変形性膝関節症のウサギモデルにおける推拿介入

要約

プロトコルは膝の変形性関節症のウサギ モデルにおけるTuinaの介在のための方法を記述する。

要約

変形性膝関節症(KOA)は、主に膝関節の軟骨と周囲の軟部組織の変性変化を特徴としています。KOAの治療における推拿の有効性が確認されていますが、根本的なメカニズムを調査する必要があります。本研究は、科学的に実現可能なKOAウサギモデルを確立し、そのメカニズムを明らかにすることを目的としています。このために、生後6か月の正常グレードのオスのニュージーランドウサギ18匹を偽ウサギ、モデルウサギ、およびトゥイナグループにランダムに分け、各グループに6匹のウサギを配置しました。KOAモデルは、膝関節腔内に4%パパイン溶液を注入することによって確立されました。推拿群は、膝関節回転矯正法と組み合わせた推拿を4週間介入した。標準的な把持と固定のみが、偽群およびモデル群で実施されました。1週間の介入の終わりに、膝関節の可動域(ROM)が観察され、軟骨ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色が行われました。この研究は、Tuinaが軟骨細胞のアポトーシスを阻害し、軟骨組織を修復し、膝関節ROMを回復させる可能性があることを示しています。結論として、この研究は、KOAモデルウサギに対する推拿治療の科学的実現可能性を実証し、KOAおよび同様の膝関節関連疾患の研究におけるその潜在的な応用を強調しています。

概要

変形性膝関節症(KOA)は、膝関節の変性疾患であり、主に膝の痛み、腫れ、変形、動きの制限によって現れ、障害率が高く、女性で有病率が高く、2019年には世界で5億2,781万人の変形性関節症患者がおり、その世界的な有病率はOAの世界の総有病率の60.6%を占めています¹.臨床的には、KOAの治療は通常、非外科的治療と外科的治療に分けられます。非外科的療法には、理学療法、薬物療法、多血小板血漿注射療法などがあります^2,3。推拿は、漢方薬における一般的で、安全で、信頼性が高く、効果的な治療法です。この研究では、膝関節回転矯正法と組み合わせた Tuina を使用して KOA を治療します。回転混練や圧搾法などの推拗技術は、筋肉組織のバランスを取り、痛みを軽減し、炎症因子レベルを調整し、組織の代謝を改善し、関節軟骨の変性を抑制することができます^4,5。膝関節回転矯正法は、下肢の骨と関節のアライメントを調整し、膝関節のギャップを改善し、正常な力線を回復し、下肢のバイオメカニクスのバランスをとることができます6,7,8,9。レジスタンスエクササイズは、筋肉量と筋力を高め、軟骨組織の再生を促進することができます^10,11。予備調査はこのTuinaのプロトコルが損傷した軟骨組織の軟骨細胞の変性そして修理の行為のより速い開始そして重要な阻止のKOAの処置の口頭グルコサミンの硫酸塩のカプセルよりかなり有効であることが分った¹²。KOAの治療では、推拿療法と比較して、非ステロイド性抗炎症薬は副作用と不十分な長期的有効性、比較的高い外科的リスクとコスト、および術後の問題と人工周囲合併症を伴う外科的治療のための特定の適応を必要とします^13,14,15.薬物療法や手術と比較した場合、KOAの推拿治療には、副作用の軽減、リスクの低減、安全性の向上、費用対効果、効果の長期化など、いくつかの利点があります。さらに、膝関節の痛み、腫れ、飛び出し、動きの制限を効果的に緩和できます6,13,16,17。

しかし、KOAの治療のための推拿のメカニズムを明らかにする必要があり、KOAの治療プロトコルの改善と完成を制限します。そのため、KOAにおける推拿介入のメカニズムを動物実験で調べることは有効な方法である。ウサギは、ラットと比較して、従順な気質と大きな膝関節を持っています。解剖学的構造と軟骨の生化学的指標は人間のものと似ているため、Tuina¹⁸による膝関節疾患のメカニズムを研究するのに適した主題です。ウサギの膝関節腔にパパインを注射して確立したKOAモデルは、モデリング時間が短く、外傷が少なく、成功率が高く、生存率が高く、^KOA19と同様の病理学的メカニズムという利点があります。本研究は、KOAにおける推拗化のための科学的に実現可能な動物実験プロトコルを確立し、推拿のメカニズムを調査することを目的としています。

