무릎 골관절염의 토끼 모델에 대한 Tuina 개입

요약

이 프로토콜은 무릎 골관절염의 토끼 모델에서 Tuina 중재 방법을 설명합니다.

초록

무릎 골관절염(KOA)은 주로 무릎 관절의 연골과 주변 연조직의 퇴행성 변화를 특징으로 합니다. KOA 치료에 대한 Tuina의 효능은 확인되었지만 근본적인 메커니즘에 대한 조사가 필요합니다. 본 연구는 투이나로 처리한 과학적으로 실현 가능한 KOA 토끼 모델을 확립하여 근본적인 기전을 밝히는 것을 목표로 한다. 이를 위해 생후 6개월 된 정상 등급의 수컷 뉴질랜드 수컷 토끼 18마리를 가짜, 모델, 투이나 그룹으로 무작위 나누고 각 그룹에 6마리의 토끼를 배치했습니다. KOA 모델은 무릎 관절강에 4% 파파인 용액을 주입하여 확립되었습니다. 투이나군은 투이나와 무릎관절 회전교정법을 병행하여 4주간 투여하였다. 표준 파지와 고정만이 가짜 및 모델 그룹에서 수행되었습니다. 1주간의 중재가 끝날 때 무릎 관절 운동 범위(ROM)를 관찰하고 연골 헤마톡실린-에오신(HE) 염색을 수행했습니다. 이 연구는 Tuina가 연골 세포 사멸을 억제하고 연골 조직을 복구하며 무릎 관절 ROM을 복원할 수 있음을 보여줍니다. 결론적으로, 이 연구는 KOA 모델 토끼에 대한 Tuina 치료의 과학적 타당성을 입증하고, KOA 및 유사한 무릎 관절 관련 질환 연구에 적용할 수 있는 가능성을 강조합니다.

서문

무릎 골관절염(KOA)은 무릎 관절의 퇴행성 질환으로 주로 무릎 통증, 부종, 변형, 움직임 제한 등으로 나타나며, 장애율이 높고 여성의 유병률이 높아 2019년 전 세계 골관절염 환자는 5억 2,781만 명이며, 골관절염 유병률은 전 세계 골관절염 유병률의 60.6%를 차지합니다. 임상적으로 KOA의 치료는 일반적으로 비수술적 치료와 수술적 치료로 나뉩니다. 비수술적 치료에는 물리치료, 약물치료, 혈소판이 풍부한 혈장 주입 요법이 포함된다 ^2,3. 투이나는 한의학에서 일반적이고 안전하며 신뢰할 수 있고 효과적인 치료 방법입니다. 본 연구는 무릎관절 회전교정법과 투이나를 병용하여 KOA를 치료한다. 회전 반죽 및 압착법과 같은 Tuina 기술은 근육 조직의 균형을 맞추고, 통증을 줄이고, 염증 인자 수준을 조정하고, 조직 대사를 개선하고, 관절 연골 퇴행을 억제할 수 있습니다 ^4,5. 무릎 관절 회전 교정법은 하지 뼈와 관절의 정렬을 조정하고, 무릎 관절 간격을 개선하고, 수직력 라인을 복원하고, 하지 생체 역학 6,7,8,9의 균형을 맞출 수 있습니다. 저항 운동은 근육량과 근력을 향상시키고 연골 조직 재생을 촉진할 수 있습니다^10,11. 예비 연구에 따르면 이 투이나 프로토콜은 KOA 치료에 경구용 글루코사민 설페이트 캡슐보다 훨씬 더 효과적이며, 작용이 더 빨리 시작되고 연골 세포 퇴화 및 손상된 연골 조직의 복구가 현저히 억제되는 것으로 나타났습니다¹². KOA 치료에서 비스테로이드성 항염증제는 투이나 요법에 비해 부작용과 불만족스러운 장기 효능, 상대적으로 높은 수술 위험과 비용을 가지고 있으며, 수술 후 문제 및 보철 주위 합병증과 함께 수술 치료에 대한 특정 적응증이 필요하다^13,14,15. 약물 요법 및 수술과 비교할 때 KOA에 대한 Tuina 치료는 부작용 감소, 위험 감소, 안전성 향상, 비용 효율성 및 오래 지속되는 효능 등 여러 가지 이점을 제공합니다. 또한 무릎 관절 통증, 부기, 터짐 및 제한된 움직임을 효과적으로 완화할 수 있습니다 6,13,16,17.

