Intervención Tuina en Conejo Modelo de Artrosis de Rodilla

Resumen

El protocolo describe un método para la intervención de Tuina en un modelo de conejo de artrosis de rodilla.

Resumen

La osteoartritis de rodilla (KOA) se caracteriza principalmente por cambios degenerativos en el cartílago de la articulación de la rodilla y los tejidos blandos circundantes. Se ha confirmado la eficacia de Tuina en el tratamiento del KOA, pero es necesario investigar el mecanismo subyacente. Este estudio tiene como objetivo establecer un modelo de conejo KOA científicamente factible tratado con Tuina para revelar los mecanismos subyacentes. Para ello, 18 conejos machos neozelandeses de 6 meses de edad de grado normal se dividieron aleatoriamente en grupos simulados, modelo y Tuina, con 6 conejos en cada grupo. El modelo KOA se estableció inyectando una solución de papaína al 4% en la cavidad articular de la rodilla. El grupo de Tuina fue intervenido con Tuina combinado con el método de corrección rotatoria de la articulación de la rodilla durante 4 semanas. Solo se realizó el agarre y la fijación estándar en los grupos simulados y modelo. Al final de la intervención de 1 semana, se observó el rango de movimiento (ROM) de la articulación de la rodilla y se realizó una tinción de hematoxilina-eosina (HE) del cartílago. El estudio muestra que Tuina podría inhibir la apoptosis de los condrocitos, reparar el tejido cartilaginoso y restaurar el ROM de la articulación de la rodilla. En conclusión, este estudio demuestra la viabilidad científica del tratamiento con Tuina para conejos modelo KOA, destacando su potencial aplicación en el estudio de KOA y afecciones similares relacionadas con la articulación de la rodilla.

Introducción

La artrosis de rodilla (KOA) es una enfermedad degenerativa de la articulación de la rodilla, que se manifiesta principalmente por dolor de rodilla, hinchazón, deformación y restricción del movimiento, con una alta tasa de discapacidad y una mayor prevalencia en mujeres, con 527,81 millones de pacientes con artrosis en todo el mundo en 2019 y su prevalencia global representa el 60,6% de la prevalencia mundial total de OA¹. Clínicamente, el tratamiento del KOA suele dividirse en terapias quirúrgicas y no quirúrgicas. Las terapias no quirúrgicas incluyen fisioterapia, farmacoterapia y terapia de inyección de plasma rico en plaquetas ^2,3. Tuina es un método de tratamiento común, seguro, confiable y efectivo en la medicina china. Este estudio utiliza Tuina combinado con el método de corrección rotatoria de la articulación de la rodilla para tratar el KOA. Las técnicas de Tuina, como el método de amasamiento y prensado rotatorio, pueden equilibrar el tejido muscular, reducir el dolor, ajustar los niveles de factores inflamatorios, mejorar el metabolismo tisular e inhibir la degeneración del cartílago articular ^4,5. El método de corrección rotatoria de la articulación de la rodilla puede ajustar la alineación de los huesos y las articulaciones de las extremidades inferiores, mejorar el espacio de la articulación de la rodilla, restaurar la línea de fuerza normal y equilibrar la biomecánica de las extremidades inferiores 6,7,8,9. Los ejercicios de resistencia pueden mejorar la masa muscular y la fuerza y promover la renovación del tejido cartilaginoso^10,11. Un estudio preliminar encontró que este protocolo de Tuina es significativamente más efectivo que las cápsulas orales de sulfato de glucosamina en el tratamiento de KOA, con un inicio de acción más rápido y una inhibición significativa de la degeneración de los condrocitos y la reparación del tejido cartilaginoso dañado¹². En el tratamiento del KOA, en comparación con la terapia con Tuina, los antiinflamatorios no esteroideos tienen efectos adversos y eficacia insatisfactoria a largo plazo, riesgos y costos quirúrgicos relativamente altos, y requieren ciertas indicaciones para el tratamiento quirúrgico, con problemas postoperatorios y complicaciones periprotésicas^13,14,15. En comparación con la terapia farmacológica y la cirugía, el tratamiento con Tuina para el KOA ofrece varias ventajas, como la reducción de los efectos secundarios, el menor riesgo, la mejora de la seguridad, la rentabilidad y la eficacia más duradera. Además, puede aliviar eficazmente el dolor, la hinchazón, el chasquido y la restricción de movimiento^en la articulación de la rodilla 6,13,16,17.