プロトコル

この研究は、山東中医薬大学付属病院の倫理委員会によって承認されました(承認番号:2020-29)。

1. 実験動物

1. 生後6ヶ月の通常グレードのオスのニュージーランドウサギ18匹(2.7±5〜0.25kg)を標準的なシングルケージ(明暗サイクル12時間、温度20〜24°C、湿度40%〜60%)で飼育します。

2. グルーピング方法

1. 乱数法を使用して、18匹のニュージーランドウサギから6匹を偽グループとして選択し、残りの12匹のウサギをモデリンググループに割り当てます。
2. モデリングが成功したら、モデリンググループウサギを乱数法に従ってモデルグループと推拿グループに分割し、各グループに6匹のウサギを配置します。
3. 推拿群で推拿介入を行う。推拿を使わずに、偽グループとモデルグループで同じ把持と固定を行います。4週間、1日おきに操作します(図1)。

3. KOAモデルの確立

1. 1週目に標準状態でウサギに適応給餌を行います。水と食料への自由アクセス。ウサギの固定ボックスにウサギを右側に置いて、1日15分間落ち着かせます。ヘッド固定プレートに頭を固定します。ウサギが動かないように固定プレートとネジを固定します。ウサギをつかんで固定するときは、保護手袋を着用してください(図1)。
2. 2週目の1日目、4日目、7日目に、18匹のウサギすべてをウサギの固定ボックスの右側に置きます(図1)。以下の操作を実行します。
3. 3%ペントバルビタールナトリウム(1 ml / kg)をウサギの辺縁耳静脈に注射します。.ウサギの左膝関節を動物のシェーバーで剃り、露出した皮膚に毛が生えないようにします。
4. ウサギの左膝関節を、医療用ヨードフォアと75%アルコールを使用して内側から外側に消毒します(図2A)。
5. ウサギの左膝関節を60°に曲げます。Waixiyanの針(22G、0.7mm x 30mm)を挿入します。4%パパイン溶液(0.1 mL / kg、2.5 kgの動物で平均0.275 mL)をモデリンググループの膝関節腔に注入します。等量の0.9%塩化ナトリウム溶液を偽基に注入する。この注射用量は、痛みや苦痛の証拠を引き起こすことなく、動物によって十分に忍容されます(図2B)。
   注:Waixiyan(EX-LE5)は膝蓋靭帯の外側くぼみにあり、Neixiyan(EX-LE4)は膝蓋靭帯の内側くぼみにあります^20,21,22。
6. 溶液がこぼれないように、ピンホールを2分間押します。
7. ウサギの左膝関節の上下に手を置きます。ウサギの膝関節を穏やかかつ受動的に曲げ、生理学的可動域(ROM)内で10倍伸ばして、溶液を膝関節腔に均等に浸透させます¹⁵。モデリングの間、8時間ごとにウサギを観察します。ウサギが隠れたり、手足が震えたり、浅くて速い呼吸をしたり、噛んだり引っ掻いたりする兆候が見られる場合は、ブプレノルフィンSR(0.18 mg / kg)を投与します。.
8. 7週目に、ウサギの左膝が腫れ、膝の周りの筋肉の緊張が増加し、結節と線条があり、局所的な痛みを伴う刺激反応が増加し、膝ROMが減少し、足が不自由になり、重心が健康な側に移動するのを観察します。これは、KOAモデルの成功を決定します(図1、図2C)^23,24。

4.推拿操作

1. 推拿操作の前に、推拿技術パラメータ決定装置を使用してトレーニングを実行します。同じ専門家による1日1時間のトレーニングを1ヶ月間行います。
   1. Tuinaマニピュレーションシミュレーションプラットフォーム上で、親指で5Nの力と60回/分の頻度で回転混練およびプレス法を実行します(図3A、C)。
   2. Puina操作パラメータ処理ソフトウェアでX、Y、Z軸の3方向の力を解析し、画面に表示される力の大きさ、周波数、作用時間を確認します(図3B、D)。
   3. 学習中に Tuina 操作の機械的パラメーターを評価し、ソフトウェアを使用して Tuina 操作を標準化します。親指で5Nの力、60回/分の頻度、10分の連続運転時間で標準化された回転混練および加圧方法を維持します。図3B、D^25、26、27の操作の標準化された定量的波形を参照してください。
2. ウサギ固定ボックスの右側にウサギを置きます。ウサギを10秒間優しく撫でて、ウサギ²¹を落ち着かせてリラックスさせます。次に、推拿介入を実行します。
3. ウサギの左膝周囲の筋肉のこわばり、腱の結び目、膝蓋骨に親指を当てて、5Nの力と60回/分の頻度で上下の往復操作を5分間行う回転揉み込み法を行う。
4. 親指の端を使用して、Yanglingquan(GB 34)、Yinlingquan(SP 9)、Waixiyan(EX-LE5)、Neixiyan(EX-LE4)、Heding(EX-LE2)、Xuehai(SP 10)、Liangqiu(ST 34)、およびWeizhong (BL 40)^20,21,22を5Nの力と60回/分の頻度で押し、各ポイントで³⁰秒間操作します。
5. ウサギの膝関節に回転矯正法を実行し、グループ内の動物ごとにこれを3回個別に実行します。
   1. 片手で大腿骨を固定します。まずもう片方の手を膝関節の後ろに置き、次に親指と薬指で外側脛骨顆と内側脛骨顆をそれぞれ固定します。人差し指と中指で膝窩を固定します。牽引力とねじれ力を加えます。
   2. 片手で大腿骨を固定します。膝蓋骨の内側と外側の端をもう一方の手の親指と小指で固定します。膝蓋骨の基部を人差し指、中指、薬指で固定します。ねじれ力を加えます。
   3. 牽引力の方向を脛骨の長軸と平行に保ち、ねじり力の方向を下西燕の方向と一直線に保ちます。皮膚と指の間の摩擦を避けるために、指を使って皮膚を所定の位置に保持します。

5.膝関節ROMの測定

注意: 測定する前に、ウサギを落ち着かせてください。測定統計家と測定者は互いに異なります。

1. 各グループのウサギの左膝関節の可動性を実験の開始時と各週の終わりに測定します。
2. ウサギ固定ボックスの右側にウサギを置き、片手で左大腿骨を固定します。
3. 医療用関節鏡の円の中心をウサギの左膝関節の外側の中心に合わせます。円の中心と大転子をつなぐ線の延長と平行になるように固定アームを伸ばします。脛骨の縦軸と平行になるように可動アームを伸ばします。
4. もう一方の手を脛骨の縦軸、膝関節から約9cmの位置に置きます。750°/ sの角速度で約850〜^28gのトルクを手動で適用します。
5. ウサギの膝関節が動かなくなるまでこれを行います。関節の動きが止まったときにゴニオメーターが表示する度数を記録します。これが膝関節ROMです。読むときは、視線が定規の表面に対して垂直であることを確認してください。
6. 各膝のROMを3回測定し、平均値²⁸を取ります。

6. ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色

1. サンプル収集
   1. 介入終了から1週間後(図1)、ウサギをウサギ固定ボックスに右側に置きます(ウサギは右側に横たわっているときにリラックスしたままである可能性が高くなります)。人道的な安楽死のためにウサギの耳辺縁静脈にペントバルビトン(100 mg / kg)を注射します^29,30。
   2. メス、ハサミ、止血鉗子で左膝腔をすばやく開き、大腿骨遠位部の軟骨の周りに付着している軟部組織を取り除きます。
   3. 大腿骨遠位部の約1 cm x 1 cmの軟骨-骨標本を噛み鉗子で採取し、生理食塩水に入れて洗浄します。
2. 固定と脱灰
   1. 軟骨を4%パラホルムアルデヒド溶液に入れ、72時間固定します。
   2. 流水で12時間すすいでください。エチレンジアミン四酢酸(EDTA)脱灰液で6週間脱灰します。EDTA脱灰液は3日ごとに交換してください。骨組織が柔らかく柔軟になり、容易に曲げることができ、針³¹で滑らかに刺すことができるようになったときに脱灰の終点を決定する。
3. 埋め込み切片の脱水
   1. 検体を自動脱水機に入れて脱水します。
   2. ワックスを塗ってトリミングしたティッシュを、パラフィンワックスを溶かした正方形の容器の底に1時間置きます。冷えて固いブロックに固まるまで、冷却オーブンに入れます。パラフィン包埋組織ブロックをスライサーで4μmの厚さにスライスします。
   3. 漂白剤機で切片を広げ、粘着スライドの上に置き、番号を付け、スライスベーキングマシンとオーブンで乾燥させます。
4. 脱ワックスと水分補給
   1. 切片を65°Cで60分間焼きます。
   2. 切片をキシレンに7分間浸し、続いてさらに2回、新鮮なキシレンにそれぞれ7分間浸します。
   3. スライスを無水エタノールに5分間浸し、続いて95%エタノール、85%エタノール、75%エタノールにそれぞれ2分間浸します。
   4. 切片を蒸留水に2分間浸します。
5. ヘマトキシリン染色:切片をヘマトキシリンで20秒間染色します。切片を流水ですすいでください。切片を塩酸エタノール分画に3秒間浸します。切片を水道水で5分間すすぎます。
6. エオシン再染色:切片をエオシンで30秒間染色します。水道水で切片をすすぎます。
7. サンプルの透明性のための脱水
   1. 切片を95%エタノールにそれぞれ3秒間2回入れ、続いて無水エタノールに3秒間入れます。
   2. 再び、スライスを無水エタノールに1分間入れ、続いてキシレンをそれぞれ1分間2回洗浄します。
8. スライスの密封:スライスを取り出し、中性ガムシーラーを落とし、カバーガラスで覆い、無臭になるまでドラフトでスライスを乾燥させます。
9. サンプルの撮影:光学顕微鏡の視野で100倍で観察し、写真を撮ります。
10. 評価: 軟骨組織を各グループ³² のマンキン スコアで評価します。

