שיטה זו מספקת פרוטוקול נגיש וגמיש להכנת רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) עבור קריוטומוגרפיה תאית באתרה ומיקרוסקופ אור ואלקטרונים מתאמי (CLEM).
קריוטומוגרפיה תאית באתרה היא טכניקה רבת עוצמה לחקר עצמים מורכבים בהקשר התאי הקפוא הטבעי שלהם, מה שהופך אותה לרלוונטית מאוד לביולוגיה תאית ווירולוגיה. הפוטנציאל של שילוב קריוטומוגרפיה עם שיטות מיקרוסקופיה אחרות הופך אותה לטכניקה מושלמת לדימות אינטגרטיבי ומתאם. עם זאת, הכנת הדגימה לטומוגרפיה תאית באתרה אינה פשוטה, מכיוון שתאים אינם מתחברים ונמתחים בקלות על רשת מיקרוסקופ האלקטרונים. בנוסף, הרשתות עצמן שבריריות ועלולות להישבר אם מטפלים בהן בכוח רב מדי, מה שגורם לאובדן אזורים הניתנים לצילום. הגיאומטריה של צלחות תרבית רקמות יכולה גם להוות אתגר בעת מניפולציה של הרשתות עם פינצטה. כאן, אנו מתארים את הטיפים והטריקים להתגבר על אתגרים אלה (ואחרים) ולהכין דגימות באיכות טובה עבור קריוטומוגרפיה תאית באתרו והדמיה מתאמת של תאי יונקים דבקים. עם ההתקדמות המתמשכת בטכנולוגיית קריומיקרוסקופיה, טכניקה זו טומנת בחובה הבטחה עצומה לקידום הבנתנו של מערכות ביולוגיות מורכבות.
קריוטומוגרפיה תאית באתרה היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת לחקור מבנים רלוונטיים ביולוגית בתאים ללא קיבוע כימי. על ידי חיבור תאים לרשתות EM והקפאת הרשתות בקריוגן, אובייקטים מעניינים מוקפאים בהקשרים התאיים הטבעיים שלהם ללא היווצרות קרח גבישי ממים תוך-תאיים 1,2. הן קיבוע כימי והן היווצרות קרח גבישי יכולים לשבש את המבנים של מולקולות רלוונטיות, כגון חלבונים ושומנים, ולהפחית את הדיוק הביולוגי של תמונות המתקבלות באמצעות טכניקות אלה 3,4. בטומוגרפיה, רשתות מצולמות בזוויות מצטברות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, ותמונות אלה משמשות לבניית ייצוגים תלת-ממדיים של אזור המטרה המצולם5. ניתן להשתמש בקריוטומוגרפיה באתרו לצד טכניקות מיקרוסקופיה אחרות לדימות אינטגרטיבי ומתאם, כגון דימות קריופלואורסצנטי, טומוגרפיית רנטגן רכה ו- cryoFIB/SEM (מיקרוסקופ יונים ממוקד קריוגני/מיקרוסקופ אלקטרונים סורק)6,7,8,9,10,11 . שילוב של טכניקות מרובות מאפשר לקבל יותר מידע על מבנה או תהליך מאשר כל טכניקה מיקרוסקופית בודדת יכולה להשיג.
למרות כל היתרונות של קריוטומוגרפיה תאית באתרה , הכנת הדגימה יכולה להיות מאתגרת ממגוון סיבות. בשל שבריריותן, מניפולציה כוחנית של רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים עלולה להוביל לנזק, כאשר שכבת הפחמן הדקה בפרט עדינה ומועדת להיקרע, מה שמקטין את השטח הניתן לצילום של הרשתות. רשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים גם קשות למניפולציה בשל גודלן הקטן והן נוטות להתנתק מפני השטח של הבארות או המיקרו-שקופיות המשמשות לגידול תאים. מניפולציה של רשתות בתוך בארות או microslides יכול להיות קשה בשל הגיאומטריה של אלה. הכנה לא נכונה של הרשתות (למשל, לאפשר להן לצוף) עלולה להוביל לצפיפות תאים נמוכה ולהפחתת מספר אזורי הדימות הפוטנציאליים, במיוחד כאשר התאים אינם נוטים להיצמד לרשתות עצמן. עבור קריוטומוגרפיה תאית ישירה, התאים חייבים להתפשט דק מאוד, אשר יכול להיות משובש מסיבות רבות, כולל טמפרטורות לא תקינות או טיפול גס של הרשתות.