Sin embargo, es necesario aclarar el mecanismo de Tuina para el tratamiento de la KOA, lo que limita la mejora y el perfeccionamiento del protocolo de tratamiento de la KOA. Por lo tanto, estudiar el mecanismo de intervención de Tuina en KOA a través de experimentos con animales es un método eficaz. Los conejos, en comparación con las ratas, tienen un temperamento dócil y articulaciones de rodilla más grandes. La estructura anatómica y los índices bioquímicos del cartílago son similares a los de los humanos, por lo que es un tema adecuado para estudiar el mecanismo de la enfermedad articular de la rodilla por Tuina¹⁸. El modelo KOA establecido mediante la inyección de papaína en la cavidad articular de la rodilla de conejos tiene las ventajas de un tiempo de modelado corto, un trauma reducido, una alta tasa de éxito, una alta tasa de supervivencia y un mecanismo patológico similar al KOA¹⁹. Este estudio tiene como objetivo establecer un protocolo experimental con animales científicamente factible para la intervención de Tuina en KOA e investigar el mecanismo de Tuina.

Protocolo

El estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shandong (número de aprobación: 2020-29).

1. Animales de experimentación

1. Cría 18 conejos neozelandeses machos de 6 meses de edad de grado normal (2,75 ± 0,25 kg) en jaulas individuales estándar (ciclo de luz/oscuridad de 12 h, temperatura 20-24 °C, humedad del aire 40%-60%).

2. Método de agrupación

1. Seleccione 6 de los 18 conejos de Nueva Zelanda como el grupo simulado utilizando el método de números aleatorios y asigne los 12 conejos restantes al grupo de modelado.
2. Después de modelar con éxito, divida los conejos del grupo de modelado en los grupos modelo y Tuina de acuerdo con el método de números aleatorios, con 6 conejos en cada grupo.
3. Realizar la intervención de Tuina en el grupo de Tuina. Realice el mismo agarre y fijación en el grupo simulado y modelo sin Tuina. Opere cada dos días durante 4 semanas (Figura 1).

3. Establecimiento del modelo KOA

1. Realice la alimentación adaptativa a los conejos en la condición estándar en la semana 1. Acceso ad libitum al agua y a los alimentos. Coloque a los conejos sobre su lado derecho en las cajas de fijación para conejos para calmarlos durante 15 minutos al día. Fije sus cabezas en las placas de fijación de cabezas. Fije las placas de sujeción y los tornillos para que los conejos no puedan moverse. Use guantes protectores cuando agarre y fije a los conejos (Figura 1).
2. En los días 1, 4 y 7 de la semana 2, coloque a los 18 conejos sobre su lado derecho en las cajas de fijación para conejos (Figura 1). Realice las operaciones que se mencionan a continuación.
3. Inyectar pentobarbital sódico al 3% (1 ml/kg) en la vena marginal del oído del conejo. Afeita la articulación de la rodilla izquierda del conejo con una afeitadora de animales, lo que hará que no haya vello en la piel expuesta.
4. Desinfecte la articulación de la rodilla izquierda del conejo de adentro hacia afuera usando yodóforo médico y alcohol al 75% (Figura 2A).
5. Flexiona la articulación de la rodilla izquierda del conejo a 60°. Inserte una aguja (22G, 0,7 mm x 30 mm) de Waixiyan. Inyectar solución de papaína al 4% (0,1 ml/kg, 0,275 ml de media para un animal de 2,5 kg) en la cavidad articular de la rodilla del grupo de modelado. Inyecte una cantidad igual de solución de cloruro de sodio al 0,9% en el grupo simulado. Esta dosis de inyección es bien tolerada por el animal sin causar evidencia de dolor o angustia (Figura 2B).
   NOTA: Waixiyan (EX-LE5) se encuentra en el receso lateral del ligamento rotuliano, y Neixiyan (EX-LE4) se encuentra en el receso medial del ligamento rotuliano^20,21,22.
6. Presione el orificio durante 2 minutos para evitar el derrame de la solución.
7. Coloca las manos por encima y por debajo de la articulación de la rodilla izquierda del conejo. Flexiona suave y pasivamente la articulación de la rodilla del conejo y extiéndela 10 veces dentro del rango de movimiento fisiológico (ROM) para infiltrar la solución en la cavidad de la articulación de la rodilla de manera uniforme¹⁵. Observe al conejo cada 8 h durante la duración del modelado. Administrar buprenorfina SR (0,18 mg/kg) cuando los conejos muestren signos de esconderse, temblor de las extremidades, respiración superficial y rápida, o incluso morder y arañar.
8. En la semana 7, observe la rodilla izquierda del conejo en una posición flexionada como hinchada, con un aumento del tono muscular alrededor de la rodilla con nódulos y estrías, un aumento de la respuesta de irritación dolorosa local, disminución del ROM de la rodilla, marcha coja y desplazamiento del centro de gravedad hacia el lado sano. Esto determina el éxito del modelo KOA (Figura 1, Figura 2C)^23,24.