7. データ分析

1. 解析ソフトを用いて実験データを統計的に解析します。データを正規分布の対象とした場合、標本の 2 つのグループを t 検定で比較し、複数のグループを一元配置分散分析で比較します。
2. 結果を平均±標準偏差 (SD) として表します。市販のソフトウェアを使用して結果を統計プロットとして表現します。差は p <0.05で統計的に有意であった。

結果

膝の動きの制限と軟骨組織の損傷の程度は、KOAの重症度を反映しています。膝関節のROMは、膝関節の動きの制限の程度を反映しています。膝関節ROMが小さいほど、膝関節の動きの制限はより深刻になります。逆に、膝関節ROMが大きいほど、膝の動きの程度はより正常になります。軟骨組織の形態と構造を観察するためのHE染色は、軟骨組織の損傷の程度を反映しています。軟骨組織の表面が?...

ディスカッション

実験プロトコルの設計は、KOAの治療における推拿のメカニズムを調査するために特に重要です。KOAモデリングは、ワイシヤンでパパイン注射によりウサギで行われました。ワイシヤンは膝蓋靭帯の外側陰窩に位置しており、見つけやすく、膝屈曲時の大腿骨と脛骨の間の関節空間が大きいため、膝関節腔への注入が容易で、周囲の組織への損傷を防ぐことができるため、KOAモデル

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9 % sodium chloride injection	Sichuan Keren Pharmaceutical Co.	Z22121903
-20°C refrigerator	Haier	BD-328WL
4 % fixative solution	Solarbio	P1110
4°C refrigerator	Haier	SC-315DS
Anhydrous ethanol	Sinopharm
Automatic tissue dewatering machine	Dakowei (Shenzhen) Medical Equipment Co.	HP30
Blast drying oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co.	DHG-9070A
Coverslip	Biyuntian	FCGF50
Electric thermostat water bath	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co.	HWS-26
Embedding freezing table	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	BM450
Embedding machine	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	BM450A
Ethylenediaminetetraacetic acid decalcification solution	Servicebio	G1105-500ML
Fluorescent inverted microscope	Leica	Leica DM IL LED
Hematoxylin-eosin staining kit	Cisco Jet	EE0012
Hydrochloric acid	Laiyang Economic and Technological Development Zone Fine Chemical Plant
Medical joint goniometer	KOSLO
Neutral gum	Cisco Jet	EE0013
Normal-grade male New Zealand rabbit	Jinan Xilingjiao Breeding and Breeding Center	SCXK (Lu) 2020 0004
Papain(3000 U/mg)	Bioss	D10366
Pathological tissue bleaching and drying instrument	Changzhou Paishijie Medical Equipment Co.	PH60
Pet electric clippers	Codos	CP-3180
Rabbit fixing box	any brand
Rotating Slicer	Leica	531CM-Y43
Tuina technique parameter determination instrument	Shanghai DuKang Instrument Equipment Co. Ltd.	ZTC-
Ventilator	TALY ELECTRIC	C32
Xylene	Fuyu Reagent