באמצעות מגוון אופטימיזציות, הטכניקות המוצגות במאמר זה נועדו להתמודד עם מלכודות נפוצות אלה המתעוררות במהלך הכנת רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים עבור קריוטומוגרפיה. השימוש בפינצטה זוויתית 5/15 מאפשר מניפולציה של רשתות בתוך לוחות באר או מיקרו-שקופיות. תמיסת פיברונקטין המיושמת על שני צידי הרשתות לפני הציפוי מפחיתה את הסבירות לרשתות צפות, מה שמועיל להבטיח שלרשתות יש צפיפות תאים נאותה ושהרשתות נוטות פחות להיפגע עקב מניפולציה. על ידי שמירה על הרשתות מודגרות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד רגע לפני הקפאה, אנו גם מבטיחים שהתאים נשמרים בסביבה נוחה כדי למנוע מהתאים לסגת מהקצוות הדקים שלהם. הכתמת הרשתות מהצד האחורי גם מונעת נזק לתאים מכוח מכני. בסך הכל, מדדים אלה מגבירים את שיעור ההצלחה של הכנת הדגימות למחקרי קריוטומוגרפיה תאית באתרם , ומגבירים את הנגישות של גישת הדמיה זו.
1. הכנת הרשת
הערה: בתכנון הניסוי, תכננו מקסימום של 8-12 רשתות בסך הכל לכל מפגש הקפאה של צלילה ו-4-5 רשתות לכל באר. יותר מזה יוביל לסשן ארוך מאוד של הקפאת צלילה, מה שעלול לגרום ללחץ מוגבר על התא, זיהום קרח וטעויות משתמש.
2. רשתות זריעה
3. טרנספקציה
4. לצלול הקפאה
הערה: שמור על התאים בטמפרטורה של 37°C עד שיידרש לצורך ניקוי. בנוסף, הקפידו לרשום את צד הפחמן של הרשתות לאורך כל התהליך.
בעקבות ההעברה המשותפת של HIViGFPΔEnv ו- psPAX2, בכל הרשתות הייתה קריעה מינימלית בשכבת הפחמן. רשתות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אור פאזה ומיקרוסקופ אור פלואורסצנטי 24 שעות לאחר הדגירה עם מגיב הטרנספקציה (איור 2). תאים הן ברשתות הדמה והן ברשתות המשולבות הכילו תאים בני קיימא בריבועי רשת מרובים.
קודי psPAX2 עבור כל החלבונים המבניים והאנזימטיים של HIV-1 ללא כל תיוג פלואורסצנטי. HIViGFPΔEnv דומה ל- psPAX2 אך עם קודים לחלבון HIV Gag המתויג GFP. שני הפלסמידים הם ΔEnvelope. הקוטרנספקציה גורמת להרכבה וניצנים דמויי ילידים של חלקיקי HIV-1 פלואורסצנטיים, מה שהופך אותה למערכת נהדרת למחקרי CLEM של HIV במצב בטיחות ביולוגית 1. הרשתות המזוהמות הראו תת-קבוצה של תאים המציגים פלואורסצנטיות ירוקה, מה שמצביע על קוטרנספקציה מוצלחת. אף תא ברשת המדומה לא הציג פלואורסצנטיות, מה שמאמת עוד יותר את הקוטרנספקציה באמצעות HIViGFPΔEnv ו-psPAX2. לאחר צפייה ברשתות באמצעות מיקרוסקופ מבוסס אור, הרשתות צללו קפואות והועברו לאחסון לטווח ארוך בחנקן נוזלי.