4. Manipulación de Tuina

1. Realizar el entrenamiento utilizando el instrumento de determinación de parámetros de la técnica Tuina antes de la manipulación de Tuina. Entrena durante 1 h al día durante 1 mes por el mismo profesional.
   1. Realice el método de amasado y prensado rotatorio con el pulgar en la plataforma de simulación de manipulación Tuina con una fuerza de 5 N y una frecuencia de 60 veces/min (Figura 3A,C).
   2. Analice la fuerza en tres direcciones de los ejes X, Y y Z mediante el software de procesamiento de parámetros de manipulación Tuina y verifique la magnitud, la frecuencia y el tiempo de acción de la fuerza que se muestran en la pantalla (Figura 3B, D).
   3. Evalúe los parámetros mecánicos de la manipulación Tuina y estandarice la manipulación Tuina utilizando el software durante el entrenamiento. Mantenga el método estandarizado de amasado y prensado rotatorio con el pulgar con una fuerza de 5 N, una frecuencia de 60 veces/min y un tiempo de funcionamiento continuo de 10 min. Vea la forma de onda cuantitativa estandarizada de la manipulación en la Figura 3B, D ^25,26,27.
2. Coloque el conejo sobre su lado derecho en la caja de fijación para conejos. Acaricia suavemente al conejo durante 10 segundos para calmar y relajar al conejo²¹. A continuación, realiza la intervención de Tuina.
3. Realice el método de amasamiento rotatorio con el pulgar en la rigidez de los músculos perirodillales izquierdos del conejo, los nudos tendinosos y la rótula, con manipulación de ida y vuelta hacia arriba y hacia abajo con una fuerza de 5 N y una frecuencia de 60 veces/min durante 5 min.
4. Utilice el extremo del pulgar para presionar Yanglingquan (GB 34), Yinlingquan (SP 9), Waixiyan (EX-LE5), Neixiyan (EX-LE4), Heding (EX-LE2), Xuehai (SP 10), Liangqiu (ST 34) y Weizhong (BL 40)20,21,22^, con una fuerza de 5 N y una frecuencia de 60 veces/min^, y opere en cada punto durante ³⁰ s.
5. Realice el método de corrección rotatoria en la articulación de la rodilla del conejo y realice esto 3 veces por separado para cada animal del grupo.
   1. Fija el fémur con una mano. Coloque primero la otra mano detrás de la articulación de la rodilla, luego fije los cóndilos tibiales lateral y medial con los dedos pulgar y anular, respectivamente. Fija la fosa poplítea con los dedos índice y medio. Aplique fuerza de tracción y torsión.
   2. Fija el fémur con una mano. Fija los bordes medial y lateral de la rótula con los dedos pulgar y meñique de la otra mano. Fije la base rotuliana con los dedos índice, medio y anular. Aplique fuerza de torsión.
   3. Mantenga la dirección de la fuerza de tracción paralela al eje largo de la tibia y la dirección de la fuerza de torsión alineada con la dirección del Xiyan inferior. Use los dedos para mantener la piel en su lugar para evitar la fricción entre la piel y los dedos.

5. Medición del ROM de la articulación de la rodilla

NOTA: Antes de medir, calma al conejo. El estadístico de medición y el operador son diferentes entre sí.

1. Mide la movilidad de la articulación de la rodilla izquierda de los conejos de cada grupo al inicio del experimento y al final de cada semana.
2. Coloque al conejo sobre su lado derecho en la caja de fijación para conejos y fije su fémur izquierdo con una mano.
3. Alinea el centro del círculo del artroscopio médico con el centro lateral de la articulación de la rodilla izquierda del conejo. Extienda el brazo de fijación de manera que quede paralelo a la extensión de la línea que conecta el centro del círculo con el trocánter mayor. Extienda el brazo móvil de manera que quede paralelo al eje longitudinal de la tibia.
4. Coloca la otra mano en el eje longitudinal de la tibia, aproximadamente a 9 cm de la articulación de la rodilla. Aplique manualmente aproximadamente 750-850 g de par a una velocidad angular de 3°/s²⁸.
5. Realice esto hasta que la articulación de la rodilla del conejo ya no se mueva. Registre el número de grados que muestra el goniómetro cuando la articulación deja de moverse; este es el ROM de la articulación de la rodilla. Al leer, asegúrese de que la línea de visión sea perpendicular a la superficie de la regla.
6. Mida el ROM de cada rodilla 3x y tome el valor promedio^{de 28}.

6. Tinción con hematoxilina-eosina (HE)

1. Recogida de muestras
   1. A 1 semana del final de la intervención (Figura 1), coloque al conejo sobre su lado derecho en la caja de fijación para conejos (es más probable que los conejos permanezcan relajados cuando están acostados sobre su lado derecho). Inyectar pentobarbitona (100 mg/kg) en la vena marginal del oído del conejo para la eutanasia humanitaria^29,30.
   2. Abra rápidamente la cavidad de la rodilla izquierda con un bisturí, unas tijeras y unas pinzas hemostáticas para extraer el tejido blando adherido alrededor del cartílago del fémur distal.
   3. Recoja una muestra de cartílago-hueso de aproximadamente 1 cm x 1 cm del fémur distal con pinzas de mordida y colóquela en solución salina para su limpieza.
2. Fijación y descalcificación
   1. Colocar el cartílago en una solución de paraformaldehído al 4% y fijarlo durante 72 h.
   2. Enjuagar con agua corriente durante 12 h. Descalcificar en solución de descalcificación de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) durante 6 semanas. Cambie la solución de descalcificación de EDTA cada 3 días. Determine el punto final de la descalcificación cuando el tejido óseo se vuelve blando y flexible, se puede doblar fácilmente y perforar suavemente con una aguja³¹.
3. Deshidratación de secciones incrustadas
   1. Coloque la muestra en un deshidratador automático para su deshidratación.
   2. Coloque el pañuelo encerado y recortado en el fondo de un recipiente cuadrado con cera de parafina disuelta durante 1 h. Colóquelos en un horno de enfriamiento hasta que se enfríen y se solidifiquen en bloques duros. Cortar el bloque de tejido incluido en parafina en una cortadora hasta que tenga un grosor de 4 μm.
   3. Despliega las secciones en la máquina de blanqueo, luego colócalas en portaobjetos adhesivos, numéralas y sécalas con una máquina para hornear rodajas y un horno.
4. Desparafinado e hidratación
   1. Hornea las secciones a 65 °C durante 60 min.
   2. Remoje las secciones en xileno durante 7 minutos, seguidas de 2 rondas más de remojo en xileno fresco durante 7 minutos cada una.
   3. Remoje la rebanada en etanol anhidro durante 5 minutos, seguido de remojo durante 2 minutos cada uno en etanol al 95%, etanol al 85% y etanol al 75%.
   4. Remoja las secciones en agua destilada durante 2 min.
5. Tinción con hematoxilina: Tinción de secciones con hematoxilina durante 20 s. Enjuague las secciones con agua corriente. Remojar las secciones en fraccionamiento de etanol con ácido clorhídrico durante 3 s. Enjuague las secciones con agua del grifo durante 5 minutos.
6. Retinción con eosina: Tinte secciones con eosina durante 30 s. Enjuague las secciones con agua del grifo.
7. Deshidratación para transparencia de la muestra
   1. Coloque las secciones en etanol al 95% dos veces durante 3 s cada una, luego colóquelas en etanol anhidro durante 3 s.
   2. Nuevamente, coloque las rodajas en etanol anhidro durante 1 minuto, seguido de 2 rondas de lavado con xileno durante 1 minuto cada una.
8. Sellado de rodajas: Saque las rodajas, coloque un sellador de goma neutro, cúbralas con un cubreobjetos y deje que las rodajas se sequen en una campana extractora hasta que no tengan olor.
9. Fotografiar la muestra: Observar y fotografiar bajo el campo de visión de un microscopio óptico a 100x.
10. Evaluación: Evaluar el tejido cartilaginoso por la puntuación de Mankin para cada grupo³².

