血栓症モデルでは、通常、縫合糸を使用した下大静脈(IVC)の完全または部分的な機械的閉塞が含まれます。この手順は、血液および内皮損傷の全体的または部分的なうっ滞を誘発し、血栓形成を引き起こします。現在のモデルには、血栓重量の変動性が高い、死亡率が有意である、学習曲線が長いなどの制限があります。このレポートでは、これらの制限のいくつかに対処するために、血管クリップを使用した外科的改良を紹介します。同系結腸癌異種移植マウスモデルを用いて、カスタマイズされた血管クリップを用いて、腎下大静脈を結紮しました。これらのクリップは、IVC結紮後の5-0ポリプロピレン縫合糸と同様の唇の残存スペースを可能にします。縫合法を用いたマウスを対照とした。血管クリップ法は、縫合法よりも変動の少ない、一貫した再現性のある部分血管閉塞とより大きな血栓重量をもたらしました。より大きな血栓重量、より大きな血栓量、およびIVC管腔表面積への血栓は、6-0ポリプロピレン縫合糸と比較して血管クリップの圧力プロファイルが高いため、予想されました。このアプローチはグレースケール超音波検査によって検証され、縫合法と比較して、血管クリップを使用した腎下大静脈の血栓量が一貫して大きいことが示されました。これらの観察結果は、免疫蛍光染色でさらに実証されました。本研究は、マウスの静脈血栓症モデルを作製する方法を改良したもので、CATのメカニズムの理解を深めるとともに、創薬などのトランスレーショナルリサーチに活用することができます。

概要

がん関連静脈血栓塞栓症(VTE)
静脈血栓塞栓症(VTE)のリスクは、^{一般集団と比較して}、がん生存者では4〜7倍高い1,2,3。この状態は、がん患者の7人に1人で致命的であることが証明されています。VTEの発生率は、がんの種類や腫瘍量によって異なり、膵臓がんおよび胃がんの患者で最も高く^{なっています4。}

がん患者におけるがん関連VTEは予後的に重要である。これは、年齢、人種、および基礎となるがんの病期を調整した後でも^{、がん診断}後1年間の予後1年間の予後の全生存率の不良と関連している5。これらの知見は、がん関連VTEを調べることの重要性と、動物モデルを用いてそのメカニズムを調べる必要性を強調している。この領域のトランスレーショナルな関連性は、がん患者のVTEが血栓予防と抗血栓療法で予防および治療可能であるという事実によってさらに強調^{されています6。}

がんと静脈血栓症の動物モデル
がんモデルは従来、異種移植片と呼ばれ、マウスにがん細胞を注入します。がん細胞をその起源のような部位に注入することは同所性モデルと呼ばれ、別の部位(脇腹の皮下面)への注入は異所性モデルとして知られています。がん細胞の起源種は、HT-29細胞株(ヒト結腸がん)などの同種モデルとして決定します^7,8,9。それどころか、同系モデルでは、RenCa細胞株やMC-38細胞株などのマウスがん細胞株を使用します^3,10。

文献には、げっ歯類の動脈血栓、静脈血栓症、毛細血管血栓症モデルが記載されています。静脈血栓症は、機械的損傷(ガイドワイヤー)または完全なIVC結紮、化学物質(塩化第二鉄)、または電解損傷によって下大静脈(IVC)に誘発されます。塩化第二鉄誘発性血栓症またはIVCライゲーションは、完全な閉塞モデルを表します。後者は、静脈に血液と炎症性浸潤のうっ滞をもたらします11,12,13。完全なライゲーションモデルでは、マウスの95%から100%で血栓症の形成率が高くなっています。部分的なIVC結紮モデルには、外側腸腰部枝の中断が含まれる場合があり、静脈還流は、^IVC12の遠位標的点に縫合糸結紮を適用することによって廃止されます。時には、静脈還流を部分的に中断するためにスペースホルダーが使用されます。しかし、現在の部分閉塞モデルでは血栓重量に一貫性がなく、血栓重量と高さに大きなばらつきが生じている^12,14。

