Intervenção Tuina em Modelo de Osteoartrite de Joelho em Coelhos

Resumo

O protocolo descreve um método para intervenção de Tuina em um modelo de coelho de osteoartrite de joelho.

Resumo

A osteoartrite do joelho (KOA) é caracterizada principalmente por alterações degenerativas na cartilagem da articulação do joelho e nos tecidos moles circundantes. A eficácia de Tuina no tratamento de OA foi confirmada, mas o mecanismo subjacente precisa ser investigado. Este estudo visa estabelecer um modelo cientificamente viável de coelhos KOA tratados com Tuina para revelar os mecanismos subjacentes. Para isso, coelhos da raça Nova Zelândia, machos de grau normal, com 18 meses de idade, com 6 meses de idade, foram divididos aleatoriamente em grupos sham, modelo e Tuina, com 6 coelhos em cada grupo. O modelo de OA foi estabelecido injetando-se solução de papaína a 4% na cavidade articular do joelho. O grupo Tuina foi intervencionado com Tuina combinado com o método de correção rotatória da articulação do joelho por 4 semanas. Apenas a preensão e fixação padrão foram realizadas nos grupos sham e modelo. Ao final de 1 semana de intervenção, observou-se a amplitude de movimento (ADM) articular do joelho e a coloração pela hematoxilina-eosina da cartilagem (HE). O estudo mostra que Tuina pode inibir a apoptose dos condrócitos, reparar o tecido cartilaginoso e restaurar a ADM articular do joelho. Em conclusão, este estudo demonstra a viabilidade científica do tratamento com Tuina para coelhos modelo de OA, destacando sua potencial aplicação no estudo de OA e condições semelhantes relacionadas à articulação do joelho.

Introdução

A osteoartrite do joelho (OA) é uma doença degenerativa da articulação do joelho, manifestada principalmente por dor, inchaço, deformação e restrição de movimento no joelho, com alta taxa de incapacidade e maior prevalência em mulheres, com 527,81 milhões de pacientes com osteoartrite em todo o mundo em 2019 e sua prevalência global representando 60,6% da prevalência global total de OA¹. Clinicamente, o tratamento da OA é usualmente dividido em terapias não cirúrgicas e cirúrgicas. As terapias não cirúrgicas incluem fisioterapia, farmacoterapia e injeção de plasma rico em plaquetas ^2,3. Tuina é um método de tratamento comum, seguro, confiável e eficaz na medicina chinesa. Este estudo utiliza Tuina combinado com o método de correção rotatória da articulação do joelho para o tratamento de OA de joelho. Técnicas de Tuina, como o amassamento rotatório e o método de prensagem, podem equilibrar o tecido muscular, reduzir a dor, ajustar os níveis de fatores inflamatórios, melhorar o metabolismo tecidual e inibir a degeneração da cartilagem articular ^4,5. O método de correção rotatória da articulação do joelho pode ajustar o alinhamento dos ossos e articulações dos membros inferiores, melhorar o gap articular do joelho, restaurar a linha de força normal e equilibrar a biomecânica do membro inferior 6,7,8,9. O exercício resistido pode aumentar a massa e a força muscular e promover a renovação do tecido cartilaginoso10,11. Um estudo preliminar constatou que este protocolo de Tuina é significativamente mais eficaz do que as cápsulas orais de sulfato de glucosamina no tratamento da OA, com início de ação mais rápido e inibição significativa da degeneração dos condrócitos e reparo do tecido cartilaginoso lesado¹². No tratamento da OA de joelho, comparado à terapia de Tuina, os anti-inflamatórios não hormonais apresentam efeitos adversos e eficácia insatisfatória a longo prazo, riscos e custos cirúrgicos relativamente altos e requerem certas indicações para o tratamento cirúrgico, com problemas pós-operatórios e complicações periprotéticas^13,14,15. Quando comparado à terapia medicamentosa e à cirurgia, o tratamento com Tuina para OA de OA oferece várias vantagens, incluindo efeitos colaterais reduzidos, menor risco, maior segurança, custo-efetividade e eficácia mais duradoura. Além disso, pode efetivamente aliviar a dor articular do joelho, o inchaço, o estalo e a restrição de movimento 6,13,16,17.