그러나 KOA 치료를 위한 Tuina의 메커니즘을 명확히 할 필요가 있으며, 이는 KOA 치료 프로토콜의 개선과 완성을 제한합니다. 따라서 동물실험을 통해 KOA에서 투이나의 개입 기전을 연구하는 것이 효과적인 방법이다. 토끼는 쥐에 비해 유순한 기질과 더 큰 무릎 관절을 가지고 있습니다. 해부학적 구조와 연골의 생화학적 지표는 인간과 유사하기 때문에 Tuina¹⁸의 무릎관절 질환의 기전을 연구하기에 적합한 과목이다. 토끼의 무릎 관절강에 파파인을 주입하여 확립된 KOA 모델은 모델링 시간이 짧고, 외상이 감소하며, 성공률이 높고, 생존율이 높으며, KOA¹⁹와 유사한 병리학적 기전을 가지고 있다는 장점이 있다. 본 연구는 과학적으로 실현 가능한 동물실험 프로토콜을 확립하여 투이나의 KOA 개입을 규명하고, 투이나의 기전을 규명하는 것을 목적으로 한다.

프로토콜

이 연구는 Shandong University of Traditional Chinese Medicine 부속병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호: 2020-29).

1. 실험동물

1. 18개월된 6개월 된 보통 등급의 수컷 뉴질랜드 토끼(2.75 ± 0.25kg)를 표준 단일 케이지(12시간 밝음/어두움 주기, 온도 20-24°C, 공기 습도 40%-60%)에서 키웁니다.

2. 그룹화 방법

1. 난수 방법을 사용하여 18마리의 뉴질랜드 토끼 중 6마리를 가짜 그룹으로 선택하고 나머지 12마리의 토끼를 모델링 그룹에 할당합니다.
2. 모델링에 성공한 후 모델링 그룹 토끼를 난수 방법에 따라 모델과 Tuina 그룹으로 나누고 각 그룹에 6마리의 토끼를 배치합니다.
3. Tuina 그룹에서 Tuina 개입을 수행합니다. Tuina가 없는 가짜 및 모델 그룹에서 동일한 잡기 및 고정을 수행합니다. 4주 동안 격일로 작동합니다(그림 1).

3. KOA 모델 구축

1. 1주차에 표준 조건에서 토끼에게 적응 먹이를 수행합니다. 물과 음식에 대한 애드리비텀 접근. 토끼를 토끼 고정 상자에 오른쪽에 눕혀 하루 15분 동안 진정시킵니다. 머리 고정판에 머리를 고정하십시오. 토끼가 움직이지 않도록 고정 플레이트와 나사를 고정하십시오. 토끼를 잡고 고정할 때는 보호 장갑을 착용하십시오(그림 1).
2. 2주차의 1일, 4일, 7일차에 18마리의 토끼를 모두 토끼 고정 상자에 오른쪽에 놓습니다(그림 1). 아래에 언급된 작업을 수행합니다.
3. 3% 펜토바르비탈 나트륨(1ml/kg)을 토끼의 가장자리 귀 정맥에 주입합니다. 동물 면도기로 토끼의 왼쪽 무릎 관절을 면도하여 노출된 피부에 털이 생기지 않도록 합니다.
4. 토끼의 왼쪽 무릎 관절을 의료용 요오드와 75% 알코올을 사용하여 안쪽에서 바깥쪽으로 소독합니다(그림 2A).
5. 토끼의 왼쪽 무릎 관절을 60°로 구부립니다. Waixiyan의 바늘(22G, 0.7mm x 30mm)을 삽입합니다. 4% 파파인 용액(0.1mL/kg, 2.5kg 동물의 경우 평균 0.275mL)을 모델링 그룹의 무릎 관절강에 주입합니다. 동일한 양의 0.9% 염화나트륨 용액을 가짜 그룹에 주입합니다. 이 주사 용량은 통증이나 고통의 증거를 유발하지 않고 동물에 의해 잘 견뎌냅니다(그림 2B).
   알림: Waixiyan(EX-LE5)은 슬개골 인대의 외측 오목부에 위치하고 Neixiyan(EX-LE4)은 슬개골^{인대 20,21,22}의 내측 오목한 곳에 있습니다.
6. 용액이 쏟아지지 않도록 핀홀을 2분 동안 누릅니다.
7. 토끼의 왼쪽 무릎 관절 위와 아래에 손을 놓습니다. 토끼의 무릎 관절을 부드럽고 수동적으로 구부리고 생리적 운동 범위(ROM) 내에서 10회 확장하여 용액을 무릎 관절강에 고르게 침투시킵니다¹⁵. 모델링 기간 동안 8시간마다 토끼를 관찰하십시오. 토끼가 숨거나, 팔다리가 떨리거나, 얕고 빠른 호흡을 하거나, 심지어 물거나 긁는 징후를 보일 때 부프레노르핀 SR(0.18mg/kg)을 투여합니다.
8. 7주차에 토끼의 왼쪽 무릎이 부어오른 상태로 구부러진 상태에서 결절과 줄무늬가 있는 무릎 주위의 근육 긴장도가 증가하고, 국소 통증 자극 반응이 증가하고, 무릎 ROM이 감소하고, 절름발이 걸음걸이가 되고, 무게 중심이 건강한 쪽으로 이동하는 것을 관찰합니다. 이것은 KOA 모델의 성공을 결정합니다(그림 1, 그림 2C)^23,24.