これらの大きな静脈の力学モデル(部分的および完全)には制限があります。まず、IVC結紮(うっ滞モデル)はしばしば低血圧を引き起こします。血液は椎体静脈を通ってシャントされます。経験豊富な手ではありますが、このモデルの死亡率は5%〜30%の範囲であり、学習曲線中により高い率が予想されます。重要なことは、完全な閉塞モデルでは、血栓が通常非閉塞性であるヒトの深部静脈血栓症(DVT)を再現しないことです。完全な閉塞は、出血性因子と薬力学的パラメータを変化させ、局所部位の化合物のバイオアベイラビリティを変化させる可能性があります。これらの制限により、完全閉塞モデルは、治療目的や創薬のための新規化合物の試験には最適ではない可能性があります¹²。

内皮損傷を伴う血流の減少を伴う静脈血栓症のより臨床的に関連性のあるマウスモデルを提供するために、静脈血栓症モデルが導入されており、DVTは内皮破壊がない場合の血流の制限によって引き起こされることに注意する必要があります。このモデルは、走査型電子顕微鏡¹⁵によって検証された。好ましい臨床的に関連する血栓症モデルは、創薬を可能にするほぼ完全な血栓症のモデルです。現在の部分咬合モデルにおける血栓形成は一貫性がなく、その結果、血栓の重量と高さに大きなばらつきが生じます^12,16。さらに、血栓重量は従来の方法で変動するため、研究ごとにより多くのマウスが必要になります¹²。

以前のがん関連血栓症モデルは、結腸がん、膵臓がん、および肺がんに焦点を当てており、すべて完全閉塞モデルでした^17,18,19。この原稿では、部分咬合血栓モデルを修正して、変動性とマウス死亡率の低い血栓を提供します(図1)。以前の研究では、免疫不全の胸腺マウスのバックグラウンドで同種癌細胞株が使用されました^19,20,21。この原稿では、C57Bl6/JマウスにMC-38細胞同系異種移植片を使用しており、免疫担当マウスを使用して、血栓形成に対する免疫成分を調べることができます。

プロトコル

この研究では、16匹の雌のC57Bl6 / Jマウス、8〜12週齢、体重20〜25gを使用しました。マウスは標準的な条件下で飼育され、餌と水を 自由に与えられました。この研究は、ボストン大学のInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)の承認を得て実施されました。ここで説明するオープン手順は、無菌状態で行われました。