No entanto, o mecanismo de Tuina para o tratamento de OA precisa ser esclarecido, o que limita a melhora e a perfeição do protocolo de tratamento para OA. Portanto, estudar o mecanismo de intervenção de Tuina em OA através de experimentos com animais é um método eficaz. Os coelhos, em comparação com os ratos, têm um temperamento dócil e articulações do joelho maiores. A estrutura anatômica e os índices bioquímicos da cartilagem são semelhantes aos dos seres humanos, sendo um tema adequado para o estudo do mecanismo de doença articular do joelho por Tuina¹⁸. O modelo de OA estabelecido pela injeção de papaína na cavidade articular do joelho de coelhos tem as vantagens de curto tempo de modelagem, trauma reduzido, alta taxa de sucesso, alta taxa de sobrevida e mecanismo patológico semelhante ao OA¹⁹. Este estudo tem como objetivo estabelecer um protocolo experimental animal cientificamente viável para a intervenção de Tuina em OA e investigar o mecanismo de Tuina.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Shandong (número de aprovação: 2020-29).

1. Animais de experimentação

1. Criar coelhos da Nova Zelândia machos de grau normal de 18 e 6 meses de idade (2,75 ± 0,25 kg) em gaiolas simples padrão (ciclo claro/escuro de 12 h, temperatura 20-24 °C, umidade do ar 40%-60%).

2. Método de agrupamento

1. Selecione 6 dos 18 coelhos da Nova Zelândia como grupo simulado usando o método de números aleatórios e atribua os 12 coelhos restantes ao grupo de modelagem.
2. Após a modelagem bem-sucedida, dividimos os coelhos do grupo modelagem em modelos e Tuina de acordo com o método dos números aleatórios, com 6 coelhos em cada grupo.
3. Realizar a intervenção Tuina no grupo Tuina. Realize a mesma preensão e fixação no grupo sham e modelo sem Tuina. Operar em dias alternados por 4 semanas (Figura 1).

3. Estabelecimento do modelo KOA

1. Realizar alimentação adaptativa para coelhos na condição padrão na semana 1. Acesso ad libitum à água e aos alimentos. Coloque os coelhos do lado direito nas caixas de fixação dos coelhos para acalmá-los por 15 minutos por dia. Fixe suas cabeças nas placas de fixação da cabeça. Fixe as placas e parafusos de fixação para que os coelhos não possam se mover. Usar luvas de proteção ao agarrar e fixar os coelhos (Figura 1).
2. Nos dias 1, 4 e 7 da semana 2, colocar todos os 18 coelhos do lado direito nas caixas de fixação dos coelhos (Figura 1). Execute as operações abaixo mencionadas.
3. Injetar pentobarbital sódico a 3% (1 ml/kg) na veia marginal da orelha do coelho. Faça a barba da articulação do joelho esquerdo do coelho com um barbeador de animais, resultando em nenhum pelo na pele exposta.
4. Desinfetar a articulação do joelho esquerdo do coelho de dentro para fora com iodóforo médico e álcool a 75% (Figura 2A).
5. Flexionar a articulação do joelho esquerdo do coelho a 60°. Insira uma agulha (22G, 0,7 mm x 30 mm) da Waixiyan. Injetar solução de papaína a 4% (0,1 mL/kg, 0,275 mL em média para um animal de 2,5 kg) na cavidade articular do joelho do grupo modelador. Injetar uma quantidade igual de solução de cloreto de sódio a 0,9% no grupo simulado. Essa dose de injeção é bem tolerada pelo animal, sem causar evidência de dor ou angústia (Figura 2B).
   NOTA: Waixiyan (EX-LE5) está localizado no recesso lateral do ligamento patelar e Neixiyan (EX-LE4) está localizado no recesso medial do ligamento patelar^20,21,22.
6. Pressione o orifício por 2 min para evitar o derramamento da solução.
7. Coloque as mãos acima e abaixo da articulação do joelho esquerdo do coelho. Flexionar suave e passivamente a articulação do joelho do coelho e estender 10 vezes dentro da amplitude de movimento (ADM) fisiológica para infiltrar-se uniformemente na cavidade articular do joelho¹⁵. Observe o coelho a cada 8 h durante a modelagem. Administrar buprenorfina SR (0,18 mg/kg) quando os coelhos apresentarem sinais de ocultação, tremor de membros, respiração superficial e rápida, ou mesmo morder e coçar.
8. Na 7ª semana, observar o joelho esquerdo do coelho em posição de flexão edemaciado, com aumento do tônus muscular ao redor do joelho com nódulos e estrias, aumento da resposta dolorosa local à irritação, diminuição da ADM do joelho, marcha coxa e desvio do centro de gravidade para o lado saudável. Isso determina o sucesso do modelo de OA (Figura 1, Figura 2C)^23,24.

