Generación de organoides renales en suspensión a partir de células madre pluripotentes inducidas

Resumen

Este protocolo presenta un método completo y eficiente para producir organoides renales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando condiciones de cultivo en suspensión. El énfasis principal de este estudio radica en la determinación de la densidad celular inicial y la concentración de agonistas WNT, lo que beneficia a los investigadores interesados en la investigación de organoides renales.

Resumen

Los organoides renales se pueden generar a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a través de varios enfoques. Estos organoides son muy prometedores para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las posibles aplicaciones terapéuticas. Este artículo presenta un procedimiento paso a paso para crear organoides renales a partir de iPSCs, comenzando desde la estría primitiva posterior (PS) hasta el mesodermo intermedio (IM). El enfoque se basa en el medio APEL 2, que es un medio definido y libre de componentes animales. Se complementa con una alta concentración de agonista WNT (CHIR99021) durante 4 días, seguido de factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF9)/heparina y una baja concentración de CHIR99021 durante 3 días adicionales. Durante este proceso, se hace hincapié en la selección de la densidad celular óptima y la concentración de CHIR99021 al inicio de las iPSC, ya que estos factores son críticos para la generación exitosa de organoides renales. Un aspecto importante de este protocolo es el cultivo en suspensión en una placa de baja adherencia, lo que permite que el IM se desarrolle gradualmente en estructuras nefronas, que abarcan estructuras tubulares glomerulares, tubulares proximales y tubulares distales, todas presentadas en un formato visualmente comprensible. En general, este protocolo detallado ofrece una técnica eficiente y específica para producir organoides renales a partir de diversas iPSC, lo que garantiza resultados exitosos y consistentes.

Introducción

El riñón desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis fisiológica, dependiendo de su unidad funcional. Las nefronas, que excretan productos de desecho, pueden regular la composición de los fluidos corporales. La enfermedad renal crónica (ERC), causada por mutaciones hereditarias u otros factores de alto riesgo, eventualmente progresará a enfermedad renal terminal (IRT)^1,2. Aparentemente, la IRT se debe a la limitada capacidad de regeneración de las nefronas. Por lo tanto, se requiere terapia de reemplazo renal. La diferenciación dirigida de las iPSC humanas permite la generación in vitro de organoides renales 3D específicos para cada paciente, que pueden utilizarse para estudiar el desarrollo renal, modelar enfermedades específicas del paciente y realizar el cribado de fármacos nefrotóxicos ^3,4.

Durante el desarrollo embrionario, los riñones se originan en el mesodermo intermedio (MI), que se diferencia de la estría primitiva (PS). La vía de señalización clásica WNT puede inducir una diferenciación adicional de la IM con la participación coordinada de FGF (FGF9, FGF20) y BMP (señalización Bmp7 a través de JNK)^5,6,7. Producen dos importantes poblaciones celulares de células progenitoras nefríticas (NPC): la yema ureteral (UB) y el mesénquima metanéfrico (MM), formando los conductos colectores y la nefrona, respectivamente ^8,9. Cada nefrona está formada por segmentos glomerulares y tubulares, como los túbulos proximal y distal, y el asa de Henle^10,11. De acuerdo con la teoría mencionada anteriormente, los protocolos actualmente publicados imitan las cascadas de señales y la estimulación del factor de crecimiento para inducir organoides renales ^5,12.

En los últimos años, se han desarrollado muchos protocolos para diferenciar las iPSC humanas en organoides renales 5,6,7,12. Takasato et ^al.7 optimizaron la duración del tratamiento con CHIR (agonista WNT) antes de la sustitución por FGF9. De acuerdo con su protocolo, la exposición a CHIR durante 4 días, seguida de FGF9 durante 3 días, es la forma más efectiva de inducir IM de iPSC. Se utilizaron filtros Transwell como formato de cultivo en su procedimiento; Sin embargo, este método es difícil para los principiantes. Por lo tanto, Kumar et ^al.13 intentaron cambiar el formato de la cultura y optaron por suspenderla. Disociaron las células adherentes en el día 7 para sembrarlas en placas de baja adherencia para ayudarlas a ensamblarse en cuerpos embrioides (EB) que contienen estructuras similares a nefronas. Sin embargo, el efecto por lotes de estos métodos fue evidente, especialmente en diferentes iPSC. Además, diferentes literaturas reportaron que la concentración de CHIR varió de 7 μM a 12 μM 5,13,14.

