Este método proporciona un protocolo accesible y flexible para la preparación de rejillas de microscopía electrónica (EM) para criotomografía celular in situ y microscopía óptica y electrónica correlativa (CLEM).
La criotomografía celular in situ es una técnica poderosa para estudiar objetos complejos en su contexto celular nativo congelado-hidratado, lo que la hace muy relevante para la biología celular y la virología. El potencial de combinar la criotomografía con otras modalidades de microscopía la convierte en una técnica perfecta para la obtención de imágenes integrativas y correlativas. Sin embargo, la preparación de la muestra para la tomografía celular in situ no es sencilla, ya que las células no se adhieren ni se estiran fácilmente sobre la rejilla de microscopía electrónica. Además, las propias rejillas son frágiles y pueden romperse si se manipulan con demasiada fuerza, lo que provoca la pérdida de áreas visibles. La geometría de las placas de cultivo de tejidos también puede suponer un reto a la hora de manipular las rejillas con pinzas. Aquí, describimos los consejos y trucos para superar estos (y otros) desafíos y preparar muestras de buena calidad para criotomografía celular in situ e imágenes correlativas de células de mamíferos adherentes. Con los continuos avances en la tecnología de criomicroscopía, esta técnica es muy prometedora para avanzar en nuestra comprensión de los sistemas biológicos complejos.
La criotomografía celular in situ es una técnica potente que permite el estudio de estructuras biológicamente relevantes en células sin fijación química. Al unir las células a las rejillas EM y congelar las rejillas en un criógeno, los objetos de interés se congelan en sus contextos celulares naturales sin la formación de hielo cristalino a partir del agua intracelular 1,2. Tanto la fijación química como la formación de hielo cristalino pueden alterar las estructuras de moléculas relevantes, como proteínas y lípidos, reduciendo la precisión biológica de las imágenes obtenidas con estas técnicas 3,4. En tomografía, las imágenes de cuadrículas se obtienen en ángulos incrementales mediante microscopía electrónica, y estas imágenes se utilizan para construir representaciones tridimensionales de la región objetivo de la que se obtiene la imagen5. La criotomografía in situ se puede utilizar junto con otras técnicas de microscopía para la obtención de imágenes integrativas y correlativas, como la obtención de imágenes de criofluorescencia, la tomografía de rayos X blandos y la crioFIB/SEM (microscopía electrónica criogénica de barrido por haz de iones focalizado)6,7,8,9,10,11 . La integración de múltiples técnicas permite obtener más información sobre una estructura o proceso de la que podría lograr una sola técnica de microscopía.
A pesar de todos los beneficios de la criotomografía celular in situ , la preparación de muestras puede resultar difícil por una variedad de razones. Debido a su fragilidad, la manipulación forzada de las rejillas de microscopía electrónica puede provocar daños, siendo la fina capa de carbono en particular delicada y propensa a romperse, lo que reduce el área de imagen de las rejillas. Las rejillas de microscopía electrónica también son difíciles de manipular debido a su pequeño tamaño y son propensas a desprenderse de la superficie de los pocillos o microportaobjetos utilizados para cultivar células. La manipulación de las rejillas dentro de los pozos o microportaobjetos puede resultar difícil debido a la geometría de estos. La preparación inadecuada de las rejillas (p. ej., dejarlas flotar) puede conducir a una baja densidad celular y reducir el número de áreas potenciales de imágenes, especialmente cuando las celdas no son propensas a adherirse a las rejillas mismas. Para la criotomografía celular directa, las células deben extenderse muy delgadamente, lo que puede interrumpirse por muchas razones, incluidas las temperaturas inadecuadas o el manejo brusco de las rejillas.
A través de una variedad de optimizaciones, las técnicas presentadas en este artículo están destinadas a manejar estos escollos más comunes que surgen durante la preparación de rejillas de microscopía electrónica para criotomografía. El uso de pinzas angulares de 5/15 permite la manipulación de rejillas dentro de placas de pocillos o microportaobjetos. Una solución de fibronectina aplicada a ambos lados de las rejillas antes del recubrimiento hace que las rejillas flotantes sean menos probables, lo que es beneficioso para garantizar que las rejillas tengan una densidad celular adecuada y que sea menos probable que las rejillas se dañen debido a la manipulación. Al mantener las rejillas incubadas a 37 °C hasta justo antes de la congelación por inmersión, también nos aseguramos de que las células se mantengan en un entorno cómodo para evitar que las células retraigan sus bordes delgados. Secar las rejillas de la parte posterior también evita que las células se dañen por la fuerza mecánica. En conjunto, estas medidas aumentan la tasa de éxito de la preparación de muestras para estudios de criotomografía celular in situ , lo que aumenta la accesibilidad de este enfoque de imagen.
