Tuina-Intervention im Kaninchenmodell der Kniearthrose

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Tuina-Intervention in einem Kaninchenmodell der Kniearthrose.

Zusammenfassung

Die Kniearthrose (KOA) ist vor allem durch degenerative Veränderungen des Knorpels des Kniegelenks und der umliegenden Weichteile gekennzeichnet. Die Wirksamkeit von Tuina bei der Behandlung von KOA wurde bestätigt, aber der zugrunde liegende Mechanismus muss noch untersucht werden. Diese Studie zielt darauf ab, ein wissenschaftlich durchführbares KOA-Kaninchenmodell zu etablieren, das mit Tuina behandelt wurde, um die zugrundeliegenden Mechanismen aufzudecken. Zu diesem Zweck wurden 18 6 Monate alte männliche neuseeländische Kaninchen nach dem Zufallsprinzip in Schein-, Modell- und Tuina-Gruppen mit jeweils 6 Kaninchen eingeteilt. Das KOA-Modell wurde durch Injektion von 4%iger Papainlösung in die Kniegelenkshöhle etabliert. Die Tuina-Gruppe wurde 4 Wochen lang mit Tuina in Kombination mit der Kniegelenks-Rotationskorrekturmethode interveniert. Nur das Standard-Greifen und die Fixierung wurden in Schein- und Modellgruppen durchgeführt. Am Ende der 1-wöchigen Intervention wurde der Bewegungsumfang des Kniegelenks (ROM) beobachtet und eine Knorpelhämatoxylin-Eosin-Färbung (HE) durchgeführt. Die Studie zeigt, dass Tuina die Chondrozyten-Apoptose hemmen, Knorpelgewebe reparieren und das Kniegelenk-ROM wiederherstellen kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie die wissenschaftliche Durchführbarkeit der Tuina-Behandlung für KOA-Modellkaninchen demonstriert und ihre potenzielle Anwendung bei der Untersuchung von KOA und ähnlichen Kniegelenkserkrankungen hervorhebt.

Einleitung

Die Kniearthrose (KOA) ist eine degenerative Erkrankung des Kniegelenks, die sich hauptsächlich durch Knieschmerzen, Schwellungen, Verformungen und Bewegungseinschränkungen äußert, mit einer hohen Behinderungsrate und einer höheren Prävalenz bei Frauen, wobei im Jahr 2019 weltweit 527,81 Millionen Patienten mit Arthrose auftraten und ihre globale Prävalenz 60,6 % der gesamten globalen Prävalenz von OA ausmachte¹. Klinisch wird die Behandlung der KOA in der Regel in nicht-chirurgische und chirurgische Therapien unterteilt. Zu den nicht-chirurgischen Therapien gehören Physiotherapie, Pharmakotherapie und Injektionstherapie mit plättchenreichem Plasma ^2,3. Tuina ist eine gängige, sichere, zuverlässige und effektive Behandlungsmethode in der chinesischen Medizin. In dieser Studie wird Tuina in Kombination mit der Methode der Kniegelenks-Rotationskorrektur zur Behandlung von KOA eingesetzt. Tuina-Techniken wie die rotatorische Knet- und Pressmethode können das Muskelgewebe ausgleichen, Schmerzen lindern, den Entzündungsfaktorspiegel anpassen, den Gewebestoffwechsel verbessern und die Degeneration des Gelenkknorpels hemmen ^4,5. Die Methode der Kniegelenks-Rotationskorrektur kann die Ausrichtung der Knochen und Gelenke der unteren Gliedmaßen anpassen, die Kniegelenkslücke verbessern, die normale Kraftlinie wiederherstellen und die Biomechanik der unteren Gliedmaßen ausgleichen 6,7,8,9. Widerstandsübungen können Muskelmasse und Kraft verbessern und die Erneuerung des Knorpelgewebes fördern^10,11. Eine vorläufige Studie ergab, dass dieses Tuina-Protokoll bei der Behandlung von KOA signifikant wirksamer ist als orale Glucosaminsulfat-Kapseln, mit einem schnelleren Wirkungseintritt und einer signifikanten Hemmung der Chondrozytendegeneration und der Reparatur von geschädigtem Knorpelgewebe¹². Bei der Behandlung von KOA haben nichtsteroidale Antirheumatika im Vergleich zur Tuina-Therapie Nebenwirkungen und eine unbefriedigende Langzeitwirksamkeit, relativ hohe chirurgische Risiken und Kosten und erfordern bestimmte Indikationen für eine chirurgische Behandlung mit postoperativen Problemen und periprothetischen Komplikationen^13,14,15. Im Vergleich zu medikamentöser Therapie und Operation bietet die Tuina-Behandlung bei KOA mehrere Vorteile, darunter reduzierte Nebenwirkungen, geringeres Risiko, erhöhte Sicherheit, Kosteneffizienz und länger anhaltende Wirksamkeit. Darüber hinaus kann es Kniegelenkschmerzen, Schwellungen, Knacken und Bewegungseinschränkungen wirksam lindern 6,13,16,17.