4. 투이나 조작

1. Tuina 조작 전에 Tuina 기법 파라미터 결정 도구를 사용하여 훈련을 수행합니다. 같은 전문가가 1개월 동안 하루에 1시간씩 훈련합니다.
   1. Tuina 조작 시뮬레이션 플랫폼에서 엄지손가락으로 5N의 힘과 60회/분의 빈도로 회전 반죽 및 압착 방법을 수행합니다(그림 3A,C).
   2. Tuina 조작 파라미터 처리 소프트웨어로 X, Y, Z축의 세 방향에서 힘을 분석하고 화면에 표시된 힘의 크기, 빈도 및 작용 시간을 확인합니다(그림 3B, D).
   3. Tuina 조작의 기계적 매개변수를 평가하고 훈련 중에 소프트웨어를 사용하여 Tuina 조작을 표준화합니다. 엄지손가락으로 5N의 힘, 60회/분의 빈도, 10분의 연속 작동 시간으로 표준화된 회전 반죽 및 압착 방식을 유지합니다. 그림 3B,D ^25,26,27에서 조작의 표준화된 정량적 파형을 참조하십시오.
2. 토끼 고정 상자에 토끼를 오른쪽으로 놓습니다. 토끼를 달래고 이완시키기 위해 10초 동안 토끼를 부드럽게 쓰다듬습니다²¹. 그런 다음 Tuina 개입을 수행합니다.
3. 토끼의 왼쪽 무릎 주위 근육 경직, 힘줄 매듭, 슬개골에 엄지손가락으로 회전 주무르기를 수행하며, 5N의 힘으로 5분 동안 분당 60회의 빈도로 상하 왕복 조작을 합니다.
4. 엄지 손가락을 사용하여 Yanglingquan(GB 34), Yinlingquan(SP 9), Waixiyan(EX-LE5), Neixiyan(EX-LE4), Heding(EX-LE2), Xuehai(SP 10), Liangqiu(ST 34) 및 Weizhong(BL 40)^20,21,22를 5N의 힘과 60회/분의 주파수로 누르고 각 지점에서 30초 동안 작동합니다.
5. 토끼 무릎 관절에 회전 교정법을 수행하고 그룹의 각 동물에 대해 별도로 3회 수행합니다.
   1. 한 손으로 대퇴골을 고정합니다. 다른 손을 먼저 무릎 관절 뒤에 놓고 엄지와 약지로 각각 외측 및 내측 경골 과두를 고정합니다. 검지와 중지로 오금 포사를 고정합니다. 견인력과 비틀림 힘을 가합니다.
   2. 한 손으로 대퇴골을 고정합니다. 슬개골의 내측과 측면 가장자리를 다른 손의 엄지와 새끼손가락으로 고정합니다. 검지, 중지, 약지로 슬개골 기저부를 고정합니다. 비틀림 힘을 가합니다.
   3. 견인력의 방향은 경골의 장축과 평행을 유지하고 비틀림력의 방향은 하부 Xiyan의 방향과 일치하도록 합니다. 피부와 손가락 사이의 마찰을 피하기 위해 손가락을 사용하여 피부를 제자리에 고정합니다.