1. 異種移植モデル

1. 細胞培養
   1. 異所性皮下移植の前に、MC-38細胞を単層として80%のコンフルエントまで増殖させます。
   2. トリプシン処理と10%FBS含有培地への再懸濁後、細胞を277 x g、4°Cで5分間遠心分離します。次に、細胞を無血清培地に再懸濁し、1 x 10⁴ MC-38細胞/μLの無血清培地に濃度を下げます。
      1. トリプシン処理では、MC-38細胞を所望の合流点(通常は約70%〜80%)に達するまで培養し、ペトリ皿から培地を吸引します。
      2. 1 mLのトリプシン-EDTA溶液を加え、細胞をトリプシンとともに37°Cで1分間インキュベートして剥離させます。ペトリ皿を軽くたたくか振って、均一に外れるようにします。
      3. 血清またはトリプシン阻害剤を含む培地を添加して活性を中和し、それ以上の細胞解離を防ぎます。分離した細胞を中和トリプシン溶液と一緒に回収します。
      4. 再懸濁の場合、トリプシン処理によって細胞が剥離されたら、移植またはさらなる実験のために準備します。回収した細胞懸濁液を277 x g で遠心分離し、細胞をペレット化します。
      5. 上清(細胞ペレットの上の液体)を慎重に取り除きます。9 mLの培地、緩衝液、または溶液を細胞ペレットに添加して、移植または実験に必要な細胞濃度を達成します。
      6. ピペッティングで上下させるか、培養フラスコシェーカーを使用して、細胞を静かに再懸濁します。細胞に損傷を与える可能性のある激しいピペッティングは避けてください。
         注:使用する変異体または細胞株に応じて、可溶化基底膜マトリックスと無血清培地を1:1の比率で細胞を再懸濁し、移植後の非常に攻撃的なマウス細胞の増殖と播種を遅らせることができます。すべての細胞培養ステップは、細胞培養に特別に割り当てられたスペース内の完全な無菌フードで実施し、マイコプラズマについて定期的にテストする必要があります。
   3. 提供された手動プロトコルに従って、自動セルカウンターでセルをカウントします。
2. 細胞移植
   1. 以下のように、8匹のマウスを実験群に、8匹のマウスを対照群にランダムに割り付けます。対照群では、MC38異種移植片を有するマウスを使用し、ポリプロピレン5-0縫合糸を用いてIVCライゲーションを行う。実験グループでは、MC38異種移植片を備えたマウスを使用し、カスタマイズされた血管クリップでIVCライゲーションを行います。
   2. マウスを左横臥に置き、前肢と後肢の間の右側を剃ります。背側腰部に沿ってアルコールとヨウ素を塗布し、注射用の領域を無菌的に準備します。
   3. 200 μLの培地で調製した2 x 10⁶ 個のMC-38細胞を、27Gの針を使用して、動物の最も遠位肋骨と骨盤隆起の中間にある脇腹に、利き手でない手で動物を優しく保持しながら皮下に注入します。
   4. 注射後、動物を注意深く検査し、ケージに戻します。動物は、以下の点について検査する必要があります。1.マウスの行動、活動レベル、および全体的な移動性の変化。重大な変化は、不快感や健康上の問題を示している可能性があります。2.毛皮の質、毛づくろいの習慣、苦痛や異常の目に見える兆候など、マウスの全体的な体調 3.食物摂取と水分摂取に戻る 4.活動レベル、姿勢、ケージメイトとの相互作用の変化。嗜眠や攻撃性の増加は、苦痛の兆候である可能性があります。

2.腫瘍増殖のフォローアップ

1. 隔週で動物を観察し、腫瘍の成長傾向を3〜4週間観察します。ノギスで腫瘍を測定し、腫瘍の大きさを記録します。
   1. 最長軸(L)と長軸(W)に垂直な軸に沿って腫瘍を測定します。方程式Lx(W²)= Vを使用して腫瘍体積(V)を計算します。腫瘍の大きさが各寸法で20mmを超える場合、または腫瘍に潰瘍の証拠がある場合は、実験を終了する前に動物を安楽死させます。
2. 腫瘍の体積が400mm3に達したら、IVC結紮にマウスを使用する計画を立てます。

3.麻酔と準備

1. イソフルランチャンバーでマウスを麻酔し、鎮痛剤を皮下に注射します。 尾の付け根から動物を抱きしめます。動物を利き手でない手の背側表面に置いてください。
2. 動物を3%〜4%のイソフルランで満たされた連続麻酔誘導チャンバーに移します。つま先をつまむ反射がない状態で適切な全身麻酔を確認します。1%〜3%のイソフルランの維持用量を使用してください。.両目に獣医の軟膏を塗ります。
3. ブプレノルフィン(痛みを和らげるためのオピオイド)による皮下注射:ブプレノルフィンのストックを0.3 mg / mLの濃度で0.9%塩化ナトリウム(NaCl)に溶解し、0.03 mg / mLの濃度にします。.
4. 手術前に、0.05〜0.1 mg / kgの0.03 mg / mLブプレノルフィンと500 μLの滅菌0.9%NaClを皮下に注射します。.20 gのマウスでは、2 μgまたは66 μLの0.03 mg / mLのブプレノルフィンが必要です。.
5. 皮膚の準備:完全に麻酔をかけたマウスを、加熱ブランケットの上に仰臥位で置きます。前腹部を0.5%クロルヘキシジンチンキで2回消毒します。手順中に加熱ブランケットの温度を頻繁にチェックし、温度が下がらないことを確認してください。