Der Mechanismus von Tuina zur Behandlung von KOA muss jedoch geklärt werden, was die Verbesserung und Perfektionierung des Behandlungsprotokolls für KOA einschränkt. Daher ist die Untersuchung des Mechanismus der Tuina-Intervention bei KOA durch Tierversuche eine effektive Methode. Kaninchen haben im Vergleich zu Ratten ein sanftmütiges Temperament und größere Kniegelenke. Die anatomische Struktur und die biochemischen Indizes des Knorpels ähneln denen des Menschen, so dass es ein geeignetes Thema ist, um den Mechanismus der Kniegelenkserkrankung von Tuina¹⁸ zu untersuchen. Das KOA-Modell, das durch die Injektion von Papain in die Kniegelenkshöhle von Kaninchen etabliert wurde, hat die Vorteile einer kurzen Modellierungszeit, eines reduzierten Traumas, einer hohen Erfolgsrate, einer hohen Überlebensrate und eines ähnlichen pathologischen Mechanismus wie KOA¹⁹. Ziel dieser Studie ist es, ein wissenschaftlich durchführbares tierexperimentelles Protokoll für die Tuina-Intervention bei KOA zu etablieren und den Mechanismus von Tuina zu untersuchen.

Protokoll

Die Studie wurde von der Ethikkommission des Affiliated Hospital der Shandong University of Traditional Chinese Medicine genehmigt (Zulassungsnummer: 2020-29).

1. Versuchstiere

1. Aufzucht von 18 6 Monate alten, normal hochwertigen männlichen neuseeländischen Kaninchen (2,75 ± 0,25 kg) in Standard-Einzelkäfigen (12 h Hell-Dunkel-Zyklus, Temperatur 20-24 °C, Luftfeuchtigkeit 40%-60%).

2. Gruppierungsmethode

1. Wählen Sie 6 der 18 neuseeländischen Kaninchen als Scheingruppe mit der Zufallszahlenmethode aus und ordnen Sie die restlichen 12 Kaninchen der Modellierungsgruppe zu.
2. Nach erfolgreicher Modellierung teilen Sie die Modellierungsgruppe Kaninchen nach der Zufallszahlenmethode in die Modell- und Tuina-Gruppen auf, wobei sich in jeder Gruppe 6 Kaninchen befinden.
3. Führen Sie die Tuina-Intervention in der Tuina-Gruppe durch. Führe das gleiche Greifen und Fixieren in der Schein- und Modellgruppe ohne Tuina durch. 4 Wochen lang jeden zweiten Tag anwenden (Abbildung 1).