איור 3 מתאר תוצאות מרשתות שיוצרו באותה שיטת ניסוי אך משתמשות במבני פלסמיד שונים במקצת. רשתות המכילות U2OS הועברו במשותף באמצעות שיבוטים שונים של HIV (HIVmCherryΔEnv, ו- NL4-3ΔEnvGFP ביחס של 1:6). מכיוון שנעשה שימוש במסה גבוהה יותר של פלסמידים מתויגים פלואורסצנטית, רשתות אלה אפשרו תצפית על מספר גדול יותר של תאים נגועים, וסיפקו יתרון תוך לכידת תמונות באמצעות cryoCLEM ו- cryoET. באמצעות cryoCLEM, אטלסים של רשת מלאה נוצרו עבור כל רשת באמצעות מיקרוסקופ cryofluorescence כדי להקליט את המיקומים של כל התאים הנגועים במשותף. עם מיקומי התאים הידועים, בוצע cryoET. אטלס רשת מלא בהגדלה נמוכה נאסף ומכוסה באטלס הפלואורסצנטי שנאסף בהקפאה (איור 3A). קריוטומוגרפיות נאספו באתרים תאיים ולוכדות פרטים מורכבים של מחזור החיים הנגיפי, כולל הרכבה וניצנים של HIV מתאים (איור 3B).
איור 1: זרימת עבודה של זריעת תאים ברשתות. סכמטי המתאר את ההליך הכולל לזרע תאים על רשתות cryoEM. התהליך מחולק לארבעה שלבים עיקריים, כולל (A) הכנת רשתות בבארות לזריעה, (B) הוספת כמות התאים המתאימה לכל באר, (C) העברה אופציונלית של תאים לדימות פלואורסצנטי, ו-(D) הקפאת רשתות כדי לאפשר ויטריפיקציה של הדגימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: העברה משותפת של U2OS באמצעות HIViGFPΔEnv ו-psPAX2. תאי U2OS הודבקו יחד עם HIViGFPΔEnv ו-psPAX2 המכילים GFP ביחס של 1:3. הרשתות צולמו באמצעות ניגודיות פאזה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאים שהוכח שיש להם ביטוי GFP מצביעים על קוטרנספקציה מוצלחת. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. סרגל קנה מידה (קביעות): 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שיטות פוטנציאליות מבוססות הקפאה במורד הזרם . (A) תמונת cryoCLEM עם תאי U2OS שעברו טרנסדבקציה משותפת. תאים בירוק מייצגים תאים מייצרי HIV ומשמשים למדידת הצלחת קוטרנספקציה. פונקטה אדומה מייצגת mCherry מתויג HIV-1 Gag. סרגל קנה מידה: 250 מיקרומטר. סרגל קנה מידה (כניסה): 25 מיקרומטר (B) תמונת cryoET של חלקיקי HIV מרובים הניצנים מקרום הפלזמה של תאי U2OS. סרגל קנה מידה: 50 ננומטר לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
כאן, סיפקנו פרוטוקול נגיש, גמיש וניתן לשחזור לתאי זרע ברשתות מיקרוסקופ אלקטרונים עבור יישומי טומוגרפיה קריואלקטרונים באתרם . ניתן להתאים שיטה זו בקלות לצרכים של יישומים במורד הזרם ו / או דרישות ניסיוניות. בנוסף לגמישות רבה, תיארנו זרימת עבודה שממטבת ומפחיתה מלכודות נפוצות בזריעת רשת, בעיקר נזק נרחב לשכבת הפחמן, צפיפות תאים נמוכה ושלמות מבנית ירודה של הקרנות תאים דקים.
למרות שהפרוטוקול המתואר כאן מספק מספר חלופות, ישנם כמה צעדים קריטיים שיש לבצע כדי לייעל את התוצאות הכלליות. אחת הבעיות הגדולות ביותר עם זריעה של תאי רשת היא ניתוק וציפה של רשתות מהבאר או מהמיקרו-מגלשה. לכן, חשוב להרטיב את הרשת במלואה בתמיסה דבקה משני הצדדים ולמנוע ממנה להתייבש במהלך תקופת הדגירה. אם אתה משתמש במחזיקי רשת המודפסים בתלת-ממד, שים לב שלשינויים מרובים של מדיה במחזיקים אלה יש פוטנציאל ליצור רשתות צפות מכיוון שהאוויר הכלוא מתחת לרשת יכול לדחוק אותו החוצה מהמחזיק.