5. 무릎 관절 ROM 측정

알림: 측정하기 전에 토끼를 진정시키십시오. 측정 통계학자와 측정 시스템은 서로 다릅니다.

1. 실험 시작과 주말에 각 그룹의 토끼의 왼쪽 무릎 관절의 가동성을 측정합니다.
2. 토끼 고정 상자에 토끼를 오른쪽으로 놓고 한 손으로 왼쪽 대퇴골을 고정합니다.
3. 의료용 관절경 원의 중심을 토끼의 왼쪽 무릎 관절의 측면 중심에 맞춥니다. 원의 중심을 더 큰 trochanter에 연결하는 선 확장과 평행이 되도록 고정 암을 확장합니다. 경골의 세로 축과 평행이 되도록 모바일 암을 확장합니다.
4. 다른 손은 무릎 관절에서 약 9cm 떨어진 경골의 세로 축에 놓습니다. 750°/s의 각속도 850°에서 약^3-28g 토크를 수동으로 적용합니다.
5. 토끼의 무릎 관절이 더 이상 움직이지 않을 때까지 이 작업을 수행합니다. 관절이 움직임을 멈출 때 고니오미터가 표시하는 각도를 기록합니다. 이것은 무릎 관절 ROM입니다. 읽을 때 시선이 눈금자의 표면에 수직인지 확인하십시오.
6. 각 무릎에 대한 ROM을 3x 측정하고 평균값²⁸을 취합니다.

6. Hematoxylin-eosin (HE) 염색

1. 시료 채취
   1. 개입이 끝난 지 1주일(그림 1)에 토끼를 토끼 고정 상자에 오른쪽으로 눕힙니다(토끼는 오른쪽으로 누웠을 때 편안한 상태를 유지할 가능성이 더 큽니다). 펜토바르비톤(100mg/kg)을 토끼의 귀 가장자리 정맥에 주사하여 인도적 안락사^29,30.
   2. 메스, 가위, 지혈 겸자로 왼쪽 무릎강을 빠르게 열어 대퇴골 원위 연골 주위에 붙어 있는 연조직을 제거합니다.
   3. 물고 있는 집게로 대퇴골 원위부의 약 1cm x 1cm 연골-뼈 표본을 채취하고 식염수에 넣어 세척합니다.
2. 고정 및 석회질 제거
   1. 연골을 4% 파라포름알데히드 용액에 넣고 72시간 동안 고정합니다.
   2. 흐르는 물에 12시간 동안 헹굽니다. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 석회질 제거 용액에서 6주 동안 석회질을 제거합니다. EDTA 석회질 제거 용액은 3일마다 교체합니다. 뼈 조직이 부드럽고 유연해지고, 쉽게 구부러질 수 있고, 바늘로 매끄럽게 뚫을 때 석회질 제거의 종점을 결정한다³¹.
3. 포함된 섹션의 탈수
   1. 탈수를 위해 검체를 자동 탈수기에 넣습니다.
   2. 왁스를 바르고 손질한 조직을 파라핀 왁스를 녹인 정사각형 용기 바닥에 1시간 동안 놓습니다. 식고 단단한 블록으로 굳을 때까지 냉각 오븐에 넣으십시오. 슬라이서에서 파라핀이 박힌 조직 블록을 4μm 두께로 자릅니다.
   3. 표백제 기계에서 섹션을 펼친 다음 접착 슬라이드에 놓고 번호를 매기고 슬라이스 베이킹 기계와 오븐으로 건조시킵니다.
4. 왁싱 제거 및 수분 공급
   1. 섹션을 65°C에서 60분 동안 굽습니다.
   2. 절편을 크실렌에 7분 동안 담근 다음 신선한 자일렌에 각각 2분 동안 7회 더 담그십시오.
   3. 슬라이스를 무수 에탄올에 5분 동안 담근 다음 2% 에탄올, 95% 에탄올 및 85% 에탄올에 각각 75분 동안 담그십시오.
   4. 증류수에 2분 동안 섹션을 담그십시오.
5. 헤마톡실린 염색: 20초 동안 헤마톡실린으로 절편을 염색합니다. 흐르는 물에 섹션을 헹굽니다. 염산 에탄올 분별에 섹션을 3초 동안 담그십시오. 수돗물로 5분 동안 섹션을 헹굽니다.
6. Eosin 재염색: 30초 동안 에오신으로 섹션을 염색합니다. 수돗물로 섹션을 헹굽니다.
7. 시료의 투명성을 위한 탈수
   1. 섹션을 95% 에탄올에 각각 3초 동안 두 번 넣은 다음 무수 에탄올에 3초 동안 넣습니다.
   2. 다시 무수 에탄올에 슬라이스를 1분 동안 넣은 다음 각각 2분 동안 크실렌 세척을 1회 반복합니다.
8. 슬라이스 밀봉: 슬라이스를 꺼내고 중성 껌 실러를 떨어뜨리고 커버슬립으로 덮고 냄새가 나지 않을 때까지 흄 후드에서 슬라이스를 건조시킵니다.
9. 샘플 사진 촬영: 100x에서 광학 현미경의 시야 아래에서 관찰하고 사진을 찍습니다.
10. 평가: 각 그룹³²에 대한 Mankin의 점수로 연골 조직을 평가합니다.

