התערבות טווינה במודל ארנב של דלקת מפרקים ניוונית בברך

Summary

הפרוטוקול מתאר שיטה להתערבות טווינה במודל ארנב של דלקת מפרקים ניוונית בברך.

Abstract

דלקת מפרקים ניוונית בברך (KOA) מאופיינת בעיקר בשינויים ניווניים בסחוס של מפרק הברך וברקמות הרכות שמסביב. יעילותה של טווינה בטיפול ב- KOA אושרה, אך יש לחקור את המנגנון הבסיסי. מחקר זה נועד לבסס מודל ארנב KOA אפשרי מבחינה מדעית שטופל בטווינה כדי לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיסו. לשם כך, 18, ארנבים ניו זילנדים זכרים בני 6 חודשים חולקו באופן אקראי לקבוצות דמה, מודל וטווינה, עם 6 ארנבים בכל קבוצה. מודל KOA הוקם על ידי הזרקת תמיסת פפאין 4% לחלל מפרק הברך. קבוצת טווינה התערבה עם טווינה בשילוב עם שיטת תיקון סיבובי מפרק הברך במשך 4 שבועות. רק האחיזה והקיבוע הסטנדרטיים בוצעו בקבוצות דמה ומודל. בתום ההתערבות בת השבוע, נצפה טווח התנועה של מפרק הברך (ROM), ובוצע צביעת סחוס המטוקסילין-אאוסין (HE). המחקר מראה כי Tuina יכול לעכב אפופטוזיס chondrocyte, לתקן רקמת סחוס, ולשחזר ROM מפרק הברך. לסיכום, מחקר זה מדגים את ההיתכנות המדעית של טיפול Tuina עבור ארנבים מודל KOA, תוך הדגשת היישום הפוטנציאלי שלו במחקר של KOA ומצבים דומים הקשורים למפרקי הברך.

Introduction

דלקת מפרקים ניוונית בברך (KOA) היא מחלה ניוונית של מפרק הברך, המתבטאת בעיקר בכאבי ברכיים, נפיחות, עיוותים ותנועה מוגבלת, עם שיעור נכות גבוה ושכיחות גבוהה יותר בנשים, עם 527.81 מיליון חולים עם דלקת מפרקים ניוונית ברחבי העולם בשנת 2019 ושכיחותה העולמית מהווה 60.6% מכלל השכיחות העולמית של OA¹. מבחינה קלינית, הטיפול ב- KOA מחולק בדרך כלל לטיפולים לא כירורגיים וכירורגיים. טיפולים לא כירורגיים כוללים פיזיותרפיה, טיפול תרופתי והזרקת פלזמה עשירה בטסיות דם ^2,3. טווינא היא שיטת טיפול נפוצה, בטוחה, אמינה ויעילה ברפואה הסינית. מחקר זה משתמש בטווינה בשילוב עם שיטת תיקון סיבובי מפרק הברך לטיפול ב- KOA. טכניקות טווינא כגון שיטת הלישה והלחיצה הסיבובית יכולות לאזן את רקמת השריר, להפחית כאב, להתאים את רמות הגורמים הדלקתיים, לשפר את חילוף החומרים ברקמות ולעכב ניוון סחוס מפרקי ^4,5. שיטת התיקון הסיבובי של מפרק הברך יכולה להתאים את יישור עצמות הגפיים התחתונות והמפרקים, לשפר את מרווח מפרק הברך, להחזיר את קו הכוח הרגיל ולאזן את הביומכניקה של הגפיים התחתונות 6,7,8,9. תרגילי התנגדות יכולים לשפר את מסת השריר ואת כוחו ולקדם את חידוש רקמת הסחוס^10,11. מחקר ראשוני מצא כי פרוטוקול Tuina זה יעיל משמעותית יותר מכמוסות גלוקוזאמין סולפט פומיות בטיפול ב- KOA, עם תחילת פעולה מהירה יותר ועיכוב משמעותי של ניוון כונדרוציטים ותיקון רקמת סחוס פגועה¹². בטיפול ב- KOA, בהשוואה לטיפול בטווינה, לתרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידים יש תופעות לוואי ויעילות לא מספקת לטווח ארוך, סיכונים ועלויות ניתוחיות גבוהות יחסית, ודורשות אינדיקציות מסוימות לטיפול כירורגי, עם בעיות לאחר הניתוח וסיבוכים פריפרוסתטיים^13,14,15. בהשוואה לטיפול תרופתי וניתוח, טיפול Tuina עבור KOA מציע מספר יתרונות, כולל תופעות לוואי מופחתות, סיכון נמוך יותר, בטיחות משופרת, חסכוניות ויעילות לאורך זמן. בנוסף, הוא יכול להקל ביעילות על כאבי מפרקי ברכיים, נפיחות, קפיצות ותנועה מוגבלת 6,13,16,17.

