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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo descrive un metodo per l'intervento Tuina in un modello di coniglio di artrosi del ginocchio.

Abstract

L'artrosi del ginocchio (KOA) è caratterizzata principalmente da cambiamenti degenerativi nella cartilagine dell'articolazione del ginocchio e nei tessuti molli circostanti. L'efficacia di Tuina nel trattamento della KOA è stata confermata, ma il meccanismo sottostante deve essere studiato. Questo studio mira a stabilire un modello di coniglio KOA scientificamente fattibile trattato con Tuina per rivelare i meccanismi sottostanti. Per questo, 18 conigli neozelandesi maschi di 6 mesi di età normale sono stati divisi in modo casuale in gruppi finti, modello e Tuina, con 6 conigli in ciascun gruppo. Il modello KOA è stato stabilito iniettando una soluzione di papaina al 4% nella cavità dell'articolazione del ginocchio. Il gruppo Tuina è stato sottoposto a Tuina in combinazione con il metodo di correzione rotativa dell'articolazione del ginocchio per 4 settimane. Solo la presa e la fissazione standard sono state eseguite in gruppi fittizi e modello. Alla fine dell'intervento di 1 settimana, è stato osservato il range di movimento dell'articolazione del ginocchio (ROM) ed è stata eseguita la colorazione della cartilagine ematossilina-eosina (HE). Lo studio mostra che Tuina potrebbe inibire l'apoptosi dei condrociti, riparare il tessuto cartilagineo e ripristinare il ROM dell'articolazione del ginocchio. In conclusione, questo studio dimostra la fattibilità scientifica del trattamento Tuina per i conigli modello KOA, evidenziando la sua potenziale applicazione nello studio del KOA e di condizioni simili legate all'articolazione del ginocchio.

Introduzione

L'artrosi del ginocchio (KOA) è una malattia degenerativa dell'articolazione del ginocchio, che si manifesta principalmente con dolore, gonfiore, deformazione e limitazione dei movimenti del ginocchio, con un alto tasso di disabilità e una maggiore prevalenza nelle donne, con 527,81 milioni di pazienti con osteoartrite in tutto il mondo nel 2019 e la sua prevalenza globale che rappresenta il 60,6% della prevalenza globale totale di OA1. Dal punto di vista clinico, il trattamento della KOA è solitamente suddiviso in terapie non chirurgiche e chirurgiche. Le terapie non chirurgiche comprendono la fisioterapia, la farmacoterapia e la terapia iniettiva di plasma ricco di piastrine 2,3. Tuina è un metodo di trattamento comune, sicuro, affidabile ed efficace nella medicina cinese. Questo studio utilizza Tuina combinato con il metodo di correzione rotativa dell'articolazione del ginocchio per trattare la KOA. Le tecniche Tuina come il metodo rotativo di impastamento e pressatura possono bilanciare il tessuto muscolare, ridurre il dolore, regolare i livelli di fattore infiammatorio, migliorare il metabolismo dei tessuti e inibire la degenerazione della cartilagine articolare 4,5. Il metodo di correzione rotativa dell'articolazione del ginocchio può regolare l'allineamento delle ossa e delle articolazioni degli arti inferiori, migliorare lo spazio tra le articolazioni del ginocchio, ripristinare la normale linea di forza e bilanciare la biomeccanica degli arti inferiori 6,7,8,9. Gli esercizi di resistenza possono migliorare la massa muscolare e la forza e promuovere il rinnovamento del tessuto cartilagineo10,11. Uno studio preliminare ha rilevato che questo protocollo Tuina è significativamente più efficace delle capsule orali di glucosamina solfato nel trattamento della KOA, con un'insorgenza più rapida dell'azione e una significativa inibizione della degenerazione dei condrociti e della riparazione del tessuto cartilagineo danneggiato12. Nel trattamento della KOA, rispetto alla terapia Tuina, i farmaci antinfiammatori non steroidei hanno effetti avversi e un'efficacia a lungo termine insoddisfacente, rischi e costi chirurgici relativamente elevati e richiedono determinate indicazioni per il trattamento chirurgico, con problemi postoperatori e complicanze periprotesiche13,14,15. Rispetto alla terapia farmacologica e alla chirurgia, il trattamento Tuina per KOA offre diversi vantaggi, tra cui effetti collaterali ridotti, rischio inferiore, maggiore sicurezza, economicità ed efficacia più duratura. Inoltre, può alleviare efficacemente il dolore all'articolazione del ginocchio, il gonfiore, lo schiocco e il movimento limitato 6,13,16,17.

