癌のマウスモデルにおける静脈血栓症アッセイ

要約

本稿では、マウスがんモデルにおける静脈血栓症を評価するための最適化された方法を提示し、血管クリップを使用して静脈結紮を実現します。最適化により、血栓症関連の測定値のばらつきが最小限に抑えられ、ヒトのがん関連静脈血栓症との関連性が高まります。

要約

この方法論の論文は、静脈血栓症のげっ歯類モデルの外科的ニュアンス、特に癌関連血栓症(CAT)の文脈で強調しています。深部静脈血栓症は、がん生存者によくみられる合併症であり、致命的となる可能性がある。現在のマウス静脈血栓症モデルでは、通常、縫合糸を使用した下大静脈(IVC)の完全または部分的な機械的閉塞が含まれます。この手順は、血液および内皮損傷の全体的または部分的なうっ滞を誘発し、血栓形成を引き起こします。現在のモデルには、血栓重量の変動性が高い、死亡率が有意である、学習曲線が長いなどの制限があります。このレポートでは、これらの制限のいくつかに対処するために、血管クリップを使用した外科的改良を紹介します。同系結腸癌異種移植マウスモデルを用いて、カスタマイズされた血管クリップを用いて、腎下大静脈を結紮しました。これらのクリップは、IVC結紮後の5-0ポリプロピレン縫合糸と同様の唇の残存スペースを可能にします。縫合法を用いたマウスを対照とした。血管クリップ法は、縫合法よりも変動の少ない、一貫した再現性のある部分血管閉塞とより大きな血栓重量をもたらしました。より大きな血栓重量、より大きな血栓量、およびIVC管腔表面積への血栓は、6-0ポリプロピレン縫合糸と比較して血管クリップの圧力プロファイルが高いため、予想されました。このアプローチはグレースケール超音波検査によって検証され、縫合法と比較して、血管クリップを使用した腎下大静脈の血栓量が一貫して大きいことが示されました。これらの観察結果は、免疫蛍光染色でさらに実証されました。本研究は、マウスの静脈血栓症モデルを作製する方法を改良したもので、CATのメカニズムの理解を深めるとともに、創薬などのトランスレーショナルリサーチに活用することができます。

概要

がん関連静脈血栓塞栓症(VTE)
静脈血栓塞栓症(VTE)のリスクは、^{一般集団と比較して}、がん生存者では4〜7倍高い1,2,3。この状態は、がん患者の7人に1人で致命的であることが証明されています。VTEの発生率は、がんの種類や腫瘍量によって異なり、膵臓がんおよび胃がんの患者で最も高く^{なっています4。}

がん患者におけるがん関連VTEは予後的に重要である。これは、年齢、人種、および基礎となるがんの病期を調整した後でも^{、がん診断}後1年間の予後1年間の予後の全生存率の不良と関連している5。これらの知見は、がん関連VTEを調べることの重要性と、動物モデルを用いてそのメカニズムを調べる必要性を強調している。この領域のトランスレーショナルな関連性は、がん患者のVTEが血栓予防と抗血栓療法で予防および治療可能であるという事実によってさらに強調^{されています6。}

がんと静脈血栓症の動物モデル
がんモデルは従来、異種移植片と呼ばれ、マウ....

プロトコル

この研究では、16匹の雌のC57Bl6 / Jマウス、8〜12週齢、体重20〜25gを使用しました。マウスは標準的な条件下で飼育され、餌と水を 自由に与えられました。この研究は、ボストン大学のInstitutional Animal Care and Use Committee(IACUC)の承認を得て実施されました。ここで説明するオープン手順は、無菌状態で行われました。

1. 異種移植モデル

1. 細胞培養
   1. 異所性皮下移植の前に、MC-38細胞を単層として80%のコンフルエントまで増殖させます。
   2. トリプシン処理と10%FBS含有培地への再懸濁後、細胞を277 x g、4°Cで5分間遠心分離します。次に、細胞を無血清培地に再懸濁し、1 x 10⁴ MC-38細胞/μLの無血清培地に濃度を下げます。
      1. トリプシン処理では、MC-38細胞を所望の合流点(通常は約70%〜80%)に達するまで培養し、ペトリ皿から培地を吸引します。
      2. 1 mLのトリプシン-EDTA溶液を加え、細胞をトリプシンとともに37°Cで1分間インキュベートして剥離させます。ペトリ皿を軽くたたくか振って、均一に外れるようにします。
      3. 血清またはトリプシン阻害剤を含む培地を添加して活性を中和し、それ以上の細胞解離を防ぎま....

ディスカッション

同系異種移植大腸癌モデルでは、対照群と比較して、実験群でより高い血栓原性および凝固マーカーの発現が観察されます。重要なことは、これらすべてのパラメータの分散が、対照群と比較して実験群の方が低かったことです。この変更には、IVCと左腎静脈の合流点に特定の圧力プロファイルを持つ血管クリップを導入することが含まれていました。クリップは、5-0ポリプロピレン縫合糸?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
Caliper	VWR International, Radnor, PA	12777-830
CD31	Abcam	Ab9498
Cell Counter	MOXIE	MXZ000
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose,	Accurate Surgical & Scientific Instruments	PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Fibrin	Millipore	MABS2155-100UG
Fine Scissors - Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
MC-38 cell	Sigma Aldrich	SCC172
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Suture- Vicryl	AD-Surgical	#L-G330R24
Suture-Nylon 2-0	Ethilon	664H
Suture-Prolene 5-0	Ethicon	8661G
Suture-Prolene 6-0	Ethicon	PDP127
VEV03100	VisualSonics	FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix	The Well Bioscience	VHM01