הבחירה שלנו בפינצטה גם משפרת את איכות הרשת בדרך של מתן דרך טובה מבחינה גיאומטרית לתפעל את הרשתות ללא כיפוף רשת נרחב שיפגע בשכבת הפחמן. שמירה על טמפרטורה של 37°C למשך זמן רב ככל האפשר לפני הצלילה מפחיתה את סבל התאים ומשפרת את מספר התאים הדקים הניתנים לצילום ברשת. לבסוף, כתם מצד הזהב יגן על התאים מפני כוחות מכניים קשים שעלולים להוביל לנזק למבנים תאיים שבירים.
למרות שלא נכלל בפרוטוקול זה, הוכח כי מיקרו-תבניות של צילומי רשת מגדילות את מספר התאים הניתנים לתמונה על-ידי מיטוב החיבור שלהם למרכז ריבועי הרשת14. לבסוף, לאחרונה נעשה שימוש במחזיקי רשת מודפסים בתלת-ממד כדי להפחית את הנזק לרשת על ידי הגבלת מניפולציה ישירה ברשת12.
חשוב לציין כי פרוטוקול זה מותאם להדמיית קצוות דקים ובלטות מתאים ליישום קריוטומוגרפיה. אנו מציעים פתרון בעיות במגוון מצבים מההמלצות שלנו בפרוטוקול כדי למצוא את התוצאה הטובה ביותר עבור היישומים במורד הזרם הנבחרים. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה אך רב-תכליתית של זריעת תאים על גבי רשתות שניתן לכוונן לצרכים ספציפיים.
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.
ברצוננו להודות למעבדת מנסקי על הגישה לציוד להקפאת צוללות. חלקים מעבודה זו בוצעו במתקן האפיון של אוניברסיטת מינסוטה, המקבל תמיכה חלקית מהקרן הלאומית למדע (NSF) באמצעות המרכז למדע והנדסה של מחקר חומרים (MRSEC; מספר הפרס DMR-2011401) והיוזמה הלאומית לתוכניות לימודים במדעי המוח (NNCI; מספר פרס ECCS-2025124) תוכניות. ברצוננו להודות למימון מהמרכז להתנהגות HIV בסביבות נגיפיות (B-HIVE; 1U54AI170855-01) וממרכז דיוק לביולוגיה מבנית של HIV (DCHSB; U54AI170752) מרכז.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 nm colloidal gold bead solution | Sigma-Aldrich | 741957 | |
6 well multidish, 100/CS | Fisher Scientific | FB012927 | |
Allegra V-15R Benchtop Centrifuge, IVD 120 V 60 Hz | Beckman-Coulter | C63125 | |
Au G300F1 with R2/2 Quantifoil carbon | Quantifoil | TEM-G300F1-AU | |
Bovine serum albumin | MilliporeSigma | A9647 | |
BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer improved | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
DMi1 Inverted Microscope | Leica | 22A00G119 | |
Dulbecco's modified eagle's medium - high glucose, no glutamine | Gibco | 11-960-044 | |
Dumont 5/15 tweezer | Electron Microscopy Sciences | 0103-5/15-PO | |
EM GP2 | Leica | 587085 | Automated plunge freezer |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5209 | |
Fibronectin from bovine plasma, cell culture grade | MilliporeSigma | F1141 | |
GenJet version II in vitro DNA transfection reagent | SignaGen Laboratories | SL100489 | |
GlutaMAX I 100x | Fisher Scientific | 35050061 | Media supplement |
Neslab EX-211 Heating Circulator | Neslab | Out of production | Water bath for media warming |
Original Portable Pipet-Aid Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-100 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
Pelco easyGlow device | Pelco | 91000S | Glow discharge device |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Media supplement |
Pipetman P1000, 100–1000 µL, Metal Ejector | Gilson | F144059M | |
Pipetman P2, 0.2–2 µL, Metal Ejector | Gilson | F144054M | |
Pipetman P20, 2–20 µL, Metal Ejector | Gilson | F144056M | |
Whatman number 2 filter paper, 55 mm | Whatman | 28455-041 | Blotting paper |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved