Intervención de Tuina en el modelo de artrosis de rodilla inducido por inyección de monoyodoacetato de sodio

Resumen

Este protocolo describe los métodos de intervención de Tuina en un modelo de artrosis de rodilla (KOA) inducido por inyección de monoyodoacetato de sodio, que proporciona una referencia para la aplicación de Tuina en modelos animales de KOA. Este protocolo también estudia el mecanismo efectivo de Tuina para el KOA, y los resultados ayudarán a promover su aplicación.

Resumen

La osteoartritis de rodilla (KOA), un trastorno articular degenerativo común, se caracteriza por dolor crónico y discapacidad, que puede progresar a un daño estructural irreparable de la articulación. Las investigaciones sobre la relación entre el cartílago articular, los músculos, la membrana sinovial y otros tejidos que rodean la articulación de la rodilla en la KOA son de gran importancia. Actualmente, el manejo de la KOA incluye modificaciones en el estilo de vida, ejercicio, medicamentos e intervenciones quirúrgicas; sin embargo, aún falta la elucidación de los intrincados mecanismos que subyacen al dolor relacionado con el KOA. En consecuencia, el dolor con KOA sigue siendo un desafío clínico clave y una prioridad terapéutica. Se ha descubierto que Tuina tiene un efecto regulador sobre los sistemas motor, inmunológico y endocrino, lo que lleva a la exploración de si Tuina podría aliviar los síntomas de KOA, causados por la regulación positiva de los factores inflamatorios y, además, si los factores inflamatorios en el músculo esquelético pueden aumentar la progresión de KOA.

Se aleatorizaron 32 ratas macho Sprague Dawley (SD) (180-220 g) en cuatro grupos de ocho animales cada uno: antiPD-L1+Tuina (grupo A), modelo (grupo B), Tuina (grupo C) y cirugía simulada (grupo D). Para los grupos A, B y C, se inyectaron 25 μL de solución de monoyodoacetato de sodio (MIA) (4 mg de MIA diluidos en 25 μL de solución salina estéril) en la cavidad articular de la rodilla derecha, y para el grupo D, se inyectó la misma cantidad de solución salina fisiológica estéril. Todos los grupos se evaluaron utilizando las pruebas de menor a mayor estrés (umbral de retirada mecánica de la pata, latencia térmica de la retirada de la pata, hinchazón de la articulación de la rodilla derecha, puntuación de Lequesne MG, temperatura de la piel) antes de la inyección y 2, 9 y 16 días después de la inyección.

Introducción

La osteoartritis de rodilla (KOA) es una osteoartritis degenerativa común, caracterizada por dolor crónico y discapacidad, y la KOA relativamente grave provocará daños estructurales irreversibles en^{la articulación}. La alta prevalencia mundial de KOA se ha convertido en un importante desafío de salud pública mundial ^2,3, que perjudica gravemente la calidad de vida de los pacientes ^4,5. Los estudios han demostrado que el KOA afecta a más de 260 millones de personas en todo el mundo⁶. Con el envejecimiento de la población, la tasa de prevalencia total de KOA en China es tan alta como 17,0% a partir de los 40 años, lo que supone una pesada carga para las familias de los afectados ^7,8.

Según la medicina china, el KOA pertenece a la categoría de "parálisis"⁹, y el Clásico de Medicina Interna del Emperador Amarillo asocia tendones, huesos y carne con parálisis. Por lo tanto, debemos prestar atención a la conexión entre el cartílago, el músculo, la membrana sinovial y otros tejidos alrededor de la articulación de la rodilla en KOA. En la medicina moderna, tanto la inflamación muscular como la ósea, que son componentes importantes de la homeostasis inmunitaria de la artritis, impulsan la progresión del dolor por KOA. Sin embargo, la mayoría de los estudios se centran en la inflamación del cartílago y la inflamación sinovial en las articulaciones óseas, y hay una escasez de artículos que examinen los fenómenos inflamatorios en los músculos esqueléticos. Por lo tanto, se necesita más investigación sobre el papel del músculo esquelético en la inflamación para obtener una comprensión más completa de la KOA y proporcionar ideas para modalidades de tratamiento más efectivas. En una revisión de la literatura, encontramos que la inhibición del ligando 1 de muerte programada del factor inmunorelacionado (PD-L1) exacerbó la progresión de KOA^10,11 y que hubo expresión diferencial de IL-15 y FOXO1 en el músculo esquelético de pacientes con KOA ^12, así como una inflamación significativa del músculo esquelético en pacientes con KOA en etapa terminal. que también se asoció con cambios en la marcha. Se ha demostrado que el músculo esquelético también puede secretar factores estrechamente relacionados con la inmunidad inflamatoria como la IL-6, y que el TNF-α también está estrechamente relacionado con la vía PD-L1 y el KOA^13,14,15.

Actualmente, los tratamientos disponibles para el KOA incluyen el control de peso, el ejercicio, la medicación y la cirugía, que suelen incluir inyecciones intraarticulares, medicamentos analgésicos, cirugía artroscópica y osteotomía periprotésica de rodilla¹⁶. En la actualidad, la progresión de la enfermedad por KOA no se puede detener o revertir por completo, y sin una comprensión clara de los complejos mecanismos que subyacen al dolor por KOA, los pacientes con KOA corren el riesgo de sufrir un uso excesivo de medicamentos analgésicos y una alta incidencia de efectos secundarios⁸. La mayoría de las estrategias de tratamiento son efectivas solo por períodos cortos y se centran solo en el alivio temporal de los síntomas en lugar de en la patogénesis de la enfermedad. Por lo tanto, el dolor con KOA sigue siendo una prioridad y un reto para el tratamiento, lo que supone un grave reto clínico. Sin embargo, Tuina puede estimular directamente los músculos esqueléticos alrededor de la articulación afectada en el tratamiento con KOA y puede proporcionar algunos beneficios. Combinado con la descripción anterior, es la terapia ideal para estudiar el papel del tejido muscular esquelético en la KOA, y aclarar el papel del tejido muscular esquelético en la inflamación también puede proporcionar un mejor apoyo teórico para Tuina de KOA.

Los estudios han demostrado que la terapia de masaje, la terapia de manipulación osteopática y la manipulación espinal pueden ayudar a aliviar el dolor y restaurar la función corporal^17,18. Estas manipulaciones pueden actuar sobre la inflamación local y aliviar los espasmos y la analgesia a través de la acción mecánica externa. Pueden aliviar el dolor después de la artroplastia total de rodilla, reducir el uso de analgésicos, promover la recuperación postoperatoria y mejorar el equilibrio biomecánico¹⁹. El masaje sueco es factible en el tratamiento de la artrosis y puede reducir el estrés y mejorar la calidad de vida²⁰. El efecto terapéutico de Tuina sobre el KOA ha sido precedido por ciertos estudios.

En este experimento, nuestro equipo explorará si la expresión de PD-L1 y los factores inflamatorios relacionados en el músculo esquelético pueden inducir KOA y promover su desarrollo basado en el modelo KOA inducido por MIA en ratas. También se implementará Tuina para ver si puede aliviar los síntomas de KOA causados por el aumento de la expresión del factor inflamatorio. Tuina se combinará con la inhibición de PD-L1 para demostrar la asociación entre la vía PD-1 mediada por Tuina en la inflamación del músculo esquelético que afecta el desarrollo de KOA y el dolor, sentando las bases para futuros estudios multinivel sobre los mecanismos terapéuticos de la intervención de Tuina en KOA.

En resumen, este artículo describe la investigación y elaboración de los mecanismos de inflamación del músculo esquelético en el desarrollo de KOA y su dolor, así como los efectos terapéuticos de Tuina sobre KOA, desde la perspectiva de la expresión del factor inmunoinflamatorio, combinado con indicadores relacionados con el comportamiento, para proporcionar evidencia de investigación moderna para la teoría del "desequilibrio del tendón y el hueso" en la medicina tradicional china.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados y supervisados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái (número de aprobación: SYXK2018-0040), que se ajusta a las estipulaciones de la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial.

1. Preparación animal

1. Aloje 32 ratas macho Sprague Dawley (SD) de 8 semanas de edad y con un peso de 180-220 g en un aparato de alojamiento específico libre de patógenos bajo ciclos de 12 h de luz/12 h de oscuridad a 24 ± 2 °C y 60% de humedad con una dieta estándar de pellets para roedores. Todas las operaciones experimentales en animales cumplen con la ética del bienestar de los animales de experimentación y las normas de seguridad de los animales de experimentación.
2. Aleatorizar y enjaular ratas en cuatro grupos de ocho animales cada uno después de 1 semana de alimentación adaptativa: antiPD-L1+Tuina (grupo A), modelo (grupo B), Tuina (grupo C) y cirugía simulada (grupo D).

2. Inyección intraarticular de yodoacetato monosódico (MIA) en la rodilla

NOTA: A excepción del grupo D, el modelo de rata KOA se preparará mediante la inyección de MIA en la cavidad articular de la rodilla en todos los grupos. Para el grupo D, inyectar 25 μL de solución salina fisiológica estéril en la cavidad articular de la rodilla derecha.

1. Anestesiar a la rata colocándola en una jaula anestésica y luego introduciendo isoflurano al 2,5% hasta que esté completamente anestesiada. Confirme que el animal está completamente anestesiado esperando el momento en que la rata joven esté acostada boca arriba, sus extremidades dejen de moverse y no haya respuesta en el pellizco de los dedos del pie (reflejo pedal), el reflejo palpebral y la relajación muscular.
2. Agregue ungüento para los ojos de mascotas y gotas para los ojos a las ratas jóvenes anestesiadas para prevenir la sequedad ocular.
3. Afeitar la extremidad trasera derecha de las ratas y desinfectar la articulación de la rodilla con tres rondas alternas de yodóforo y etanol al 75%.
4. Para mantener una condición experimental estandarizada, fije cuidadosamente la flexión de la rodilla en un ángulo preciso de 90°, asegurándose de que el ligamento rotuliano esté orientado hacia arriba. Posteriormente, inyectar 25 μL de solución de MIA, consistente en 4 mg de MIA diluidos en 25 μL de solución salina estéril en la cavidad de la articulación de la rodilla derecha de las ratas.
   NOTA: Esta inyección se realizó con un microinyector especializado, garantizando precisión y consistencia en el procedimiento^21,22,23. Vuelve a poner a las ratas en las jaulas hasta que se despierten. El animal que ha sido sometido a cirugía no se devuelve a la compañía de otros animales hasta que se recupera por completo.
5. Al final del estudio, se aplicó la eutanasia a las ratas inyectando pentobarbital sódico al 1% en una dosis de 100 mg/kg.

3. Implementación de Tuina

NOTA: La implementación de Tuina se guiará por la teoría de que "para los pacientes con desequilibrio tendinoso y óseo, los tendones deben tratarse primero". Tanto el grupo A como el B iniciaron la intervención el primer día después de la evaluación exitosa del modelo, y ambos grupos fueron operados una vez al día durante 14 días. Los dos grupos restantes solo fueron observados durante 14 días sin ninguna intervención. Los operadores de la manipulación deben estar estrictamente entrenados antes del experimento para garantizar la consistencia de la fuerza, la frecuencia y el ritmo.

1. Localice con precisión el punto de acupuntura de ratas, incluidos EX-LE4, ST35, SP10, ST34, SP9 y GB34 (Figura 1 y Tabla 1), donde se llevarán a cabo los métodos de amasamiento con los dedos mediante el uso de la acupuntura experimental²⁴.
2. Fije la rata en posición prona en el equipo de fijación de ratas.
3. Una vez que esté tranquilo y las extremidades inferiores estén relajadas, amasar el EX-LE4 y el ST35 de la extremidad afectada con el pulgar y el índice simultáneamente durante 4 min a 120-140 veces/min.
4. Amasar los músculos anterior y medial-lateral de la extremidad afectada con el pulgar y el índice durante 3 minutos a 120-140 veces/min, centrándose en el SP10, ST34 y los músculos cercanos a la articulación de la rodilla. Enfatiza la manipulación de esos músculos rígidos con una intensidad para que la rata no luche.
5. Amasar los músculos posteriores de la pantorrilla de la extremidad afectada de arriba a abajo durante 3 minutos a 120-140 veces/min usando el pulgar, el índice y el dedo medio. Para exponer completamente el área de tratamiento, use el dedo anular y el meñique para sostener la articulación del tobillo de la extremidad afectada y tirar suavemente de la extremidad afectada. Concéntrese en SP9, GB34 y los músculos cerca de la articulación de la rodilla con énfasis en los músculos rígidos y la intensidad para que la rata no tenga problemas.

4. Medición del índice de comportamiento

1. Medición del umbral de dolor mecánico plantar
   NOTA: Mida los umbrales de dolor mecánico plantar 1 día antes de la inyección de MIA, así como 2, 9 y 16 días después de la inyección.
   1. Lleve a las ratas a una sala de pruebas plantar con un fondo de rejilla de acero inoxidable y un cuerpo de jaula de plástico en un ambiente tranquilo a temperatura ambiente (22 ± 2) °C durante 30 minutos de adaptación.
   2. Utilice un probador de dolor mecánico electrónico con una aguja de prueba de plástico de 0,8 mm de diámetro para estimular verticalmente el área central de la pata trasera derecha de las ratas. Aumente de manera uniforme y gradual la intensidad de la estimulación hasta que las ratas muestren reacciones de retracción y evitación de las patas.
   3. Registre la lectura de la pantalla electrónica como el umbral de dolor mecánico del pie plantar derecho de la rata.
   4. Mida cada rata 5 veces a intervalos de 5 minutos.
   5. Elimine los valores máximo y mínimo de los cinco valores. Tome como resultado el valor promedio de los tres valores centrales a través del método de la media recortada (Tabla 2).
2. Medición del umbral de retirada mecánica de la pata
   NOTA: Mida el umbral de retiro mecánico de la pata 1 día antes de la inyección de MIA, 2, 9 y 16 días después de la inyección.
   1. Lleve a las ratas a una sala de pruebas plantar climatizada con un fondo de vidrio a 30 °C y un cuerpo de jaula de plástico en un ambiente tranquilo a temperatura ambiente (22 ± 2) °C durante 30 minutos de adaptación.
   2. Estimular el área central plantar posterior derecha con un dispositivo de calentamiento de fuente de luz a una temperatura de estimulación de 65 °C hasta que la rata muestre una respuesta de retracción y evitación de la pata.
   3. Registre la lectura del tiempo de la pantalla electrónica como el umbral de dolor térmico plantar derecho de la rata.
   4. Mida cada rata 5 veces de forma continua a intervalos de 5 minutos.
   5. Elimine los valores máximo y mínimo de los cinco valores. Tome como resultado el valor promedio de los tres valores centrales a través del método de la media recortada (Tabla 3).

5. Medición de la hinchazón de la articulación de la rodilla derecha

NOTA: Mida la hinchazón de la articulación de la rodilla derecha de las ratas 1 día antes de la inyección de MIA, 2, 9 y 16 días después de la inyección.

1. Anestesiar a la rata colocándola en una jaula anestésica y exponiéndola a isoflurano al 2,5% hasta que esté completamente anestesiada.
2. Coloque la rata en una posición plana sobre la mesa de operaciones.
3. Mida el ancho de la articulación de la rodilla derecha con pinzas vernier (Figura 2 y Tabla 4).

6. Medición de la puntuación de Lequesne MG

NOTA: Mida la puntuación de Lequesne MG en ratas a los 2, 9 y 16 días después de la inyección de MIA. Lequesne et al desarrollaron un índice de gravedad de la osteoartritis de cadera (ISH, por sus siglas en inglés), que se puede utilizar para evaluar la eficacia de las intervenciones terapéuticas. Consideramos cuatro parámetros: estimulación del dolor, cambio de marcha, movilidad articular e hinchazón articular.

1. Lleve a las ratas a una plataforma de manipulación en un ambiente tranquilo a temperatura ambiente (22 ± 2) °C.
2. Haga que dos operadores, ciegos entre sí, midan la respuesta local de estimulación del dolor, el cambio de marcha, el movimiento de las articulaciones y la hinchazón de las articulaciones.
   1. Estimular la cara lateral de la articulación de la rodilla derecha con una aguja de plástico y puntuar en una escala de 0-3 según la respuesta. 0 sin respuesta; 3 una buena respuesta; 1 contracción de la extremidad afectada; 2 Contracción y espasmo de la extremidad afectada, acompañados de reacciones generalizadas leves, como temblores, lamidos y succión.
   2. Coloque a la rata en la mesa de operaciones y observe la marcha de sus extremidades traseras derechas. Puntúa en una escala de 0 a 3 según la respuesta. 0 sin alteración en el movimiento de la extremidad afectada, carrera normal y juego de pies fuerte; 3 la extremidad afectada no puede participar en la marcha, tocar el suelo o pisar el suelo; 1 trekking suave durante la carrera con pisadas fuertes; 2 La extremidad afectada participa en la marcha, pero la perturbación en el movimiento de las ratas (trekking) es evidente.
   3. Flexiona y extiende la articulación de la rodilla derecha de la rata con la mano y observa la movilidad articular. Puntúa en una escala de 0 a 3 según la respuesta. 0 ángulo de movilidad articular de más de 90°; 3 ángulo de movilidad articular inferior a 15°; 1 ángulo de movilidad articular o 45°-90°; 2 ángulos de movilidad articular de 15°-45°.
   4. Toca la articulación de la rodilla derecha de la rata y compara la respuesta con la de una rata normal. Puntúa en una escala de 0 a 2 según la respuesta. 0 sin hinchazón evidente ni marcas óseas visibles; 2 hinchazón marcada y sin marcas óseas; 1 Hinchazón leve y marcas óseas superficiales.
   5. Sume estas puntuaciones para obtener la puntuación de Lequesne MG para cada rata y calcule el valor promedio a través del método recortado (Tabla 5).

7. Medición de la temperatura de la piel

NOTA: Mida la temperatura de la piel 1 día antes de la inyección de MIA y 9 y 16 días después de la inyección.

1. Anestesiar a la rata colocándola en una jaula anestésica y luego introduciendo isoflurano hasta que esté completamente anestesiada.
2. Coloque la rata en posición lateral sobre la mesa de operaciones, a temperatura ambiente (22 ± 2) °C.
3. Endereza la articulación de la rodilla derecha agarrando suavemente el pie con la mano. Fotografía para determinar la temperatura de la piel utilizando una cámara infrarroja Filr.
4. Lea la temperatura de la piel de la articulación de la rodilla y alrededor de la articulación de la rodilla de la rata utilizando un software de edición de apoyo. Establezca puntos de control en la articulación del tobillo y la articulación de la rodilla, donde la temperatura disminuye gradualmente.

8. Análisis estadístico

1. Utilizar software estadístico para expresar los datos experimentales en cuartiles.
2. Utilice el método de la media de recorte para tratar los valores atípicos. Los resultados de las pruebas conductuales se anotan como la media ± el error estándar de la media.
3. Realizar una prueba t de muestras independientes para la comparación entre grupos. Analice los datos de comportamiento utilizando un análisis de varianza de medidas repetidas (ANOVA) de dos vías, seguido de las pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. Cuando los datos no muestren normalidad u homocedasticidad, realizar una prueba no paramétrica (muestras k de Kruskal-Wallis).
   NOTA: P < 0,05 indica que las diferencias son estadísticamente significativas. Todos los datos cumplen con los supuestos de las pruebas estadísticas que se aplican.

Resultados

El protocolo descrito se implementó en un entorno clínico en el Hospital Integrado de Medicina Tradicional China y Occidental de Yueyang. La Figura 1 muestra la ubicación exacta de los puntos de acupuntura en ratas, y la Tabla 1 ilustra los beneficios comunes de estimular estos puntos. La Tabla 2 y la Tabla 3 ofrecen evidencia convincente de un alivio notable del dolor logrado a través de la terapia con Tuina, incluso en ausencia de inhi...

Discusión

Este estudio tiene como objetivo evaluar la mejoría de la KOA después de la intervención de Tuina mediante el uso de indicadores conductuales estandarizados e investigar los mecanismos de Tuina para la KOA y la asociación entre el músculo esquelético y la KOA. A diferencia de las terapias farmacológicas y quirúrgicas, Tuina tiene un efecto regulador positivo sobre los sistemas motor, inmunológico y endocrino. Tuina puede aliviar la inflamación y el dolor producidos por la enfermedad actuando sobre diferentes ob...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-PD-L1	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab80276
electric von Frey esthesiometer	IITC/Life Science, Woodland Hills, CA, USA	ALMEMO 2450
GraphPad Prism 9.0	GraphPad Software		Software for stastistical analysis
monosodium iodoacetate	Sigma-Aldrich Inc	I9148	Resolved into normal saline for injection
pentasorbital sodium	Sigma-Aldrich Inc	P3761
Sprague Dawley (SD) male rats	Shanghai Jihui Experimental Animal Breeding Co., Ltd	No. SCXK (Hu) 2017-0012
thermal analgesia tester	IITC/Life Science	Model 390