עם זאת, יש להבהיר את המנגנון של Tuina לטיפול ב- KOA, המגביל את השיפור והשלמות של פרוטוקול הטיפול ב- KOA. לכן, לימוד מנגנון התערבות טווינה ב- KOA באמצעות ניסויים בבעלי חיים היא שיטה יעילה. לארנבים, בהשוואה לחולדות, יש מזג צייתני ומפרקי ברכיים גדולים יותר. המבנה האנטומי והאינדקסים הביוכימיים של הסחוס דומים לאלה של בני אדם, ולכן זהו נושא מתאים לחקר המנגנון של מחלת מפרקי הברך על ידי Tuina¹⁸. מודל KOA שהוקם על ידי הזרקת פפאין לחלל מפרק הברך של ארנבים יש את היתרונות של זמן דוגמנות קצר, טראומה מופחתת, שיעור הצלחה גבוה, שיעור הישרדות גבוה, ומנגנון פתולוגי דומה KOA¹⁹. מחקר זה נועד לבסס פרוטוקול ניסויי בבעלי חיים אפשרי מבחינה מדעית להתערבות Tuina ב- KOA ולחקור את המנגנון של Tuina.

Protocol

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המסונף של אוניברסיטת שאנדונג לרפואה סינית מסורתית (מספר אישור: 2020-29).

1. חיות ניסוי

1. יש לגדל ארנבים ניו זילנדים זכרים בני 18 חודשים בני 6 חודשים (2.75 ± 0.25 ק"ג) בכלובים בודדים סטנדרטיים (מחזור אור/חושך של 12 שעות, טמפרטורה 20-24 מעלות צלזיוס, לחות אוויר 40%-60%).

2. שיטת קיבוץ

1. בחר 6 מתוך 18 הארנבים הניו זילנדים כקבוצת דמה בשיטת המספר האקראי והקצה את 12 הארנבים הנותרים לקבוצת הדוגמנות.
2. לאחר מידול מוצלח, חלקו את ארנבי קבוצת הדוגמנות לקבוצות מודל וטווינה לפי שיטת המספרים האקראיים, עם 6 ארנבים בכל קבוצה.
3. בצע את התערבות Tuina בקבוצת Tuina. בצע את אותה אחיזה וקיבעון בקבוצת הבושה והמודל ללא טווינה. פעלו אחת ליומיים במשך 4 שבועות (איור 1).

3. ביסוס מודל KOA

1. בצע האכלה אדפטיבית לארנבים במצב הסטנדרטי בשבוע 1. גישה אד-ליביטום, למים ולמזון. הניחו ארנבים על צדם הימני בקופסאות קיבוע הארנבים כדי להרגיע אותם למשך 15 דקות ביום. מקבעים את ראשם על לוחות קיבוע הראש. תקן את לוחות ההידוק והברגים כך שהארנבים לא יוכלו לזוז. לבשו כפפות מגן כשאתם תופסים ומתקנים את הארנבים (איור 1).
2. בימים 1, 4 ו-7 בשבוע 2, הניחו את כל 18 הארנבים בצד ימין שלהם בקופסאות קיבוע הארנבים (איור 1). בצע את הפעולות המוזכרות להלן.
3. הזריקו 3% נתרן פנטוברביטלי (1 מ"ל/ק"ג) לווריד האוזן השולי של הארנב. יש לגלח את מפרק הברך השמאלית של הארנב בעזרת מכונת גילוח לבעלי חיים, והתוצאה היא שאין שיער על העור החשוף.
4. חיטאו את מפרק הברך השמאלית של הארנב מבפנים החוצה באמצעות יודופור רפואי ו-75% אלכוהול (איור 2A).
5. כופפו את מפרק הברך השמאלית של הארנב ב-60°. הכנס מחט (22G, 0.7 מ"מ x 30 מ"מ) מ Waixiyan. הזריקו 4% תמיסת פפאין (0.1 מ"ל/ק"ג, 0.275 מ"ל בממוצע לחיה במשקל 2.5 ק"ג) לחלל מפרק הברך של קבוצת הדוגמנות. הזריקו כמות שווה של תמיסת נתרן כלורי 0.9% לקבוצת הדמה. מנת ההזרקה הזו נסבלת היטב על-ידי החיה מבלי לגרום לעדות לכאב או מצוקה (איור 2B).
   הערה: Waixiyan (EX-LE5) ממוקם בהפסקה הצידית של הרצועה הפטלרית, ו- Neixiyan (EX-LE4) ממוקם בהפסקה המדיאלית של הרצועה הפטלרית^20,21,22.
6. לחץ על חור הסיכה למשך 2 דקות כדי למנוע שפיכת תמיסה.
7. הניחו את ידיכם מעל ומתחת למפרק הברך השמאלי של הארנב. כופפו בעדינות ובאופן פסיבי את מפרק הברך של הארנב והאריכו 10 פעמים בטווח התנועה הפיזיולוגי (ROM) כדי להחדיר את התמיסה לחלל מפרק הברך באופן שווה¹⁵. שימו לב לארנב כל 8 שעות למשך הדוגמנות. מתן buprenorphine SR (0.18 מ"ג / ק"ג) כאשר הארנבים מראים סימנים של הסתתרות, רעד של גפיים, נשימה רדודה ומהירה, או אפילו נשיכה ושריטה.
8. בשבוע 7, שימו לב לברך שמאל של הארנב במצב מכופפת כנפוחה, עם טונוס שרירים מוגבר סביב הברך עם גושים וסטריה, תגובה מוגברת לגירוי מקומי כואב, ירידה ברום הברך, הליכה צולעת, והסטה של מרכז הכובד לצד הבריא. זה קובע את ההצלחה של מודל KOA (איור 1, איור 2C)^23,24.

4. מניפולציה Tuina

1. בצע אימון באמצעות מכשיר קביעת פרמטרים של טכניקת Tuina לפני מניפולציה Tuina. התאמנו במשך שעה ביום במשך חודש על ידי אותו איש מקצוע.
   1. בצעו את שיטת הלישה והלחיצה הסיבובית עם האגודל על פלטפורמת סימולציית המניפולציה של Tuina בכוח של 5 N ובתדירות של 60 פעמים לדקה (איור 3A,C).
   2. נתחו את הכוח בשלושה כיוונים של צירי X, Y ו-Z באמצעות תוכנת עיבוד פרמטרי המניפולציה של Tuina ובדקו את הגודל, התדירות וזמן הפעולה של הכוח המוצגים על המסך (איור 3B, D).
   3. להעריך את הפרמטרים המכניים של מניפולציית Tuina ולתקנן את מניפולציית Tuina באמצעות התוכנה במהלך האימון. שמור על שיטת הלישה והלחיצה הסיבובית הסטנדרטית עם האגודל בכוח של 5 N, תדירות של 60 פעמים לדקה, וזמן פעולה רציף של 10 דקות. ראו את צורת הגל הכמותית המתוקננת של המניפולציה באיור 3B,D ^25,26,27.
2. הניחו את הארנב על צדו הימני בקופסת קיבוע הארנב. לטפו בעדינות את הארנב במשך 10 שניות כדי להרגיע ולהרגיע את הארנב²¹. לאחר מכן בצע את התערבות טווינה.
3. בצעו את שיטת הלישה הסיבובית עם האגודל על נוקשות שרירי הברך השמאלית של הארנב, קשרי גידים ופטלה, עם מניפולציה הלוך ושוב למעלה ולמטה בכוח של 5 N ותדירות של 60 פעמים לדקה למשך 5 דקות.
4. השתמש בקצה האגודל כדי ללחוץ על Yanglingquan (GB 34), Yinlingquan (SP 9), Waixiyan (EX-LE5), Neixiyan (EX-LE4), Heding (EX-LE2), Xuehai (SP 10), Liangqiu (ST 34) ו- Weizhong (BL 40)20,21,22, בכוח של 5 N ותדירות של 60 פעמים לדקה^, והפעל בכל נקודה במשך ³⁰ שניות.
5. בצע את שיטת התיקון הסיבובי על מפרק ברך הארנב ובצע זאת 3x בנפרד עבור כל חיה בקבוצה.
   1. תקן את עצם הירך ביד אחת. הניחו תחילה את היד השנייה מאחורי מפרק הברך, ולאחר מכן תקנו את הקונדילים הטיביאליים הצדיים והמדיאליים בעזרת האגודל והטבעת, בהתאמה. תקן את fossa popliteal עם האצבע המורה ואת האצבעות האמצעיות. הפעילו כוח משיכה ופיתול.
   2. תקן את עצם הירך ביד אחת. מקבעים את הקצוות המדיאליים והצדדיים של הפטלה בעזרת האגודל והאצבעות הקטנות של היד השנייה. תקן את בסיס הפטלר באמצעות האצבע המורה, האמצעית והטבעת. הפעל כוח פיתול.
   3. שמור על כיוון כוח המתיחה במקביל לציר הארוך של השוקה, וכיוון כוח הפיתול בקו אחד עם כיוון השייאן התחתון. השתמש באצבעות כדי להחזיק את העור במקום כדי למנוע חיכוך בין העור לאצבעות.