4. IVCライゲーション

1. 正中開腹術
   1. 腹部の皮膚を剣状突起から膀胱まで細いハサミで切開します。非外傷性鉗子で皮膚切開の途中で腹膜をつまみます。切開部とその上にある腸の間に十分なスペースを確保してください(図2A)。
   2. 腹膜を無血管線に沿って縦方向に開きます。
2. 腸を右腹側に外装する
   1. 濡れた綿の先端で腸を引っ張ります。完全に湿らせた滅菌ガーゼで腸を覆います。覆われた腸が、腸間膜血管に過度の牽引をかけずに牽引のない方向にあることを確認してください。.
3. 左腎静脈とIVCの合流を含む、IVCと枝の完全な曝露(図2B)。
   1. 200〜300μLの生理食塩水を滴下します。尿管、IVC、大動脈、腎静脈の経過を調べます(図2)。
4. 腎下IVCと左腎静脈合流点の無血管面。
   1. ポリプロピレン6-0縫合糸を無血管面に2x-3x静かに通し、先端を閉じた非外傷性鉗子で尾側から頭蓋骨までの動きで通過させます。
   2. にじみが最小限に抑えられているのは、コットンチップタンポナーデで穏やかな圧力で制御してください。6-0ポリプロピレン縫合糸を尾側から頭蓋骨への穏やかな動きで通過させることにより、提供された平面を広げます。
5. 生殖腺枝と腰枝の焼灼(図2D)
   1. 最大4つの後枝または腰枝が存在する可能性があります。脊椎虚血と跛行の潜在的な合併症を避けるために、現在のプロトコルでは腰椎枝をそのままにしておきます。
   2. 両側子宮角動脈供給と下腹血管を含む2〜3本の側枝が存在することを確認します。最初の両側に存在するブランチの一貫した中断を確保します。左腎静脈とIVC(腎下IVC)の合流点のすぐ遠位の両側枝を焼灼します。子宮角の静脈排液血管が破壊されていないことを確認してください。.
      注:側枝焼灼は、この方法が滑らかで途切れることのない表面を提供し、制御不能な出血の可能性を減らすために選択されます。さらに、焼灼は、10-0縫合糸による縫合糸結紮よりも速く、より実現可能です。したがって、動物はより短く、より安全な手順にさらされます。
6. 尿管の経路と血管系を再確認して、にじみや不注意による焼灼がないことを確認します(図2C)。
7. 実験群における血管クリップを用いたIVCライゲーション
   1. 非外傷性鉗子による2-0ナイロン縫合糸の幅で血管クリップをカスタマイズします。実験群のカスタマイズされた血管クリップを、腎下IVCの周囲に円周状に適用します。
   2. 縫合糸の上に血管クリップを貼り付けます。一次縫合通路は、2〜3回の細心の注意を払った尾側から頭蓋への動きを伴う十分な無血管面を提供します(図2E-F)。
   3. さらに、準備した平面に血管クリップを通します。左腎静脈とIVCの合流点に平面を準備し、クリップがスムーズに通過できるように十分な幅にします(図2E)。
   4. カスタマイズされた血管クリップを、準備した平面を通して、IVCコースに対して垂直に水平に配置します。血管クリップを5-0ポリプロピレン縫合糸の上に置き、十分なスペースを確保します(図2G)。
   5. 血管クリップの部位での血管の損傷や出血を防ぐために、上記の手順が穏やかに実行されていることを確認してください。潜在的なにじみがないか手術野を観察します。にじみ出ている場合は、綿の先端で手術野に穏やかな圧力をかけます。
8. 対照群における縫合糸によるIVC結紮
   1. 6-0ポリプロピレン縫合糸による縫合糸結紮。5-0の絹糸の上に、準備された平面で腎下IVCの周りに外科用四角い結び目縫合糸を作ります。
   2. 縫合が完了したら、シルク縫合糸をそっと取り外して、十分な余剰スペースを確保します。
9. 生理食塩水200μLの皮下注射を行う。
   注:クランプ適用による部分IVC閉塞に匹敵する技術を提供するために、血管クリップは現在の研究でカスタマイズされ、唇の間にスペースを提供します。次に、血管クリップを左腎静脈とIVCの合流点にある準備された血管面に配置します。
10. 連続ランニング4-0ビクリル縫合糸で開腹術を閉じます。