Especulamos que la concentración de densidad celular y el CHIR podrían afectar a la generación de organoides en diferentes iPSCs, y esto se ha comprobado en numerosas ocasiones en nuestros experimentos. El presente protocolo ha modificado ligeramente el método de estudio de Kumar et ^al.13 y ha proporcionado a los usuarios un procedimiento paso a paso. El cronograma y el esquema del enfoque se muestran en la Figura 1.

Protocolo

Las iPSCs utilizadas para el presente estudio se obtuvieron de una fuente comercial. Las células se mantuvieron con medio mTeSR en placas recubiertas de matriz de membrana basal disponibles comercialmente (ver Tabla de Materiales). La Tabla 1 contiene todas las composiciones de medios utilizadas en el estudio.

1. Siembra de iPSCs para la diferenciación e inducción de la raya primitiva posterior (PS)

1. Lave las iPSC en la placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana con 2 ml de DPBS. Aspire el DPBS con una pipeta.
2. Añadir 1 mL de la solución de desprendimiento de células disponible en el mercado (ver Tabla de Materiales) para separar las iPSC e incubar a 37 °C durante 5 min.
3. Agregue 1 ml de mTeSR a las iPSC y asegúrese de que las células se hayan levantado de la superficie plástica.
4. Centrifugar las celdas a 400 x g durante 3 min a temperatura ambiente (RT). Vuelva a suspender el gránulo de células y cuente el número de células con un hemocitómetro.
5. Siembre un rango de densidades celulares en una placa de 24 o 6 pocillos recubierta con matriz de membrana y cultive con mTeSR suplementado con 10 μM de inhibidor de Rho quinasa (Y-27632) (ver Tabla de materiales). Cultivarlos durante la noche en una incubadora de_CO2 a 37 °C.
   NOTA: Para inducir PS, la concentración óptima de CHIR99021 y las densidades celulares adecuadas varían de diferentes líneas de iPSC. Siembre un rango de densidades (por ejemplo, 0.6, 0.9, 1.2, 1.5, 1.8, 2.4 * 10³ células individuales por centímetro cuadrado) y un rango de concentración de CHIR99021 de 7 μM a 12 μM. Inicie la diferenciación de cada densidad y cada CHIR en el mismo día. Encuentre la concentración óptima de CHIR99021 y las densidades celulares adecuadas en una placa de 24 pocillos y luego amplíe el cultivo en placas de 6 pocillos. Aquí proporcionamos un protocolo basado en una placa de 6 pocillos.
6. Al día siguiente, aspire el mTeSR y lave las células con 2 ml de DPBS.
7. Añadir 2 ml de medio de estadio I (medio de diferenciación de células madre que contenga 8-12 μM CHIR99021) (Tabla 1), véase el día 0.
8. Cultivarlos en una incubadora a 37 °C durante 4 días, refrescar la etapa I media cada dos días.

2. Inducción del mesodermo intermedio nefrogénico (IM)

1. El día 4, retire el medio de la etapa I y lávese con 2 ml de DPBS.
2. Añadir 2 mL de medio en estadio II a las células (medio de diferenciación de células madre que contiene 200 ng/mL de FGF9, 1 μg/mL de heparina y 1 μM CHIR99021) (Tabla 1).
3. Cultivarlos en una incubadora a 37 °C y refrescar el medio cada 2 días hasta el día 7.

3. Generación de organoides renales en cultivo en suspensión

NOTA: Durante el período de observación del día 0 al día 7, el estado de las células es crítico. Si las células exhiben una expansión exitosa y se amontonan sin restos celulares significativos, demuestra la derivación exitosa del mesodermo intermedio (IM), lo que indica la preparación para pasar a la siguiente etapa. Sin embargo, si las células muestran signos de apoptosis inicial, seguida de necrosis o rotura, puede ser indicativo de concentraciones inadecuadas de CHIR99021 o densidades celulares.