5. מדידת ROM של מפרק הברך

הערה: לפני המדידה, הרגיעו את הארנב. סטטיסטיקאי המדידה ומפעיל המדידה שונים זה מזה.

1. למדוד את הניידות של מפרק הברך השמאלית של ארנבים מכל קבוצה בתחילת הניסוי ובסוף כל שבוע.
2. מקמו את הארנב על צדו הימני בקופסת קיבוע הארנב וקיבעו את עצם הירך השמאלית שלו ביד אחת.
3. יישרו את מרכז המעגל של הארתרוסקופ הרפואי עם המרכז הלטרלי של מפרק הברך השמאלי של הארנב. האריכו את זרוע הקיבוע כך שתהיה מקבילה להארכת הקו המחברת בין מרכז המעגל לטרוכנטר הגדול יותר. האריכו את הזרוע הניידת כך שתהיה מקבילה לציר האורך של השוקה.
4. מניחים את היד השנייה על ציר האורך של השוקה, כ-9 ס"מ ממפרק הברך. יש להפעיל ידנית מומנט של כ-750-850 גרם במהירות זוויתית של 3°/^{s 28}.
5. בצע זאת עד שמפרק הברך של הארנב כבר לא זז . רשום את מספר המעלות שמציג הגוניומטר כאשר המפרק מפסיק לנוע; זהו ROM מפרק הברך. בעת הקריאה, ודא שקו הראייה מאונך לפני השטח של הסרגל.
6. למדוד ROM עבור כל ברך 3x ולקחת את הערך הממוצע²⁸.

6. צביעת Hematoxylin-eosin (HE)

1. אוסף דוגמאות
   1. שבוע מסיום ההתערבות (איור 1), הניחו את הארנב על צדו הימני בקופסת קיבוע הארנב (ארנבים נוטים יותר להישאר רגועים כשהם שוכבים על צדם הימני). הזריקו פנטוברביטון (100 מ"ג/ק"ג) לווריד השולי באוזן הארנב להמתת חסד הומנית^29,30.
   2. פתח את חלל ברך שמאל במהירות בעזרת אזמל, מספריים ומלקחיים המוסטטיים כדי להסיר את הרקמה הרכה המחוברת סביב הסחוס של עצם הירך הדיסטלית.
   3. אספו דגימת עצם סחוס בגודל של כ-1X1 ס"מ של עצם הירך הדיסטלית עם מלקחיים נושכים והניחו אותה במי מלח לניקוי.
2. קיבוע והסתיידות
   1. מניחים את הסחוס בתמיסת פרפורמלדהיד 4% ומקבעים אותו למשך 72 שעות.
   2. יש לשטוף במים זורמים במשך 12 שעות. Decalcify ב ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) decalcification פתרון במשך 6 שבועות. שנה את פתרון הסתיידות EDTA כל 3 ימים. לקבוע את נקודת הסיום של decalcification כאשר רקמת העצם הופכת רכה וגמישה, ניתן לכופף בקלות, ו פירסינג בצורה חלקה עם מחט³¹.
3. התייבשות של חלקים משובצים
   1. הניחו את הדגימה במייבש אוטומטי להתייבשות.
   2. מניחים את הרקמה השעווה והגזוז על תחתית מיכל מרובע עם שעוות פרפין מומסת למשך שעה אחת. מכניסים אותם לתנור קירור עד שהם מתקררים ומתמצקים לגושים קשים. פורסים את גוש הרקמה המשובץ בפרפין בכלי פריסה לעובי של 4 מיקרומטר.
   3. פתחו את החלקים במכונת האקונומיקה, הניחו אותם על שקופיות דבק, ספרו אותם וייבשו אותם בעזרת מכונת אפייה פרוסה ותנור.
4. הסרת שעווה והידרציה
   1. אופים את הנתחים בחום של 180 מעלות במשך 60 דקות.
   2. משרים את החלקים בקסילן למשך 7 דקות, ולאחר מכן 2 סיבובים נוספים של השריה בקסילן טרי למשך 7 דקות כל אחד.
   3. משרים את הפרוסה באתנול נטול מים למשך 5 דקות, ולאחר מכן משרים במשך 2 דקות כל אחד ב-95% אתנול, 85% אתנול ו-75% אתנול.
   4. משרים חלקים במים מזוקקים למשך 2 דקות.
5. צביעת המטוקסילין: מכתים חלקים עם המטוקסילין למשך 20 שניות. יש לשטוף חלקים במים זורמים. משרים חלקים במקטע אתנול חומצה הידרוכלורית למשך 3 שניות. יש לשטוף חלקים במי ברז במשך 5 דקות.
6. צביעה מחדש של אאוסין: מקטעי כתמים עם אאוזין למשך 30 שניות. יש לשטוף חלקים במי ברז.
7. התייבשות לשקיפות הדגימה
   1. מניחים חלקים באתנול 95% פעמיים במשך 3 שניות כל אחד, ולאחר מכן מניחים אתנול נטול מים במשך 3 שניות.
   2. שוב, מניחים את הפרוסות באתנול נטול מים למשך דקה אחת, ולאחר מכן 2 סיבובים של שטיפת קסילן למשך דקה כל אחד.
8. איטום הפרוסות: מוציאים את הפרוסות, מטפטפים חומר אטימת מסטיק ניטרלי, מכסים במכסה ומשאירים את הפרוסות להתייבש במכסה אדים עד לקבלת ריח.
9. צילום הדגימה: התבוננות וצילום מתחת לשדה הראייה של מיקרוסקופ אור ברזולוציה של 100x.
10. הערכה: להעריך את רקמת הסחוס לפי ציון מנקין לכל קבוצה³².