7. 데이터 분석

1. 분석 소프트웨어를 사용하여 실험 데이터를 통계적으로 분석합니다. 데이터에 정규 분포를 적용한 경우 t-검정을 기준으로 두 표본 그룹을 비교하고 일원 분산분석을 기준으로 여러 그룹을 비교합니다.
2. 결과를 평균 ± 표준 편차(SD)로 표현합니다. 상용 소프트웨어를 사용하여 결과를 통계 플롯으로 표현할 수 있습니다. 차이는 p < 0.05에서 통계적으로 유의했다.

결과

무릎 움직임 제한과 연골 조직 손상의 정도는 KOA의 심각성을 반영합니다. 무릎 관절의 ROM은 무릎 관절 운동의 제한 정도를 반영합니다. 무릎 관절 ROM이 작을수록 무릎 관절 운동의 제한이 더 심각합니다. 반대로 무릎 관절 ROM이 클수록 무릎 움직임의 정도가 정상입니다. 연골 조직의 형태와 구조를 관찰하기 위한 HE 염색은 연골 조직 손상 정도를 반영합니다. 연골 조직의 표면이 불규칙할수록 균?...

토론

실험 프로토콜의 설계는 KOA 치료에서 Tuina의 메커니즘을 조사하는 데 특히 중요합니다. KOA 모델링은 Waixiyan에서 papain을 주입하여 토끼에 수행되었습니다. Waixiyan은 슬개골 인대의 외측 크립트에 위치하여 찾기 쉽고, 무릎 굴곡 시 대퇴골과 경골 사이의 관절 공간이 넓어 무릎 관절강에 주입하기 쉽고 주변 조직의 손상을 방지하기 때문에 KOA 모델³⁴를 쉽게 설정할 수 있습니다. 투?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 % sodium chloride injection	Sichuan Keren Pharmaceutical Co.	Z22121903
-20°C refrigerator	Haier	BD-328WL
4 % fixative solution	Solarbio	P1110
4°C refrigerator	Haier	SC-315DS
Anhydrous ethanol	Sinopharm
Automatic tissue dewatering machine	Dakowei (Shenzhen) Medical Equipment Co.	HP30
Blast drying oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co.	DHG-9070A
Coverslip	Biyuntian	FCGF50
Electric thermostat water bath	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co.	HWS-26
Embedding freezing table	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	BM450
Embedding machine	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	BM450A
Ethylenediaminetetraacetic acid decalcification solution	Servicebio	G1105-500ML
Fluorescent inverted microscope	Leica	Leica DM IL LED
Hematoxylin-eosin staining kit	Cisco Jet	EE0012
Hydrochloric acid	Laiyang Economic and Technological Development Zone Fine Chemical Plant
Medical joint goniometer	KOSLO
Neutral gum	Cisco Jet	EE0013
Normal-grade male New Zealand rabbit	Jinan Xilingjiao Breeding and Breeding Center	SCXK (Lu) 2020 0004
Papain(3000 U/mg)	Bioss	D10366
Pathological tissue bleaching and drying instrument	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	PH60
Pet electric clippers	Codos	CP-3180
Rabbit fixing box	any brand
Rotating Slicer	Leica	531CM-Y43
Tuina technique parameter determination instrument	Shanghai DuKang Instrument Equipment Co. Ltd.	ZTC-
Ventilator	TALY ELECTRIC	C32
Xylene	Fuyu Reagent