4. Manipulação de Tuina

1. Realizar treinamento utilizando o instrumento de determinação de parâmetros da técnica de Tuina antes da manipulação de Tuina. Treine por 1 h por dia durante 1 mês pelo mesmo profissional.
   1. Realizar o método de amassamento e prensagem rotatória com o polegar sobre a plataforma de simulação de manipulação de Tuina com força de 5 N e frequência de 60 vezes/min (Figura 3A,C).
   2. Analise a força em três direções dos eixos X, Y e Z pelo software de processamento de parâmetros de manipulação Tuina e verifique a magnitude, frequência e tempo de ação da força exibidos na tela (Figura 3B, D).
   3. Avaliar os parâmetros mecânicos da manipulação de Tuina e padronizar a manipulação de Tuina utilizando o software durante o treinamento. Manter o método de amassamento e prensagem rotatório padronizado com o polegar com uma força de 5 N, uma frequência de 60 vezes/min e um tempo de operação contínua de 10 min. Veja a forma de onda quantitativa padronizada da manipulação na Figura 3B,D ^25,26,27.
2. Coloque o coelho do lado direito na caixa de fixação do coelho. Acaricie suavemente o coelho por 10s para acalmar e relaxar o coelho²¹. Em seguida, realize a intervenção Tuina.
3. Realizar o amassamento rotatório com o polegar sobre a rigidez dos músculos peri-joelho esquerdo do coelho, nós tendinosos e patela, com manipulação para cima e para baixo em ida e volta com uma força de 5 N e uma frequência de 60 vezes/min por 5 min.
4. Use a extremidade do polegar para pressionar Yanglingquan (GB 34), Yinlingquan (SP 9), Waixiyan (EX-LE5), Neixiyan (EX-LE4), Heding (EX-LE2), Xuehai (SP 10), Liangqiu (ST 34) e Weizhong (BL 40)20,21,22, com uma força de 5 N e uma frequência de 60 vezes/min^, e opere em cada ponto por ³⁰ s.
5. Realizar o método de correção rotatória na articulação do joelho do coelho e realizar este 3x separadamente para cada animal do grupo.
   1. Fixe o fêmur com uma mão. Coloque a outra mão atrás da articulação do joelho primeiro, depois fixe os côndilos tibiais lateral e medial com os dedos polegar e anular, respectivamente. Fixar a fossa poplítea com os dedos indicador e médio. Aplique tração e força de torção.
   2. Fixe o fêmur com uma mão. Fixe as bordas medial e lateral da patela com os dedos polegar e mínimo da outra mão. Fixe a base patelar com os dedos indicador, médio e anelar. Aplique força de torção.
   3. Mantenha a direção da força de tração paralela ao longo eixo da tíbia, e a direção da força de torção em linha com a direção do Xiyan inferior. Use os dedos para manter a pele no lugar para evitar o atrito entre a pele e os dedos.