7. ניתוח נתונים

1. נתח סטטיסטית את נתוני הניסוי באמצעות תוכנת ניתוח. כאשר הנתונים היו נתונים להתפלגות נורמלית, השווה שתי קבוצות של דגימות על ידי מבחן t וקבוצות מרובות על ידי ANOVA בכיוון אחד.
2. תוצאות מפורשות כממוצע ± סטיית תקן (SD). ייצוג תוצאות כתרשימים סטטיסטיים באמצעות תוכנה מסחרית. ההבדלים היו מובהקים סטטיסטית ב-p <-0.05.

תוצאות

מידת ההגבלה בתנועת הברך והנזק לרקמת הסחוס משקפת את חומרת ה-KOA. הרום של מפרק הברך משקף את מידת ההגבלה של תנועת מפרק הברך. ככל שהרום של מפרק הברך קטן יותר, כך המגבלה בתנועת מפרק הברך חמורה יותר. להיפך, ככל שהרום של מפרק הברך גדול יותר, כך מידת תנועת הברך תקינה יותר. צביעת HE כדי לבחון את המורפולוג?...

Discussion

תכנון פרוטוקול הניסוי חשוב במיוחד כדי לחקור את המנגנון של טווינה בטיפול ב- KOA. דוגמנות KOA בוצעה על ארנבים על ידי הזרקת פפאין בוואישיאן. Waixiyan ממוקם בקריפטה הצידית של הרצועה הפטלרית, שקל לאתר, והחלל המשותף בין עצם הירך לטיביה גדול כאן במהלך כיפוף הברך, מה שמקל על הזרקה לחלל מפרק הברך ומונע נזק ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 % sodium chloride injection	Sichuan Keren Pharmaceutical Co.	Z22121903
-20°C refrigerator	Haier	BD-328WL
4 % fixative solution	Solarbio	P1110
4°C refrigerator	Haier	SC-315DS
Anhydrous ethanol	Sinopharm
Automatic tissue dewatering machine	Dakowei (Shenzhen) Medical Equipment Co.	HP30
Blast drying oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co.	DHG-9070A
Coverslip	Biyuntian	FCGF50
Electric thermostat water bath	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co.	HWS-26
Embedding freezing table	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	BM450
Embedding machine	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	BM450A
Ethylenediaminetetraacetic acid decalcification solution	Servicebio	G1105-500ML
Fluorescent inverted microscope	Leica	Leica DM IL LED
Hematoxylin-eosin staining kit	Cisco Jet	EE0012
Hydrochloric acid	Laiyang Economic and Technological Development Zone Fine Chemical Plant
Medical joint goniometer	KOSLO
Neutral gum	Cisco Jet	EE0013
Normal-grade male New Zealand rabbit	Jinan Xilingjiao Breeding and Breeding Center	SCXK (Lu) 2020 0004
Papain(3000 U/mg)	Bioss	D10366
Pathological tissue bleaching and drying instrument	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	PH60
Pet electric clippers	Codos	CP-3180
Rabbit fixing box	any brand
Rotating Slicer	Leica	531CM-Y43
Tuina technique parameter determination instrument	Shanghai DuKang Instrument Equipment Co. Ltd.	ZTC-
Ventilator	TALY ELECTRIC	C32
Xylene	Fuyu Reagent