3. Etablierung des KOA-Modells

1. Führen Sie in Woche 1 eine adaptive Fütterung an Kaninchen im Standardzustand durch. Ad libitum Zugang zu Wasser und Nahrung. Legen Sie Kaninchen auf die rechte Seite in die Kaninchenfixierboxen, um sie 15 Minuten am Tag zu beruhigen. Befestigen Sie ihre Köpfe auf den Kopfbefestigungsplatten. Befestigen Sie die Befestigungsplatten und Schrauben so, dass sich die Kaninchen nicht bewegen können. Tragen Sie Schutzhandschuhe, wenn Sie die Kaninchen greifen und fixieren (Abbildung 1).
2. Legen Sie an den Tagen 1, 4 und 7 von Woche 2 alle 18 Kaninchen auf der rechten Seite in die Kaninchen-Fixierboxen (Abbildung 1). Führen Sie die unten genannten Vorgänge aus.
3. Injizieren Sie 3% Pentobarbital-Natrium (1 ml/kg) in die marginale Ohrvene des Kaninchens. Rasieren Sie das linke Kniegelenk des Kaninchens mit einem Tierrasierer, so dass keine Haare auf der freiliegenden Haut zu sehen sind.
4. Desinfizieren Sie das linke Kniegelenk des Kaninchens von innen nach außen mit medizinischem Jodophor und 75%igem Alkohol (Abbildung 2A).
5. Beugen Sie das linke Kniegelenk des Kaninchens um 60°. Führen Sie eine Nadel (22G, 0,7 mm x 30 mm) von Waixiyan ein. Injizieren Sie 4%ige Papainlösung (0,1 ml/kg, durchschnittlich 0,275 ml für ein 2,5 kg schweres Tier) in die Kniegelenkshöhle der Modellierungsgruppe. Injizieren Sie eine gleiche Menge 0,9%iger Natriumchloridlösung in die Scheingruppe. Diese Injektionsdosis wird vom Tier gut vertragen, ohne Anzeichen von Schmerzen oder Leiden zu verursachen (Abbildung 2B).
   HINWEIS: Waixiyan (EX-LE5) befindet sich in der seitlichen Aussparung des Patellabandes und Neixiyan (EX-LE4) befindet sich in der medialen Aussparung des Patellabandes^20,21,22.
6. Drücken Sie 2 Minuten lang auf die Lochblende, um ein Verschütten der Lösung zu vermeiden.
7. Lege deine Hände über und unter das linke Kniegelenk des Kaninchens. Beugen Sie das Kniegelenk des Kaninchens sanft und passiv und strecken Sie es 10-mal innerhalb des physiologischen Bewegungsbereichs (ROM), um die Lösung gleichmäßig in die Kniegelenkshöhle zu infiltrieren¹⁵. Beobachten Sie das Kaninchen für die Dauer der Modellierung alle 8 Stunden. Verabreichen Sie Buprenorphin SR (0,18 mg/kg), wenn die Kaninchen Anzeichen von Versteck, Zittern der Gliedmaßen, flacher und schneller Atmung oder sogar Beißen und Kratzen zeigen.
8. In Woche 7 ist das linke Knie des Kaninchens in gebeugter Position geschwollen, mit erhöhtem Muskeltonus um das Knie mit Knötchen und Striae, erhöhter lokaler schmerzhafter Reizreaktion, vermindertem Knie-ROM, lahmem Gang und Verlagerung des Schwerpunkts auf die gesunde Seite. Dies bestimmt den Erfolg des KOA-Modells (Abbildung 1, Abbildung 2C)^23,24.