1. El día 7, retire el medio en etapa II y lave las células con 2 ml de DPBS.
2. Añadir 1 mL de la solución de desprendimiento de células a cada pocillo e incubar a 37 °C durante 5 min hasta que las células sean refractivas bajo contraste de fase.
3. Pipetear 1 ml de medio de etapa II a las células, mezclar y asegurarse de que las células se hayan levantado de la superficie.
4. Recoja la suspensión celular en un tubo de 15 ml y centrifugue a 400 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
5. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 2 ml de medio estadio III (medio de diferenciación de células madre que contenga 200 ng/ml de FGF9, 1 μg/ml de heparina y 1 μM de CHIR99021 en metilcelulosa (MC) al 0,1 % y alcohol polivinílico (PVA) al 0,1 % suplementado con 10 μM de inhibidor de la Rho quinasa (Y-27632) (consulte la tabla de materiales). Mézclalo suavemente.
6. Mezcle la suspensión celular y la semilla en una placa de baja adherencia de 6 pocillos en una proporción de 1:3. Coloque la placa en un agitador orbital (resistente al CO 2, que gira a 60 rpm) en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂.
7. 24 h después, retirar el inhibidor de la Rho quinasa (Y-27632) y añadir medios de estadio III (suplemento de medio de diferenciación de células madre con 200 ng/ml de FGF9, 1 μg/ml de heparina, 1 μM de CHIR99021, 0,1 % de MC, 0,1 % de PVA). Cultivo durante 2 días. Cambie el medio en el cultivo de suspensión siguiendo los pasos que se indican a continuación:
   1. Cortar la punta de la pipeta de 1 ml con unas tijeras asépticas.
   2. Agite suavemente la placa de 6 pocillos para colocar los organoides en el medio de la placa.
   3. Aspirar los organoides con las pipetas preparadas en un tubo de 15 ml y dejarlos reposar durante 5 min.
   4. Aspire el sobrenadante y deje los organoides en el fondo del tubo.
   5. Agregue el medio fresco para volver a suspender los organoides y vuelva a colocar en una placa de baja adherencia de 6 pocillos.
8. Continúe agitando la placa de baja adherencia a 60 rpm en la incubadora. Cambie el medio de la etapa III cada dos días hasta el día 12.
9. El día 12, cambie el medio a medio de estadio IV (medio de diferenciación de células madre que contenga 0,1 % de MC y 0,1 % de PVA).
10. Cambie el medio cada dos días hasta el día 25. Los organoides pueden convertirse gradualmente en estructuras de nefronas maduras desde el día 12 hasta el 25.

4. Tinción por inmunofluorescencia de organoides renales

1. Recoja los organoides renales en un tubo de 15 ml y lávese con 2 ml de PBS.
2. Después de dejar reposar durante 5-10 minutos, fijar los organoides renales en PFA al 2% recién preparado durante 20 minutos a 4 °C.
3. Retire el PFA y lave los organoides con 1 ml de PBS que contenga 0,3% de Triton X-100 (0,3% PBST), agítelo uniformemente en una coctelera (con una velocidad de rotación no superior a 60 rpm) durante 8 minutos, déjelo reposar durante 5 minutos y luego retire el sobrenadante. Repita tres veces.
   NOTA: Los organoides se pueden almacenar en 0.3% PBST a 4° C durante 2-4 semanas.
4. Incubar los organoides fijados con suero de burro al 10% en PBST (tampón de bloqueo) (ver Tabla de Materiales) durante la noche a 4 °C.
5. Diluir los anticuerpos primarios (enumerados en la Tabla de Materiales) en un tampón de bloqueo con una proporción de 1:300.
6. Incubar los organoides con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C con agitación.
   NOTA: Asegúrese de que los glomérulos y los túbulos se puedan teñir simultáneamente en un organoide.
7. Lavar los organoides con 1 ml de PBST al 0,3%, agitarlo uniformemente en una coctelera (con una velocidad de rotación no superior a 60 rpm) durante 8 min, dejar reposar durante 5 min y luego retirar el sobrenadante. Repita tres veces.
8. Incubar los organoides con anticuerpos secundarios (enumerados en la Tabla de Materiales) y DAPI durante la noche a 4 °C con agitación. A continuación, repita el paso 4.7.
   NOTA: Tanto el anticuerpo secundario como el DAPI se diluyen en solución de bloqueo, anticuerpo secundario (1:400) y DAPI (1:1000).
9. Después de la tinción, deshidratar los organoides con metanol (25%, 50%, 75% y 100% durante 5 min cada uno), luego permear con alcohol bencílico y benzoato de bencilo (BABB, proporción 1:2) (ver Tabla de Materiales) durante 5 min.
10. Coloque los organoides aclarados en un plato con fondo de vidrio (consulte la Tabla de materiales) y examínelos mediante microscopía confocal.
    NOTA: Al tomar imágenes, elija la placa de Petri en la parte inferior de la placa de vidrio y, al permear, coloque el BABB directamente en la placa de Petri para mantener húmedo el fondo de la placa.

