Generación de organoides renales en suspensión a partir de células madre pluripotentes inducidas

Resumen

Este protocolo presenta un método completo y eficiente para producir organoides renales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando condiciones de cultivo en suspensión. El énfasis principal de este estudio radica en la determinación de la densidad celular inicial y la concentración de agonistas WNT, lo que beneficia a los investigadores interesados en la investigación de organoides renales.

Resumen

Los organoides renales se pueden generar a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a través de varios enfoques. Estos organoides son muy prometedores para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las posibles aplicaciones terapéuticas. Este artículo presenta un procedimiento paso a paso para crear organoides renales a partir de iPSCs, comenzando desde la estría primitiva posterior (PS) hasta el mesodermo intermedio (IM). El enfoque se basa en el medio APEL 2, que es un medio definido y libre de componentes animales. Se complementa con una alta concentración de agonista WNT (CHIR99021) durante 4 días, seguido de factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF9)/heparina y una baja concentración de CHIR99021 durante 3 días adicionales. Durante este proceso, se hace hincapié en la selección de la densidad celular óptima y la concentración de CHIR99021 al inicio de las iPSC, ya que estos factores son críticos para la generación exitosa de organoides renales. Un aspecto importante de este protocolo es el cultivo en suspensión en una placa de baja adherencia, lo que permite que el IM se desarrolle gradualmente en estructuras nefronas, que abarcan estructuras tubulares glomerulares, tubulares proximales y tubulares distales, todas presentadas en un formato visualmente comprensible. En general, este protocolo detallado ofrece una técnica eficiente y específica para producir organoides renales a partir de diversas iPSC, lo que garantiza resultados exitosos y consistentes.

Introducción

El riñón desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis fisiológica, dependiendo de su unidad funcional. Las nefronas, que excretan productos de desecho, pueden regular la composición de los fluidos corporales. La enfermedad renal crónica (ERC), causada por mutaciones hereditarias u otros factores de alto riesgo, eventualmente progresará a enfermedad renal terminal (IRT)^1,2. Aparentemente, la IRT se debe a la limitada capacidad de regeneración de las nefronas. Por lo tanto, se requiere terapia de reemplazo renal. La diferenciación dirigida de las iPSC humanas permite la generación in ....

Protocolo

Las iPSCs utilizadas para el presente estudio se obtuvieron de una fuente comercial. Las células se mantuvieron con medio mTeSR en placas recubiertas de matriz de membrana basal disponibles comercialmente (ver Tabla de Materiales). La Tabla 1 contiene todas las composiciones de medios utilizadas en el estudio.

1. Siembra de iPSCs para la diferenciación e inducción de la raya primitiva posterior (PS)

1. Lave las iPSC en la placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana con 2 ml de DPBS. Aspire el DPBS con una pipeta.
2. Añadir 1 mL de la solución de desprendimiento de cél....

Discusión

Se ha descrito un protocolo detallado para la generación de organoides renales a partir de iPSCs, que implica modificaciones menores en el medio basal, la densidad celular inicial y la concentración de CHIR99021. En varios experimentos, se encontró que los factores críticos para la generación exitosa de organoides renales eran la diferenciación inicial del mesodermo intermedio (MI) y el estado celular en el día 7. Además, diferentes líneas de iPSC exhibieron variaciones en la proliferación celular y el potencia.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom	NEST	Cat #701003
Accutase	STEMCELL Technologies	Cat #o7920
Antibodies
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	Cat #100-51-6
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	Cat #120-51-4
Biological Safety Cabinet	Haier	Cat #HR40  A2
Biotin anti-human LTL (1:300)	Vector Laboratories	Cat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)	N/A	N/A
Carbon dioxide level shaker	HAMANY	Cat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)	STEMCELL Technologies	Cat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate	Corning	Cat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Corning	Cat #3471
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	Cat #07930
DAPI stain Solution	Coolaber	Cat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo SCIENTIFIC	Cat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-free	Servicebio	Cat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	Cat #ab150179
Donkey serum stoste	Meilunbio	Cat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)	Solarbio Life Science	Cat #D1040
Dry Bath Incubator	Shanghai Jingxin	Cat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Cat #370
Geltre LDEV-Free	Gibco	Cat #A1413202
Glass Bottom Culture Dishes	NEST	Cat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)	Santa Cruz Biotechnology	Cat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)	STEMCELL Technologies	Cat #07980
Human Recombinant FGF-9	STEMCELL Technologies	Cat #78161
Inverted Microscope	OLYMPUS	Cat #CKX53
Laser Scanning Confocal Microscope	OLYMPUS	Cat #FV3000
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	Cat #M7027
Micro Centrifuge	HENGNUO	Cat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)	BD Biosciences	Cat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)	BD Biosciences	Cat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)	Abcam	Cat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)	Thermo SCIENTIFIC	Cat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)	Sigma-Aldrich	Cat #81381
mTeSR1 5X Supplement	STEMCELL Technologies	Cat #85852
mTeSR1 Basal Medium	STEMCELL Technologies	Cat #85851
Nunc CryoTube Vials	Thermo SCIENTIFIC	Cat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)	Cell Signaling Technology	Cat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)	Sapphire Bioscience	Cat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)	Abcam	Cat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)	Abcam	Cat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)	Abcam	Cat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)	YEASEN	Cat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)	R&D Systems	Cat #AF4269
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	Cat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)	Gene Tex	Cat #GTX85902
Versene (1X)	Gibco	Cat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	Cat #72304