4. Tuina-Manipulation

1. Führen Sie vor der Manipulation von Tuina ein Training mit dem Instrument zur Bestimmung der Parameter der Tuina-Technik durch. Trainieren Sie 1 Monat lang 1 Stunde pro Tag mit demselben Fachmann.
   1. Führen Sie die rotatorische Knet- und Pressmethode mit dem Daumen auf der Tuina-Manipulationssimulationsplattform mit einer Kraft von 5 N und einer Frequenz von 60 Mal/min durch (Abbildung 3A,C).
   2. Analysieren Sie die Kraft in drei Richtungen der X-, Y- und Z-Achse mit der Tuina-Software zur Verarbeitung von Manipulationsparametern und überprüfen Sie die Größe, Frequenz und Aktionszeit der Kraft, die auf dem Bildschirm angezeigt werden (Abbildung 3B, D).
   3. Bewerten Sie die mechanischen Parameter der Tuina-Manipulation und standardisieren Sie die Tuina-Manipulation mit der Software während des Trainings. Halten Sie die standardisierte rotatorische Knet- und Pressmethode mit dem Daumen mit einer Kraft von 5 N, einer Frequenz von 60 mal/min und einer kontinuierlichen Betriebszeit von 10 min bei. Siehe die standardisierte quantitative Wellenform der Manipulation in Abbildung 3B, D²⁵, ^{26, 27}.
2. Legen Sie das Kaninchen auf der rechten Seite in die Kaninchen-Fixierbox. Streicheln Sie das Kaninchen 10 Sekunden lang sanft, um das Kaninchen zu beruhigen und zu entspannen²¹. Führen Sie dann die Tuina-Intervention durch.
3. Führen Sie die rotatorische Knetmethode mit dem Daumen auf die linken Kniegelenkmuskeln, Sehnenknoten und Patellamuskeln des Kaninchens durch, mit Auf- und Ab-Round-Trip-Manipulation mit einer Kraft von 5 N und einer Frequenz von 60 Mal/min für 5 Minuten.
4. Drücken Sie mit dem Daumenende Yanglingquan (GB 34), Yinlingquan (SP 9), Waixiyan (EX-LE5), Neixiyan (EX-LE4), Heding (EX-LE2), Xuehai (SP 10), Liangqiu (ST 34) und Weizhong (BL 40)^20,21,22 mit einer Kraft von 5 N und einer Frequenz von 60 Mal/min und betätigen Sie jeden Punkt ³⁰ s lang.
5. Führen Sie die rotierende Korrekturmethode am Kaninchenkniegelenk durch und führen Sie dies 3x separat für jedes Tier in der Gruppe durch.
   1. Fixieren Sie den Oberschenkelknochen mit einer Hand. Legen Sie die andere Hand zuerst hinter das Kniegelenk und fixieren Sie dann die lateralen und medialen Tibiakondylen mit Daumen bzw. Ringfinger. Fixieren Sie die Kniekehle mit dem Zeige- und Mittelfinger. Üben Sie Zug- und Drehkraft aus.
   2. Fixieren Sie den Oberschenkelknochen mit einer Hand. Fixieren Sie die medialen und lateralen Ränder der Kniescheibe mit dem Daumen und den kleinen Fingern der anderen Hand. Fixieren Sie die Patellabasis mit dem Zeige-, Mittel- und Ringfinger. Wenden Sie eine Verdrehkraft an.
   3. Halten Sie die Richtung der Zugkraft parallel zur Längsachse des Schienbeins und die Richtung der Torsionskraft in einer Linie mit der Richtung des unteren Xiyan. Verwenden Sie die Finger, um die Haut an Ort und Stelle zu halten, um Reibung zwischen der Haut und den Fingern zu vermeiden.

5. Vermessung des Kniegelenks-ROM

HINWEIS: Beruhigen Sie das Kaninchen vor der Messung. Der Messstatistiker und der Messtechniker unterscheiden sich voneinander.

1. Messen Sie die Beweglichkeit des linken Kniegelenks von Kaninchen jeder Gruppe zu Beginn des Experiments und am Ende jeder Woche.
2. Positionieren Sie das Kaninchen auf der rechten Seite in der Kaninchenfixierbox und fixieren Sie den linken Oberschenkelknochen mit einer Hand.
3. Richten Sie die Mitte des Kreises des medizinischen Arthroskops an der lateralen Mitte des linken Kniegelenks des Kaninchens aus. Verlängern Sie den Fixationsarm so, dass er parallel zur Linienverlängerung verläuft, die die Mitte des Kreises mit dem Trochanter major verbindet. Strecken Sie den beweglichen Arm so aus, dass er parallel zur Längsachse des Schienbeins verläuft.
4. Legen Sie die andere Hand auf die Längsachse des Schienbeins, ca. 9 cm vom Kniegelenk entfernt. Manuell ca. 750-850 g Drehmoment bei einer Winkelgeschwindigkeit von 3°/s^{aufbringen 28}.
5. Führen Sie dies so lange durch, bis sich das Kniegelenk des Kaninchens nicht mehr bewegt. Notieren Sie die Anzahl der Grad, die das Goniometer anzeigt, wenn sich das Gelenk nicht mehr bewegt. das ist das Kniegelenk ROM. Achten Sie beim Lesen darauf, dass die Sichtlinie senkrecht zur Oberfläche des Lineals verläuft.
6. Messen Sie das ROM für jedes Knie 3x und nehmen Sie den Durchschnittswert²⁸.

6. Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung

1. Musterkollektion
   1. 1 Woche nach dem Ende des Eingriffs (Abbildung 1) legen Sie das Kaninchen auf die rechte Seite in die Kaninchenfixierungsbox (Kaninchen bleiben eher entspannt, wenn sie auf der rechten Seite liegen). Injektion von Pentobarbiton (100 mg/kg) in die Randvene des Kaninchenohrs zur humanen Euthanasie^29,30.
   2. Öffnen Sie die linke Kniehöhle schnell mit einem Skalpell, einer Schere und einer hämostatischen Pinzette, um das Weichgewebe zu entfernen, das um den Knorpel des distalen Oberschenkelknochens herum befestigt ist.
   3. Eine ca. 1 cm x 1 cm große Knorpelknochenprobe des distalen Oberschenkelknochens wird mit einer Beißzange entnommen und zur Reinigung in Kochsalzlösung gelegt.
2. Fixierung und Entkalkung
   1. Legen Sie den Knorpel in 4%ige Paraformaldehydlösung und fixieren Sie ihn 72 h lang.
   2. 12 h unter fließendem Wasser abspülen. 6 Wochen in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Entkalkungslösung entkalken. Wechseln Sie die EDTA-Entkalkungslösung alle 3 Tage. Bestimmen Sie den Endpunkt der Entkalkung, wenn das Knochengewebe weich und flexibel wird, leicht gebogen und mit einer Nadel³¹ glatt durchstochen werden kann.
3. Austrocknung von eingebetteten Abschnitten
   1. Legen Sie die Probe zur Dehydrierung in einen automatischen Dörrautomaten.
   2. Legen Sie das gewachste und beschnittene Gewebe 1 h lang auf den Boden eines quadratischen Behälters mit gelöstem Paraffinwachs. Lege sie in einen Kühlofen, bis sie abgekühlt und zu harten Blöcken erstarrt sind. Schneiden Sie den in Paraffin eingebetteten Gewebeblock in einem Slicer auf eine Dicke von 4 μm.
   3. Falten Sie die Abschnitte in der Bleichmaschine auseinander, legen Sie sie dann auf selbstklebende Objektträger, nummerieren Sie sie und trocknen Sie sie mit einer Scheibenbackmaschine und einem Ofen.
4. Entwachsung und Hydratation
   1. Die Stücke bei 65 °C 60 min backen.
   2. Die Abschnitte 7 Minuten lang in Xylol einweichen, gefolgt von 2 weiteren Runden in frischem Xylol für jeweils 7 Minuten.
   3. Die Scheibe 5 Minuten lang in wasserfreiem Ethanol einweichen, gefolgt von jeweils 2 Minuten in 95 % Ethanol, 85 % Ethanol und 75 % Ethanol.
   4. Die Abschnitte 2 Minuten lang in destilliertem Wasser einweichen.
5. Hämatoxylin-Färbung: Färbeschnitte mit Hämatoxylin für 20 s. Spülen Sie die Abschnitte unter fließendem Wasser ab. Abschnitte in Salzsäure-Ethanol-Fraktionierung für 3 s einweichen. Spülen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang in Leitungswasser ab.
6. Eosin-Refärbung: Färben Sie Schnitte 30 s lang mit Eosin. Spülen Sie die Abschnitte mit Leitungswasser ab.
7. Dehydrierung für Transparenz der Probe
   1. Die Abschnitte werden zweimal für jeweils 3 s in 95%iges Ethanol eingelegt, gefolgt von einem 3 s langen Einlegen in wasserfreies Ethanol.
   2. Legen Sie die Scheiben erneut für 1 Minute in wasserfreies Ethanol, gefolgt von 2 Runden Xylolwäsche für jeweils 1 Minute.
8. Versiegelung der Scheiben: Nehmen Sie die Scheiben heraus, lassen Sie neutrale Gummiversiegelung fallen, decken Sie sie mit einem Deckglas ab und lassen Sie die Scheiben in einem Abzug trocknen, bis sie geruchlos sind.
9. Fotografieren der Probe: Beobachten und fotografieren Sie unter dem Sichtfeld eines Lichtmikroskops bei 100x.
10. Bewertung: Bewerten Sie das Knorpelgewebe anhand des Mankin-Scores für jede Gruppe³².