7. Análisis de datos

1. Analizar estadísticamente los datos experimentales utilizando software de análisis. Cuando los datos se sometieron a una distribución normal, se compararon dos grupos de muestras mediante la prueba t y varios grupos mediante ANOVA de un factor.
2. Exprese los resultados como media ± desviación estándar (DE). Representar los resultados como gráficos estadísticos utilizando software comercial. Las diferencias fueron estadísticamente significativas a p < 0,05.

Resultados

El grado de movimiento restringido de la rodilla y el daño en el tejido cartilaginoso reflejan la gravedad del KOA. El ROM de la articulación de la rodilla refleja el grado de restricción del movimiento de la articulación de la rodilla. Cuanto más pequeño sea el ROM de la articulación de la rodilla, más grave será la limitación del movimiento de la articulación de la rodilla. Por el contrario, cuanto mayor sea el ROM de la articulación de la rodilla, más normal será el grado de movimiento de la rodilla. La ...

Discusión

El diseño del protocolo experimental es particularmente importante para investigar el mecanismo de Tuina en el tratamiento de KOA. El modelado de KOA se realizó en conejos mediante inyección de papaína en Waixiyan. Waixiyan se encuentra en la cripta lateral del ligamento rotuliano, que es fácil de localizar, y el espacio articular entre el fémur y la tibia es grande aquí durante la flexión de la rodilla, lo que facilita la inyección en la cavidad de la articulación de la rodilla y evita daños en los tejidos ci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 % sodium chloride injection	Sichuan Keren Pharmaceutical Co.	Z22121903
-20°C refrigerator	Haier	BD-328WL
4 % fixative solution	Solarbio	P1110
4°C refrigerator	Haier	SC-315DS
Anhydrous ethanol	Sinopharm
Automatic tissue dewatering machine	Dakowei (Shenzhen) Medical Equipment Co.	HP30
Blast drying oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co.	DHG-9070A
Coverslip	Biyuntian	FCGF50
Electric thermostat water bath	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co.	HWS-26
Embedding freezing table	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	BM450
Embedding machine	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	BM450A
Ethylenediaminetetraacetic acid decalcification solution	Servicebio	G1105-500ML
Fluorescent inverted microscope	Leica	Leica DM IL LED
Hematoxylin-eosin staining kit	Cisco Jet	EE0012
Hydrochloric acid	Laiyang Economic and Technological Development Zone Fine Chemical Plant
Medical joint goniometer	KOSLO
Neutral gum	Cisco Jet	EE0013
Normal-grade male New Zealand rabbit	Jinan Xilingjiao Breeding and Breeding Center	SCXK (Lu) 2020 0004
Papain(3000 U/mg)	Bioss	D10366
Pathological tissue bleaching and drying instrument	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	PH60
Pet electric clippers	Codos	CP-3180
Rabbit fixing box	any brand
Rotating Slicer	Leica	531CM-Y43
Tuina technique parameter determination instrument	Shanghai DuKang Instrument Equipment Co. Ltd.	ZTC-
Ventilator	TALY ELECTRIC	C32
Xylene	Fuyu Reagent