Tuttavia, il meccanismo di Tuina per il trattamento della KOA deve essere chiarito, il che limita il miglioramento e il perfezionamento del protocollo di trattamento della KOA. Pertanto, studiare il meccanismo di intervento di Tuina in KOA attraverso esperimenti su animali è un metodo efficace. I conigli, rispetto ai ratti, hanno un temperamento docile e articolazioni del ginocchio più grandi. La struttura anatomica e gli indici biochimici della cartilagine sono simili a quelli degli esseri umani, quindi è un argomento adatto per studiare il meccanismo della malattia dell'articolazione del ginocchio con Tuina18. Il modello KOA stabilito iniettando papaina nella cavità articolare del ginocchio dei conigli presenta i vantaggi di un breve tempo di modellazione, traumi ridotti, alto tasso di successo, alto tasso di sopravvivenza e meccanismo patologico simile a KOA19. Questo studio mira a stabilire un protocollo sperimentale animale scientificamente fattibile per l'intervento di Tuina in KOA e a studiare il meccanismo di Tuina.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Ospedale affiliato dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese dello Shandong (numero di approvazione: 2020-29).

1. Animali da esperimento

  1. Allevare 18 conigli neozelandesi maschi di 6 mesi di età normale (2,75 ± 0,25 kg) in gabbie singole standard (ciclo luce/buio di 12 ore, temperatura 20-24 °C, umidità dell'aria 40%-60%).

2. Metodo di raggruppamento

  1. Seleziona 6 dei 18 conigli neozelandesi come gruppo fittizio utilizzando il metodo del numero casuale e assegna i restanti 12 conigli al gruppo di modellazione.
  2. Dopo aver modellato con successo, dividi i conigli del gruppo di modellazione nei gruppi modello e Tuina secondo il metodo dei numeri casuali, con 6 conigli in ciascun gruppo.
  3. Eseguire l'intervento Tuina nel gruppo Tuina. Esegui la stessa presa e fissazione nel gruppo sham e modello senza Tuina. Operare a giorni alterni per 4 settimane (Figura 1).

3. Istituzione del modello KOA

  1. Eseguire l'alimentazione adattiva ai conigli nelle condizioni standard nella settimana 1. Accesso ad libitum all'acqua e al cibo. Metti i conigli sul lato destro nelle scatole di fissaggio per conigli per calmarli per 15 minuti al giorno. Fissare le teste sulle piastre di fissaggio della testa. Fissare le piastre di fissaggio e le viti in modo che i conigli non possano muoversi. Indossare guanti protettivi quando si afferrano e si fissano i conigli (Figura 1).
  2. Nei giorni 1, 4 e 7 della settimana 2, posizionare tutti e 18 i conigli sul lato destro nelle scatole di fissaggio del coniglio (Figura 1). Eseguire le operazioni indicate di seguito.
  3. Iniettare pentobarbital sodico al 3% (1 ml/kg) nella vena marginale dell'orecchio del coniglio. Radere l'articolazione del ginocchio sinistro del coniglio con un rasoio per animali, in modo da eliminare i peli sulla pelle esposta.
  4. Disinfettare l'articolazione del ginocchio sinistro del coniglio dall'interno verso l'esterno utilizzando iodoforo medico e alcol al 75% (Figura 2A).
  5. Fletti l'articolazione del ginocchio sinistro del coniglio a 60°. Inserire un ago (22G, 0,7 mm x 30 mm) di Waixiyan. Iniettare una soluzione di papaina al 4% (0,1 ml/kg, 0,275 ml in media per un animale di 2,5 kg) nella cavità dell'articolazione del ginocchio del gruppo di modellazione. Iniettare una quantità uguale di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% nel gruppo fittizio. Questa dose iniettiva è ben tollerata dall'animale senza causare segni di dolore o angoscia (Figura 2B).
    NOTA: Waixiyan (EX-LE5) si trova nel recesso laterale del legamento rotuleo e Neixiyan (EX-LE4) si trova nel recesso mediale del legamento rotuleo20,21,22.
  6. Premere il foro stenopeico per 2 minuti per evitare fuoriuscite di soluzione.
  7. Posiziona le mani sopra e sotto l'articolazione del ginocchio sinistro del coniglio. Flettere delicatamente e passivamente l'articolazione del ginocchio del coniglio ed estenderla 10 volte all'interno del range di movimento fisiologico (ROM) per infiltrare la soluzione nella cavità dell'articolazione del ginocchio in modo uniforme15. Osservare il coniglio ogni 8 ore per tutta la durata della modellazione. Somministrare buprenorfina SR (0,18 mg/kg) quando i conigli mostrano segni di nascondiglio, tremore degli arti, respirazione superficiale e rapida, o anche morsi e graffi.
  8. Alla settimana 7, osservare il ginocchio sinistro del coniglio in posizione flessa come gonfio, con aumento del tono muscolare intorno al ginocchio con noduli e strie, aumento della risposta all'irritazione dolorosa locale, diminuzione del ROM del ginocchio, andatura zoppa e spostamento del centro di gravità sul lato sano. Questo determina il successo del modello KOA (Figura 1, Figura 2C)23,24.