5. Mensuração da ADM articular do joelho

OBS: Antes da medição, acalme o coelho. O estatístico de medição e o operador são diferentes um do outro.

1. Medir a mobilidade da articulação do joelho esquerdo dos coelhos de cada grupo no início e no final de cada semana.
2. Posicione o coelho do lado direito na caixa de fixação do coelho e fixe o fêmur esquerdo com uma mão.
3. Alinhe o centro do círculo do artroscópio médico com o centro lateral da articulação do joelho esquerdo do coelho. Estenda o braço de fixação de forma que ele fique paralelo à extensão da linha que liga o centro do círculo ao trocânter maior. Estenda o braço móvel de forma que fique paralelo ao eixo longitudinal da tíbia.
4. Coloque a outra mão no eixo longitudinal da tíbia, a aproximadamente 9 cm da articulação do joelho. Aplicar manualmente aproximadamente 750-850 g de torque a uma velocidade angular de 3°/s²⁸.
5. Execute isso até que a articulação do joelho do coelho não esteja mais se movendo. Registre o número de graus que o goniômetro exibe quando a articulação para de se mover; esta é a ADM da articulação do joelho. Durante a leitura, verifique se a linha de visão está perpendicular à superfície da régua.
6. Meça a ADM para cada joelho 3x e tome o valor médio²⁸.

6. Coloração pela hematoxilina-eosina (HE)

1. Coleta de amostras
   1. À 1 semana do final da intervenção (Figura 1), coloque o coelho do lado direito na caixa de fixação do coelho (os coelhos têm maior probabilidade de permanecer relaxados quando deitados do lado direito). Injetar pentobarbitona (100 mg/kg) na veia marginal da orelha do coelho para eutanásia humanizada^29,30.
   2. Abra a cavidade do joelho esquerdo rapidamente com bisturi, tesoura e pinça hemostática para remover o tecido mole aderido ao redor da cartilagem do fêmur distal.
   3. Coletar uma peça cartilaginosa-óssea de aproximadamente 1 cm x 1 cm do fêmur distal com pinça de mordida e colocá-la em soro fisiológico para limpeza.
2. Fixação e descalcificação
   1. Colocar a cartilagem em solução de paraformaldeído a 4% e fixar por 72 h.
   2. Enxágue em água corrente por 12 h. Descalcificar em solução de descalcificação do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) por 6 semanas. Troque a solução de descalcificação com EDTA a cada 3 dias. Determinar o ponto final da descalcificação quando o tecido ósseo se torna macio e flexível, pode ser facilmente dobrado e perfurado suavemente com uma agulha³¹.
3. Desidratação de seções embutidas
   1. Coloque o espécime em um desidratador automático para desidratação.
   2. Coloque o tecido encerado e aparado no fundo de um recipiente quadrado com cera de parafina dissolvida por 1 h. Leve ao forno de resfriamento até esfriar e solidificar em blocos duros. Cortar o bloco de tecido embebido em parafina em um corte até uma espessura de 4 μm.
   3. Desdobre as seções na máquina de água sanitária, depois coloque-as em lâminas adesivas, numere-as e seque-as com uma máquina de assar fatias e forno.
4. Desenceramento e hidratação
   1. Asse as seções a 65 °C por 60 min.
   2. Mergulhe as seções em xileno por 7 min, seguido por mais 2 rodadas de imersão em xileno fresco por 7 min cada.
   3. Mergulhe a fatia em etanol anidro por 5 min, seguido de imersão por 2 min cada em etanol 95%, etanol 85% e etanol 75%.
   4. Deixe as seções de molho em água destilada por 2 min.
5. Coloração hematoxilina: cortes coratórios com hematoxilina por 20 s. Enxágue as seções em água corrente. Seções de imersão em fracionamento de etanol de ácido clorídrico por 3 s. Enxágue as seções em água corrente por 5 min.
6. Recoloração de eosina: cortes de coloração com eosina por 30 s. Enxágue as seções com água da torneira.
7. Desidratação para transparência da amostra
   1. Colocar seções em etanol 95% duas vezes por 3 s cada, seguido de colocar em etanol anidro por 3 s.
   2. Novamente, coloque as fatias em etanol anidro por 1 min, seguido de 2 rodadas de xileno lavadas por 1 min cada.
8. Vedação das fatias: Retire as fatias, solte o selador de goma neutra, cubra com uma lamínula e deixe as fatias secarem em uma coifa até ficarem inodoras.
9. Fotografar a amostra: Observar e fotografar sob o campo de visão de um microscópio de luz a 100x.
10. Avaliação: Avaliar o tecido cartilaginoso pelo escore de Mankin para cada grupo³².