7. Datenanalyse

1. Analysieren Sie die experimentellen Daten statistisch mit Hilfe einer Analysesoftware. Wenn die Daten einer Normalverteilung unterzogen wurden, vergleichen Sie zwei Gruppen von Stichproben mit dem t-Test und mehrere Gruppen mit einer unidirektionalen ANOVA.
2. Drücken Sie die Ergebnisse als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus. Darstellen Sie die Ergebnisse als statistische Diagramme mit kommerzieller Software. Die Unterschiede waren bei p < 0,05 statistisch signifikant.

Ergebnisse

Der Grad der eingeschränkten Beweglichkeit des Knies und der Schädigung des Knorpelgewebes spiegelt den Schweregrad der KOA wider. Das ROM des Kniegelenks spiegelt den Grad der Einschränkung der Kniegelenksbewegung wider. Je kleiner das Kniegelenks-ROM ist, desto gravierender ist die Einschränkung der Kniegelenksbewegung. Im Gegenteil, je größer das Kniegelenks-ROM ist, desto normaler ist der Grad der Kniebewegung. Die HE-Färbung zur Beobachtung der Morphologie und Struktur des Knorpelgewebes spiegelt den Grad der...

Diskussion

Das Design des experimentellen Protokolls ist besonders wichtig, um den Mechanismus von Tuina bei der Behandlung von KOA zu untersuchen. Die KOA-Modellierung wurde an Kaninchen durch Injektion von Papain in Waixiyan durchgeführt. Waixiyan befindet sich in der lateralen Krypta des Patellabandes, die leicht zu lokalisieren ist, und der Gelenkspalt zwischen Oberschenkelknochen und Schienbein ist hier während der Kniebeugung groß, was die Injektion in die Kniegelenkshöhle erleichtert und eine Schädigung des umliegenden ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 % sodium chloride injection	Sichuan Keren Pharmaceutical Co.	Z22121903
-20°C refrigerator	Haier	BD-328WL
4 % fixative solution	Solarbio	P1110
4°C refrigerator	Haier	SC-315DS
Anhydrous ethanol	Sinopharm
Automatic tissue dewatering machine	Dakowei (Shenzhen) Medical Equipment Co.	HP30
Blast drying oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co.	DHG-9070A
Coverslip	Biyuntian	FCGF50
Electric thermostat water bath	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co.	HWS-26
Embedding freezing table	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	BM450
Embedding machine	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	BM450A
Ethylenediaminetetraacetic acid decalcification solution	Servicebio	G1105-500ML
Fluorescent inverted microscope	Leica	Leica DM IL LED
Hematoxylin-eosin staining kit	Cisco Jet	EE0012
Hydrochloric acid	Laiyang Economic and Technological Development Zone Fine Chemical Plant
Medical joint goniometer	KOSLO
Neutral gum	Cisco Jet	EE0013
Normal-grade male New Zealand rabbit	Jinan Xilingjiao Breeding and Breeding Center	SCXK (Lu) 2020 0004
Papain(3000 U/mg)	Bioss	D10366
Pathological tissue bleaching and drying instrument	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	PH60
Pet electric clippers	Codos	CP-3180
Rabbit fixing box	any brand
Rotating Slicer	Leica	531CM-Y43
Tuina technique parameter determination instrument	Shanghai DuKang Instrument Equipment Co. Ltd.	ZTC-
Ventilator	TALY ELECTRIC	C32
Xylene	Fuyu Reagent