4. Manipolazione dei Tuina

  1. Eseguire l'allenamento utilizzando lo strumento di determinazione dei parametri della tecnica Tuina prima della manipolazione Tuina. Allenati per 1 ora al giorno per 1 mese dallo stesso professionista.
    1. Eseguire il metodo di impastamento e pressatura rotativo con il pollice sulla piattaforma di simulazione della manipolazione Tuina con una forza di 5 N e una frequenza di 60 volte/min (Figura 3A,C).
    2. Analizza la forza in tre direzioni degli assi X, Y e Z con il software di elaborazione dei parametri di manipolazione Tuina e controlla l'ampiezza, la frequenza e il tempo di azione della forza visualizzati sullo schermo (Figura 3B, D).
    3. Valutare i parametri meccanici della manipolazione Tuina e standardizzare la manipolazione Tuina utilizzando il software durante l'allenamento. Mantenere il metodo di impastamento e pressatura rotatorio standardizzato con il pollice con una forza di 5 N, una frequenza di 60 volte/min e un tempo di funzionamento continuo di 10 min. Vedere la forma d'onda quantitativa standardizzata della manipolazione in Figura 3B,D 25,26,27.
  2. Posiziona il coniglio sul lato destro nella scatola di fissaggio del coniglio. Accarezza delicatamente il coniglio per 10 secondi per calmare e rilassare il coniglio21. Quindi eseguire l'intervento Tuina.
  3. Eseguire il metodo di impastamento rotatorio con il pollice sulla rigidità dei muscoli peri-ginocchio sinistro del coniglio, sui nodi tendinei e sulla rotula, con una manipolazione di andata e ritorno su e giù con una forza di 5 N e una frequenza di 60 volte/min per 5 min.
  4. Utilizzare l'estremità del pollice per premere Yanglingquan (GB 34), Yinlingquan (SP 9), Waixiyan (EX-LE5), Neixiyan (EX-LE4), Heding (EX-LE2), Xuehai (SP 10), Liangqiu (ST 34) e Weizhong (BL 40)20,21,22, con una forza di 5 N e una frequenza di 60 volte/min, e operare su ciascun punto per 30 s.
  5. Eseguire il metodo di correzione rotativa sull'articolazione del ginocchio del coniglio ed eseguirlo 3 volte separatamente per ogni animale del gruppo.
    1. Fissare il femore con una mano. Posiziona prima l'altra mano dietro l'articolazione del ginocchio, quindi fissa i condili tibiali laterali e mediali rispettivamente con il pollice e l'anulare. Fissare la fossa poplitea con l'indice e il medio. Applicare la trazione e la forza di torsione.
    2. Fissare il femore con una mano. Fissare i bordi mediale e laterali della rotula con il pollice e il mignolo dell'altra mano. Fissare la base rotulea con l'indice, il medio e l'anulare. Applicare la forza di torsione.
    3. Mantenere la direzione della forza di trazione parallela all'asse lungo della tibia e la direzione della forza di torsione in linea con la direzione dello Xiyan inferiore. Usa le dita per tenere la pelle in posizione per evitare l'attrito tra la pelle e le dita.

5. Misurazione del ROM dell'articolazione del ginocchio

NOTA: Prima della misurazione, calmare il coniglio. Lo statistico di misurazione e l'operatore sono diversi l'uno dall'altro.