5.インデックス手術後のフォローアップ

1. 手術後1時間、またはバランスと矯正能力が回復するまで、完全に回復するまで、隔離された清潔なケージで最初に来るものは何でも、動物を継続的に監視します。
2. 動物を毎日2日間監視します。動物が苦しんでいるように見える場合は、1日2回2日間監視します。プロトコルごとに術後の鎮痛剤と水分を投与します。
   1. 0.3 mg/mL の濃度のブプレノルフィンを 0.9% 塩化ナトリウム (NaCl) に溶解して、0.03 mg/mL の濃度にします。
   2. 0.05〜0.1 mg / kgの0.03 mg / mLブプレノルフィンを500 μLの滅菌0.9%NaClとともに皮下注射し、インデックス手術後の最初の48時間の間、8〜12時間ごとに注射します。.20 gのマウスでは、2 μgまたは66 μLの0.03 mg / mLのブプレノルフィンが必要です。.

6.安楽死と血栓を含むIVCの採取

1. イソフルランチャンバーでマウスを麻酔し、尾の付け根から動物を保持し、動物を手の背部表面に置いておきます。
2. 動物を3%〜4%のイソフルランで満たされた連続麻酔誘導チャンバーに移します。動物を仰臥位に置きます。
3. 説明されているように、剣状突起から膀胱までの長い正中開腹術を実行します。
4. 腸を腹部の右側に外在化し、腸骨分岐部から遠位のクランプされたIVCを腎下IVCの範囲まで採取します(図2G)。
5. 血栓と腫瘍の採取に続いて、子宮頸部脱臼のある動物を安楽死させます。

7. 統計解析

1. 統計分析は、平均、中央値、標準偏差 (SD) または平均の標準誤差 (SEM)、25 パーセンタイルまたは 75 パーセンタイル、または必要に応じて最小値と最大値を含む値の範囲全体として提示します。スチューデントのt検定とF検定を適宜実行します。p <0.05水準で統計的有意性を評価します。

結果

8〜12週齢の雌のC57Bl6/Jマウスのグループに、細胞増殖の対数相でMC-38細胞を注射した。異種移植片は、注射後3週間目から4週間目の間に急速に成長した¹⁸。腫瘍が平均体積400mm3に達すると、マウスを対照群および実験群に無作為に割り付けた。対照群は縫合糸によるIVC結紮を受け、実験マウスは血管クリップ適用によるIVC結紮を受けた。対照群と実験群の腫瘍体積は有...

ディスカッション

同系異種移植大腸癌モデルでは、対照群と比較して、実験群でより高い血栓原性および凝固マーカーの発現が観察されます。重要なことは、これらすべてのパラメータの分散が、対照群と比較して実験群の方が低かったことです。この変更には、IVCと左腎静脈の合流点に特定の圧力プロファイルを持つ血管クリップを導入することが含まれていました。クリップは、5-0ポリプロピレン縫合糸?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
Caliper	VWR International, Radnor, PA	12777-830
CD31	Abcam	Ab9498
Cell Counter	MOXIE	MXZ000
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose,	Accurate Surgical & Scientific Instruments	PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Fibrin	Millipore	MABS2155-100UG
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
MC-38 cell	Sigma Aldrich	SCC172
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Suture- Vicryl	AD-Surgical	#L-G330R24
Suture-Nylon 2-0	Ethilon	664H
Suture-Prolene 5-0	Ethicon	8661G
Suture-Prolene 6-0	Ethicon	PDP127
VEV03100	VisualSonics	FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix	The Well Bioscience	VHM01