5. Ensayo de captación de dextrano in vitro

1. El día 25, incubar los organoides con 100 μg/mL de dextrano marcado con fluorescencia (ver Tabla de Materiales) durante 4 h en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂.
2. 4 horas más tarde, cambie a un medio fresco y capture imágenes de cultivos celulares vivos con un microscopio de fluorescencia de campo amplio.

Resultados

La producción de IM se logra mediante la activación de la señalización canónica de WNT utilizando el inhibidor de GSK3 CHIR99021, seguido de FGF9/heparina. Desde el día 0 hasta el día 4, las iPSC se expanden rápidamente y adquieren formas romboidales o triangulares. La confluencia alcanza el 90%-100% y se acumula uniformemente hasta el día 7. Tras el cultivo en suspensión, los agregados forman espontáneamente estructuras de nefronas después de disociarse en el día 7. Los organoides renales creados a través ...

Discusión

Se ha descrito un protocolo detallado para la generación de organoides renales a partir de iPSCs, que implica modificaciones menores en el medio basal, la densidad celular inicial y la concentración de CHIR99021. En varios experimentos, se encontró que los factores críticos para la generación exitosa de organoides renales eran la diferenciación inicial del mesodermo intermedio (MI) y el estado celular en el día 7. Además, diferentes líneas de iPSC exhibieron variaciones en la proliferación celular y el potencia...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom	NEST	Cat #701003
Accutase	STEMCELL Technologies	Cat #o7920
Antibodies
Benzyl alcohol	Sigma-Aldrich	Cat #100-51-6
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	Cat #120-51-4
Biological Safety Cabinet	Haier	Cat #HR40  A2
Biotin anti-human LTL (1:300)	Vector Laboratories	Cat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)	N/A	N/A
Carbon dioxide level shaker	HAMANY	Cat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)	STEMCELL Technologies	Cat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate	Corning	Cat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Corning	Cat #3471
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	Cat #07930
DAPI stain Solution	Coolaber	Cat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647	Thermo SCIENTIFIC	Cat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-free	Servicebio	Cat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	Cat #ab150179
Donkey serum stoste	Meilunbio	Cat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)	Solarbio Life Science	Cat #D1040
Dry Bath Incubator	Shanghai Jingxin	Cat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)	Earthox	Cat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Cat #370
Geltre LDEV-Free	Gibco	Cat #A1413202
Glass Bottom Culture Dishes	NEST	Cat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)	Santa Cruz Biotechnology	Cat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)	STEMCELL Technologies	Cat #07980
Human Recombinant FGF-9	STEMCELL Technologies	Cat #78161
Inverted Microscope	OLYMPUS	Cat #CKX53
Laser Scanning Confocal Microscope	OLYMPUS	Cat #FV3000
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	Cat #M7027
Micro Centrifuge	HENGNUO	Cat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)	BD Biosciences	Cat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)	BD Biosciences	Cat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)	Abcam	Cat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)	Thermo SCIENTIFIC	Cat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)	Sigma-Aldrich	Cat #81381
mTeSR1 5X Supplement	STEMCELL Technologies	Cat #85852
mTeSR1 Basal Medium	STEMCELL Technologies	Cat #85851
Nunc CryoTube Vials	Thermo SCIENTIFIC	Cat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)	Cell Signaling Technology	Cat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)	Sapphire Bioscience	Cat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)	Abcam	Cat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)	Abcam	Cat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)	Abcam	Cat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)	YEASEN	Cat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)	R&D Systems	Cat #AF4269
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	Cat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)	Gene Tex	Cat #GTX85902
Versene (1X)	Gibco	Cat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	Cat #72304