  1. Misurare la mobilità dell'articolazione del ginocchio sinistro dei conigli di ciascun gruppo all'inizio dell'esperimento e alla fine di ogni settimana.
  2. Posiziona il coniglio sul lato destro nella scatola di fissaggio del coniglio e fissa il femore sinistro con una mano.
  3. Allineare il centro del cerchio dell'artroscopio medico con il centro laterale dell'articolazione del ginocchio sinistro del coniglio. Estendere il braccio di fissaggio in modo che sia parallelo all'estensione della linea che collega il centro del cerchio al grande trocantere. Estendere il braccio mobile in modo che sia parallelo all'asse longitudinale della tibia.
  4. Posizionare l'altra mano sull'asse longitudinale della tibia, a circa 9 cm dall'articolazione del ginocchio. Applicare manualmente una coppia di circa 750-850 g ad una velocità angolare di 3°/s28.
  5. Esegui questa operazione fino a quando l'articolazione del ginocchio del coniglio non si muove più. Registrare il numero di gradi visualizzati dal goniometro quando l'articolazione smette di muoversi; questo è il ROM dell'articolazione del ginocchio. Durante la lettura, assicurarsi che la linea di vista sia perpendicolare alla superficie del righello.
  6. Misura il ROM per ogni ginocchio 3x e prendi il valore medio28.

6. Colorazione con ematossilina-eosina (HE)

  1. Raccolta dei campioni
    1. A 1 settimana dalla fine dell'intervento (Figura 1), posizionare il coniglio sul lato destro nella scatola di fissaggio del coniglio (è più probabile che i conigli rimangano rilassati quando sono sdraiati sul fianco destro). Iniettare pentobarbitone (100 mg/kg) nella vena marginale dell'orecchio del coniglio per l'eutanasia umana29,30.
    2. Apri rapidamente la cavità del ginocchio sinistro con un bisturi, forbici e una pinza emostatica per rimuovere i tessuti molli attaccati intorno alla cartilagine del femore distale.
    3. Raccogliere un campione di cartilagine-osso di circa 1 cm x 1 cm del femore distale con una pinza per mordere e metterlo in soluzione fisiologica per la pulizia.
  2. Fissazione e decalcificazione
    1. Mettere la cartilagine in una soluzione di paraformaldeide al 4% e fissarla per 72 h.
    2. Risciacquare in acqua corrente per 12 ore. Decalcificare in una soluzione di decalcificazione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 6 settimane. Cambiare la soluzione di decalcificazione EDTA ogni 3 giorni. Determinare il punto finale della decalcificazione quando il tessuto osseo diventa morbido e flessibile, può essere facilmente piegato e perforato senza problemi con un ago31.
  3. Disidratazione delle sezioni incorporate
    1. Mettere il campione in un disidratatore automatico per la disidratazione.
    2. Posizionare il fazzoletto cerato e rifilato sul fondo di un contenitore quadrato con la cera di paraffina disciolta per 1 ora. Mettili in un forno di raffreddamento fino a quando non si saranno raffreddati e solidificati in blocchi duri. Affettare il blocco di tessuto incluso in paraffina in uno slicer fino a uno spessore di 4 μm.
    3. Aprire le sezioni nella macchina per la candeggina, quindi posizionarle su vetrini adesivi, numerarle e asciugarle con una macchina per la cottura a fette e un forno.
  4. Deceratura e idratazione
    1. Infornare le sezioni a 65 °C per 60 min.
    2. Immergere le sezioni nello xilene per 7 minuti, seguite da altri 2 giri di ammollo nello xilene fresco per 7 minuti ciascuno.
    3. Immergere la fetta in etanolo anidro per 5 minuti, seguita da un ammollo per 2 minuti ciascuna in etanolo al 95%, etanolo all'85% ed etanolo al 75%.
    4. Immergere le sezioni in acqua distillata per 2 min.
  5. Colorazione con ematossilina: colorare le sezioni con ematossilina per 20 s. Sciacquare le sezioni sotto acqua corrente. Immergere le sezioni in etanolo con acido cloridrico frazionato per 3 s. Sciacquare le sezioni in acqua di rubinetto per 5 min.
  6. Ricolorazione con eosina: Colorare le sezioni con eosina per 30 s. Sciacquare le sezioni con acqua di rubinetto.
  7. Disidratazione per la trasparenza del campione
    1. Mettere le sezioni in etanolo al 95% due volte per 3 secondi ciascuna, quindi immergerle in etanolo anidro per 3 secondi.
    2. Ancora una volta, mettere le fette in etanolo anidro per 1 minuto, seguito da 2 giri di lavaggio allo xilene per 1 minuto ciascuno.
  8. Sigillatura delle fette: Estrarre le fette, far cadere il sigillante per gomme neutre, coprire con un vetrino coprioggetto e lasciare asciugare le fette in una cappa aspirante fino a quando non saranno inodori.
  9. Fotografare il campione: osservare e fotografare sotto il campo visivo di un microscopio ottico a 100x.
  10. Valutazione: Valutare il tessuto cartilagineo in base al punteggio di Mankin per ogni gruppo32.