7. Análise dos dados

1. Analisar estatisticamente os dados experimentais utilizando software de análise. Quando os dados foram submetidos a uma distribuição normal, comparar dois grupos de amostras pelo teste t e múltiplos grupos por ANOVA one-way.
2. Expresse os resultados em média ± desvio padrão (DP). Representar resultados como gráficos estatísticos usando software comercial. As diferenças foram estatisticamente significantes com p < 0,05.

Resultados

O grau de restrição de movimento do joelho e o dano ao tecido cartilaginoso refletem a gravidade da OA. A ADM da articulação do joelho reflete o grau de restrição do movimento articular do joelho. Quanto menor a ADM articular do joelho, mais grave é a limitação do movimento articular do joelho. Ao contrário, quanto maior a ADM articular do joelho, mais normal é o grau de movimento do joelho. A coloração HE para observar a morfologia e estrutura do tecido cartilaginoso reflete o grau de dano do tecido cartila...

Discussão

O desenho do protocolo experimental é particularmente importante para investigar o mecanismo de Tuina no tratamento de OA hospitalar. A modelagem com OA foi realizada em coelhos por injeção de papaína em Waixiyan. Waixiyan está localizado na cripta lateral do ligamento patelar, que é fácil de localizar, e o espaço articular entre o fêmur e a tíbia é grande aqui durante a flexão do joelho, o que facilita a injeção na cavidade articular do joelho e evita danos aos tecidos circundantes, por isso é fácil esta...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 % sodium chloride injection	Sichuan Keren Pharmaceutical Co.	Z22121903
-20°C refrigerator	Haier	BD-328WL
4 % fixative solution	Solarbio	P1110
4°C refrigerator	Haier	SC-315DS
Anhydrous ethanol	Sinopharm
Automatic tissue dewatering machine	Dakowei (Shenzhen) Medical Equipment Co.	HP30
Blast drying oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co.	DHG-9070A
Coverslip	Biyuntian	FCGF50
Electric thermostat water bath	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co.	HWS-26
Embedding freezing table	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	BM450
Embedding machine	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	BM450A
Ethylenediaminetetraacetic acid decalcification solution	Servicebio	G1105-500ML
Fluorescent inverted microscope	Leica	Leica DM IL LED
Hematoxylin-eosin staining kit	Cisco Jet	EE0012
Hydrochloric acid	Laiyang Economic and Technological Development Zone Fine Chemical Plant
Medical joint goniometer	KOSLO
Neutral gum	Cisco Jet	EE0013
Normal-grade male New Zealand rabbit	Jinan Xilingjiao Breeding and Breeding Center	SCXK (Lu) 2020 0004
Papain(3000 U/mg)	Bioss	D10366
Pathological tissue bleaching and drying instrument	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	PH60
Pet electric clippers	Codos	CP-3180
Rabbit fixing box	any brand
Rotating Slicer	Leica	531CM-Y43
Tuina technique parameter determination instrument	Shanghai DuKang Instrument Equipment Co. Ltd.	ZTC-
Ventilator	TALY ELECTRIC	C32
Xylene	Fuyu Reagent