1. Preparación de la cuadrícula
NOTA: En el diseño experimental, planifique un máximo de 8 a 12 rejillas en total por sesión de inmersión y congelación y de 4 a 5 rejillas por pozo. Más que eso conducirá a una sesión de congelación por inmersión muy larga, lo que puede causar un aumento del estrés celular, contaminación por hielo y errores del usuario.
2. Rejillas de siembra
3. Transfección
4. Congelación por inmersión
NOTA: Mantenga las células a 37 °C hasta que las necesite para el secado. Además, asegúrese de tomar nota del lado de carbono de las rejillas durante todo el proceso.
Después de la cotransfección de HIViGFPΔEnv y psPAX2, todas las rejillas tuvieron un desgarro mínimo en la capa de carbono. Las imágenes de las rejillas se obtuvieron mediante microscopía de luz de fase y microscopía de luz fluorescente 24 h después de la incubación con el reactivo de transfección (Figura 2). Las celdas tanto de las cuadrículas simuladas como de las cuadrículas cotransfectadas contenían celdas viables en varios cuadrados de cuadrícula.
psPAX2 codifica todas las proteínas estructurales y enzimáticas del VIH-1 sin ningún marcado de fluorescencia. HIViGFPΔEnv es similar a psPAX2 pero con códigos para una proteína Gag del VIH marcada con GFP. Ambos plásmidos son ΔEnvelope. La cotransfección da como resultado el ensamblaje nativo y la gemación de partículas fluorescentes del VIH-1, lo que lo convierte en un excelente sistema para los estudios CLEM del VIH en condiciones de nivel 1 de bioseguridad. Las rejillas co-transfectadas mostraron un subconjunto de células que exhibían fluorescencia verde, lo que indica una cotransfección exitosa. Ninguna célula de la rejilla simulada mostró fluorescencia, lo que validó aún más la cotransfección utilizando HIViGFPΔEnv y psPAX2. Después de ver las rejillas utilizando microscopía basada en la luz, las rejillas se congelaron por inmersión y se trasladaron a un almacenamiento a largo plazo en nitrógeno líquido.
La Figura 3 muestra los resultados de las cuadrículas producidas utilizando el mismo método experimental pero utilizando construcciones de plásmidos ligeramente diferentes. Las rejillas que contenían U2OS se transfectaron conjuntamente utilizando diferentes clones del VIH (HIVmCherryΔEnv y NL4-3ΔEnvGFP en una proporción de 1:6). Dado que se utilizó una mayor masa de plásmidos marcados con fluorescencia, estas rejillas permitieron la observación de un mayor número de células transfectadas, lo que proporcionó una ventaja al capturar imágenes utilizando cryoCLEM y cryoET. Utilizando cryoCLEM, se generaron atlas de cuadrícula completa para cada cuadrícula utilizando criofluorescencia para registrar las ubicaciones de todas las células cotransfectadas. Una vez conocida la ubicación de las células, se realizó la crioET. Se recolectó un atlas completo de cuadrícula de bajo aumento y se superpuso con el atlas fluorescente recolectado en criofluorescencia (Figura 3A). Se recolectaron criotomografías en sitios celulares que capturaron detalles intrincados del ciclo de vida viral, incluido el ensamblaje y la gemación del VIH a partir de las células (Figura 3B).
Figura 1: Flujo de trabajo de propagación de celdas en cuadrículas. Un esquema que representa el procedimiento general para sembrar células en rejillas crioEM. El proceso se divide en cuatro pasos principales, que incluyen (A) la preparación de rejillas en los pocillos para la siembra, (B) la adición de la cantidad adecuada de celdas a cada pocillo, (C) la transfección opcional de celdas para la obtención de imágenes fluorescentes y (D) la congelación por inmersión de las rejillas para permitir la vitrificación de la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cotransfección de U2OS usando HIViGFPΔEnv y psPAX2. Las células U2OS se transfectaron conjuntamente con HIViGFPΔEnv y psPAX2 que contenían GFP en una proporción de 1:3. Las imágenes de las rejillas se obtuvieron mediante contraste de fase y microscopía de fluorescencia. Las células que muestran tener expresión de GFP indican una cotransfección exitosa. Barra de escala: 500 μm. Barra de escala (recuadros): 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Posibles métodos basados en crioterapia aguas abajo . (A) Una imagen de crioCLEM con células U2OS co-transfectadas. Las células en verde representan las células productoras del VIH y se utilizan para medir el éxito de la cotransfección. Los puncta rojos representan mCherry etiquetado como mordaza HIV-1. Barra de escala: 250 μm. Barra de escala (recuadro): 25 μm (B) Una imagen crioET de múltiples partículas de VIH que brotan de la membrana plasmática de las células U2OS. Barra de escala: 50 nm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Aquí, hemos proporcionado un protocolo accesible, flexible y reproducible para células semilla en rejillas de microscopía electrónica para aplicaciones de tomografía crioelectrónica in situ . Este método se puede adaptar fácilmente para adaptarse a las necesidades de las aplicaciones posteriores y/o a los requisitos experimentales. Además de una gran flexibilidad, hemos descrito un flujo de trabajo que optimiza y reduce los errores comunes en la siembra de la cuadrícula, en particular el daño extenso a la capa de carbono, la baja densidad celular y la mala integridad estructural de las proyecciones de celdas delgadas.