7. Analisi dei dati

  1. Analizzare statisticamente i dati sperimentali utilizzando un software di analisi. Quando i dati sono stati sottoposti a una distribuzione normale, confrontare due gruppi di campioni mediante t-test e più gruppi mediante ANOVA unidirezionale.
  2. Esprimere i risultati come media ± deviazione standard (SD). Rappresentare i risultati come grafici statistici utilizzando software commerciale. Le differenze sono risultate statisticamente significative a p < 0,05.

Risultati

Il grado di limitazione del movimento del ginocchio e il danno al tessuto cartilagineo riflettono la gravità del KOA. Il ROM dell'articolazione del ginocchio riflette il grado di restrizione del movimento dell'articolazione del ginocchio. Più piccolo è il ROM dell'articolazione del ginocchio, più grave è la limitazione del movimento dell'articolazione del ginocchio. Al contrario, più grande è il ROM dell'articolazione del ginocchio, più normale è il grado di movimento del ginocchio. La colorazione HE per osserva...

Discussione

La progettazione del protocollo sperimentale è particolarmente importante per studiare il meccanismo di Tuina nel trattamento della KOA. La modellazione KOA è stata eseguita su conigli mediante iniezione di papaina a Waixiyan. Waixiyan si trova nella cripta laterale del legamento rotuleo, che è facile da localizzare, e lo spazio articolare tra il femore e la tibia è ampio qui durante la flessione del ginocchio, il che lo rende facile da iniettare nella cavità articolare del ginocchio e previene danni ai tessuti circ...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere potenziali conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto di Scienza e Tecnologia della Medicina Tradizionale Cinese della Provincia di Shandong (2021Q080) e dal Progetto di Eredità della Scuola Accademica di Medicina Tradizionale Cinese della Scuola Qilu [Lu-Wei-Letter (2022) 93].

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9 % sodium chloride injectionSichuan Keren Pharmaceutical Co.Z22121903
-20°C refrigeratorHaierBD-328WL
4 % fixative solutionSolarbioP1110
4°C refrigeratorHaierSC-315DS
Anhydrous ethanolSinopharm
Automatic tissue dewatering machineDakowei (Shenzhen) Medical Equipment Co.HP30
Blast drying ovenShanghai Yiheng Scientific Instruments Co.DHG-9070A
CoverslipBiyuntianFCGF50
Electric thermostat water bathShanghai Yiheng Scientific Instruments Co.HWS-26
Embedding freezing tableChangzhou Paishijie Medical Equipment Co.BM450
Embedding machineChangzhou Paishijie Medical Equipment Co.BM450A
Ethylenediaminetetraacetic acid decalcification solutionServicebioG1105-500ML
Fluorescent inverted microscopeLeicaLeica DM IL LED
Hematoxylin-eosin staining kitCisco JetEE0012
Hydrochloric acidLaiyang Economic and Technological Development Zone Fine Chemical Plant
Medical joint goniometerKOSLO
Neutral gumCisco JetEE0013
Normal-grade male New Zealand rabbitJinan Xilingjiao Breeding and Breeding CenterSCXK (Lu) 2020 0004
Papain(3000 U/mg)BiossD10366
Pathological tissue bleaching and drying instrumentChangzhou Paishijie Medical Equipment Co.PH60
Pet electric clippersCodosCP-3180
Rabbit fixing boxany brand
Rotating SlicerLeica531CM-Y43
Tuina technique parameter determination instrumentShanghai DuKang Instrument Equipment Co. Ltd.ZTC-figure-materials-2994
VentilatorTALY ELECTRICC32
XyleneFuyu Reagent

Riferimenti

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