Aunque el protocolo descrito aquí ofrece varias alternativas, hay algunos pasos críticos que deben seguirse para optimizar los resultados generales. Uno de los mayores problemas con la siembra de celdas de cuadrícula es el desprendimiento y la flotación de las rejillas del pozo o microportaobjetos. Por lo tanto, es importante humedecer completamente la rejilla con una solución adherente en ambos lados y evitar que se seque durante el período de incubación. Si utiliza soportes de rejilla impresos en 3D, tenga en cuenta que los múltiples cambios de medios en estos soportes tienen el potencial de producir rejillas flotantes, ya que el aire atrapado debajo de la rejilla puede forzarlo a salir del soporte.
Nuestra elección de pinzas también mejora la calidad de la rejilla en el sentido de proporcionar una forma geométricamente favorable de manipular las rejillas sin una flexión extensa de la rejilla que dañaría la capa de carbono. Mantener las células a 37 °C durante el mayor tiempo posible antes de sumergirlas reduce el sufrimiento celular y mejora el número de células delgadas que se pueden fotografiar en la cuadrícula. Finalmente, el secado del lado dorado protegerá las células de las fuerzas mecánicas agresivas que podrían provocar daños en las frágiles estructuras celulares.
Si bien no está incluido en este protocolo, se ha demostrado que el fotomicropatrón de cuadrícula aumenta el número de celdas de las que se pueden obtener imágenes al optimizar su unión al centro de los cuadrados de la cuadrícula14. Por último, los soportes de rejilla impresos en 3D se han utilizado recientemente para reducir el daño a la rejilla limitando la manipulación directa de la rejilla12.
Puede ser importante tener en cuenta que este protocolo está optimizado para obtener imágenes de bordes delgados y protuberancias de células para la aplicación de criotomografía. Sugerimos solucionar una variedad de condiciones de nuestras recomendaciones en el protocolo para encontrar el mejor resultado para las aplicaciones posteriores de elección. En general, este protocolo proporciona un método confiable pero versátil para sembrar celdas en cuadrículas que se pueden ajustar para necesidades específicas.
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Nos gustaría agradecer al laboratorio Mansky por el acceso a los equipos de congelación por inmersión. Parte de este trabajo se llevó a cabo en las instalaciones de caracterización de la Universidad de Minnesota, que recibe apoyo parcial de la National Science Foundation (NSF) a través del Centro de Investigación de Ciencia e Ingeniería de Materiales (MRSEC; Número de adjudicación DMR-2011401) y la Iniciativa Nacional de Currículo de Neurociencia (NNCI; Número de adjudicación ECCS-2025124). Nos gustaría agradecer el financiamiento del Centro de Comportamiento del VIH en Entornos Virales (B-HIVE; 1U54AI170855-01) y el Centro de Biología Estructural del VIH de Duke (DCHSB; U54AI170752) centro.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 nm colloidal gold bead solution | Sigma-Aldrich | 741957 | |
6 well multidish, 100/CS | Fisher Scientific | FB012927 | |
Allegra V-15R Benchtop Centrifuge, IVD 120 V 60 Hz | Beckman-Coulter | C63125 | |
Au G300F1 with R2/2 Quantifoil carbon | Quantifoil | TEM-G300F1-AU | |
Bovine serum albumin | MilliporeSigma | A9647 | |
BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer improved | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
DMi1 Inverted Microscope | Leica | 22A00G119 | |
Dulbecco's modified eagle's medium - high glucose, no glutamine | Gibco | 11-960-044 | |
Dumont 5/15 tweezer | Electron Microscopy Sciences | 0103-5/15-PO | |
EM GP2 | Leica | 587085 | Automated plunge freezer |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5209 | |
Fibronectin from bovine plasma, cell culture grade | MilliporeSigma | F1141 | |
GenJet version II in vitro DNA transfection reagent | SignaGen Laboratories | SL100489 | |
GlutaMAX I 100x | Fisher Scientific | 35050061 | Media supplement |
Neslab EX-211 Heating Circulator | Neslab | Out of production | Water bath for media warming |
Original Portable Pipet-Aid Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-100 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
Pelco easyGlow device | Pelco | 91000S | Glow discharge device |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Media supplement |
Pipetman P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector | Gilson | F144059M | |
Pipetman P2, 0.2–2 µL, Metal Ejector | Gilson | F144054M | |
Pipetman P20, 2–20 µL, Metal Ejector | Gilson | F144056M | |
Whatman number 2 filter paper, 55 mm | Whatman | 28455-041 | Blotting paper |
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